Este trabalho foi financiado por fundos de sementes da Universidade de Pittsburgh e conceder NIH AG028977 para ALF

Visão global Worms tradicionalmente transgênicos foram gerados por microinjecting DNA transgene no C. elegans germline 1,2,3,4. Embora bem-sucedida, esta abordagem necessários equipamentos especializados eo desenvolvimento de experiência com a anatomia verme e da técnica de microinjeção. Mais recentemente bombardeio biobalística foi desenvolvido como uma abordagem alternativa que usa partículas de DNA revestido de ouro para introduzir DNA estranho no 5,6 germinativas. Essa abordagem requer menos investimento de tempo em termos de prática para se tornar bem sucedido. O bombardeio de biobalística C. elegans para gerar worms transgênico tem baixa eficiência ao nível do worm individuais para o sucesso requer uma grande quantidade de animais. Estes podem ser cultivadas em várias maneiras, mas nós usamos placas de ovos para reduzir o trabalho eo número de placas envolvidas. Nosso protocolo começa com a preparação de placas de ovos e vermes e, em seguida, centra-se no protocolo de bombardeamento utilizando o Bio-Rad PDS-1000/He Sistema Hepta. Nós adaptamos nosso protocolo, em parte, obra de Berezikov et al 7. Com o bombardeio, o gene unc-119 é normalmente usado como um marcador para animais transgênicos. Worm cepas carregando essa mutação são severamente descoordenado e pouco movimento, são dumpy na aparência, e são incapazes de formar Dauer larvas 8. A Dauer é uma fase larval alternativo que é usado para retardar o desenvolvimento de um adulto reprodutivo em condições adversas, ea entrada em Dauer é regulada por múltiplos genes 9. Várias linhagens com o gene unc-119 estão disponíveis no C. elegans Genetics Center (CGC, Minneapolis, MN). A cepa DP38 original (unc-119 (ED3)) também traz uma formação constitutiva Dauer-independentes (daf-c) mutação que poderia afetar experimentos a jusante. Vários laboratórios têm outcrossed esta mutação, ea tensão HT1593 está disponível a partir da CGC. Descobrimos que os animais transgênicos são um pouco mais fácil de identificar com a cepa DP38 e tendem a utilizar esta cepa para a criação de animais transgênicos. Quando necessário, usamos HT1593 para outcross os vermes transgênicos para remover a mutação daf-c. Obtendo o DP38 worms para crescer é um dos passos mais lentos no protocolo para que manter um estoque de placas de crescimento durante a preparação do transgenes. Expressão do marcador unc-119 junto com o gene de interesse permite a fácil identificação dos animais expressando o transgene com base no resgate da motilidade normal e tamanho do corpo 5. O gene unc-119 pode ser obtido de diversas fontes, e vetores utilizando o DNA genômico unc-119, unc-119 promotor e cDNA e DNA genômico para o menor C. briggsiae gene são utilizados 8,10. Recentemente, descreveu um protocolo simples para adicionar um cassete unc-119 a qualquer plasmídeo contendo um gene de resistência a ampicilina por recombinação homóloga 11 e um método para modificar fosmids worm para transportar o gene unc-119 por Cre-lox recombinação para gerar animais transgênicos 12. Os plasmídeos estão disponíveis a partir Addgene Inc. (Cambridge, MA). Enquanto o esforço envolvido na realização de um bombardeio único é significativo, mas controlável, o trabalho adicional envolvido na realização de bombardeios múltiplas em um único dia é mínima. Consequentemente, nós rotineiramente agrupar a produção de transgênicos worms para diminuir o trabalho envolvido na geração de cada um. 1. Ovo Preparação Placa Os vermes unc-119 mutantes são difíceis de crescer em placas NGM padrão, pois com sua mobilidade prejudicada eles tendem a morrer de fome em partes de um prato, enquanto outras partes da placa ainda contêm alimentos. Placas de ovos resolver este problema como a camada espessa de alimentos em pratos de ovos permite unc-119 vermes a rastejar mais facilmente e para assumir todas as placas do 7. As placas de ovos também têm a vantagem de suportar o crescimento de um grande número de worms para placas que são necessários menos 13. Geralmente 5 placas de ovo são suficientes para crescer worms para um bombardeio. A receita abaixo faz cerca de 50 pratos, mas pode ser reduzido pela metade para fazer menos, se desejar. As placas de ovos pode tornar-se facilmente contaminada por isso usamos os antibióticos e antifúngicos nas placas e só usar ovos gerados pelo tratamento de hipoclorito para semear as placas. Dia 1: <ol><li> Prepare LB (400 mL) em um frasco de 500ml. Autoclave por 20min. </li><li> Despeje ~ 50 centímetros 10 placas NGA usando um litro NGA com agar 2%. Nós adicionamos 10 mL nistatina por litro e estreptomicina a 200 mcg / mL 13. </li><li> Crescer uma cultura de 40 ml durante a noite de OP50-1 em LB com 200 estreptomicina mcg / mL. Esta estirpe é resistente à estreptomicina e disponível a partir de CGC. </li><li> Autoclave uma garrafa de 500mL dedia seguinte. </li></ol> Dia 2: <ol><li> Separe as gemas de 10 ovos de galinha para o frasco estéril. Usamos um separador de gema (disponível em lojas da família, incluindo Target). Shake. </li><li> Traga volume para 400mL com LB. Agitar </li><li> Incubar a 60 ° C por 1 hora. </li><li> Arrefecer à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 40mL de OP50-1. Agitar </li><li> Distribuir 5-8 mL de mistura por placa. </li><li> Permitir que as placas para resolver em temperatura ambiente durante a noite. </li></ol> Dia 3: <ol><li> Gentilmente despeje o líquido restante das placas. Deixe secar com tampas em temperatura ambiente durante a noite. </li></ol> Dia 4: <ol><li> Colocar placas em uma caixa ou saco plástico e armazenar a 4 ° C até ser necessário. Essas placas parecem ser OK para usar por 1-2 meses. </li></ol> 2. Semeadura Placas Egg <ol><li> Expandir o DP38 worms em 6 centímetros placas NGA adicionando OP50 concentrado para placas recentemente fome. Para um único bombardeio, usamos ~ 6 pratos pequenos para placas de semente cinco ovos. Para vários bombardeios, usamos as placas menores ao invés de sementes enriquecidas 2 placas de peptona antes da semeadura as placas de ovo. </li><li> Isolar os ovos do DP38 worms através do uso de hipoclorito de 13,14. Ressuspender os ovos estéreis em buffers S-basal ou M9 13,14. </li><li> Adicione os ovos (&gt; 10 mil por placa) para o número apropriado de placas de ovo. Crescem os vermes em pratos de ovos a 20 ° C por 7-10 dias para uso de bombardeio. As placas estarão prontos para usar uma vez que os vermes começaram a limpar a comida do prato. Essas placas são realmente difíceis de morrer de fome e crescente por períodos mais longos irá melhorar o rendimento worm. </li></ol> Bombardeamento Nós preparamos o estoque de ouro antes do tempo e mantê-lo conservado a 4 ° C para o uso. Também são necessários imaculado e viu 10 placas NGA centímetros. As placas sem mancha precisa ser derramado com bastante antecedência e permitiu a secar completamente para facilitar a absorção do líquido adicionado com os vermes. No dia do bombardeio, que lave os vermes primeiro e depois começar a preparar o DNA revestido por partículas de ouro. Em seguida, adicione os vermes para as placas NGA imaculada e terminar de lavar as partículas de ouro e transferi-las para o macrocarriers. Preparação de partículas de ouro: <ol><li> Pesar 60 mg de partículas de ouro em um tubo de 1.7mL e mergulhar em etanol 70% por 15min. Girar rapidamente a se precipitar as partículas de ouro. </li><li> Lavar 3 vezes em água estéril e girar rapidamente a cada vez para coletar o ouro. </li><li> Ressuspender o ouro em 1mL de glicerol 50% estéril. Esta é a solução de reserva de partículas de ouro e pode ser armazenado durante meses a 4 ° C. </li></ol> Worms: <ol><li> Flutuar o DP38 worms fora do prato de ovos com tampão de S-basal ou M9 e transferi-los para um tubo de 50 ml cônico. </li><li> Manter os tubos no banco até que os vermes estão na parte inferior. Em seguida, aspire o buffer e adicionar novos S-basal ou M9. Lave 2 ou 3 vezes, até encher o buffer é relativamente livre de detritos. Manter os worms nesta etapa até que o revestimento DNA está concluída. </li><li> Aspirar e deixar cerca de 2-3 mL de vermes em tampão por bombardeio. Transfira para uma placa de 10 centímetros NGA imaculada no gelo. É importante minimizar o volume transferido como a placa NGA será necessário secar completamente antes de bombardeio. Certifique-se de cobrir toda a superfície da placa com os vermes. </li><li> Permitir que a placa para secar no gelo. O gelo irá evitar os vermes se aglomerem durante a secagem. </li></ol> Este passo é importante: a placa deve estar seca e as minhocas uniformemente dispersas na placa NGA. Mantendo o worms no gelo impede de mover-se sobre a placa e agregando em pilhas. DNA de preparação (por um bombardeio): <ol><li> Misture em um tubo de 1.7mL: <ul><li> 50μl partículas de ouro. Ressuspender completamente antes de adicionar. </li><li> 50μl de DNA (10-15ug). Vemos pouca diferença entre DNA circular ou linear. Normalmente usamos cartuchos Qiagen midiprep para a purificação de DNA (Qiagen Inc., Valencia, CA). </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. Esta solução é estável por várias semanas em temperatura ambiente. </li><li> 20μl espermidina 0,1 M. A espermidina é instável em solução aquosa. Fazemos alíquotas espermidina 70μl e armazenar a -20 ° C. Em seguida, adicionar 1 ml de água bem antes de usar para obter uma solução 0,1 M. Esta solução deve ser renovada a cada bombardeio. Nós geralmente vortex as partículas de ouro em um tubo 1.7mL a uma velocidade baixa e adicione o CaCl 2, DNA e espermidina / gotas de protamina, enquanto vórtex. Para as pessoas que têm transfectadas com fosfato de cálcio esta técnica é familiar. Temos também utilizado protamina em vez de espermidina com muito bons resultados 15. Nós preparamos uma nova solução (1mg/ml) em água e nose 50μl em vez do 20μl de espermidina. Se usarmos de protamina, que geralmente incubar a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos em vez de colocar no gelo. Protamina não precisam ser mantidos congelados e é um pó em vez de um líquido. </li></ul></li><li> Incubar a mistura em gelo por 30min, e periodicamente mix para manter as partículas de ouro em suspensão. Em seguida, girar rapidamente e aspirar o sobrenadante. </li><li> Lavar com etanol 300 ul de 70%. Girar por alguns instantes. </li><li> Lavar com etanol a 100% 1mL. Girar por alguns instantes. </li><li> Ressuspender em 170μl de etanol 100%. </li></ol> Preparação de macrocarriers: <ol><li> Enxágüe 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), em 2-propanol. Coloque-os sobre papel absorvente e deixe-os secar em temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 20μl de DNA / ouro mistura no centro de cada macrocarrier. Certifique-se de direito vortex antes de pipetar para manter o ouro em suspensão. </li><li> Deixe o álcool evaporar. </li></ol> 3. Bombardeamento Certifique-se de realizar um bombardeio em branco antes do experimento para lavar hélio através do sistema. <ol><li> Ligue a bomba de vácuo e trap bomba perto de vácuo. Nós usamos uma bomba de vácuo oil-free. </li><li> Ligue tanque de hélio. Verifique que a pressão é ≥ 2200psi. </li><li> Disco de ruptura Wet (1350 psi) em 2-propanol, colocando na retenção de tampa para hepta adaptador. </li><li> Parafuso adaptador no PDS-1000 do sistema e aperte com a chave de torque fornecido. </li><li> Coloque o 7 macrocarriers no suporte e encaixá-los com a ferramenta fornecida. Em seguida, coloque uma tela de parar hepta e no fundo para o titular. Virar o suporte e coloque na segunda prateleira de cima. O ouro manchado lado do macrocarriers deve estar voltado para baixo neste momento. </li><li> Alinhe os orifícios no topo do titular macrocarrier com as saídas do adaptador hepta. </li><li> Coloque a placa NGA revestido com worms (off tampa) na prateleira mais baixa na câmara de bombardeio. </li><li> Abra completamente a vácuo botão vazão no PDS-1000. Pressione o botão até vac câmara atinge 26 Em Hg. Em seguida, mudar para manter a posição de manter o vácuo. </li><li> Pressione e segure o botão de tiro até rupturas disco. Isso acontecerá quando a pressão chega a 1350psi. Às vezes, isso leva 50-20 segundos para ocorrer. Solte o botão. </li><li> Lançamento da câmara de vácuo (posição de ventilação), e remover placa. </li><li> Por sua vez vácuo e off hélio. </li><li> Fogo várias vezes até que a linha não contém hélio (medidor de hélio deve marcar 0 psi). </li><li> Desligue o sistema PDS-1000. </li></ol> Worm recuperação depois do bombardeamento: <ol><li> Deixe a placa bombardeado a 20 ° C por 20 minutos. </li><li> Float os vermes da placa com 10 mL de tampão S-basal ou M9. </li><li> Coloque worms 0,5 ml em 20 - 10 cm placas NGA manchado. </li><li> Deixe a 20 ° C de temperatura ou quarto (22-24 ° C) por cerca de duas semanas antes de verificar para worms resgatados. </li><li> Tela para worms com o fenótipo unc-119 (+) com um microscópio de dissecação. O tempo ideal para a triagem é após as placas de ter passado fome desde o worms resgatados ter vantagem de sobrevivência sobre os não-resgatada worms. </li><li> Gerar uma linha individual de cada placa de 10 cm que continha worms resgatados. </li></ol> 4. Resultados representante O sucesso do protocolo no que diz respeito à obtenção de animais transgênicos depende do transgene particular. Para promotor: transgenes repórter GFP obtivemos até 20 linhas. Um resultado mais comum é 30-10 linhas. Até 30% das linhagens transgênicas são linhas integradas, mas esta é aleatória e vamos realizar bombardeios múltiplas em um único dia, se uma linha integrada é particularmente desejado.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Bombardeio biobalística é um método simples para introduzir DNA estranho para muitos organismos, incluindo C. elegans 1,5,6,7,16. Ele se baseia partículas de ouro formando um complexo com o DNA na presença de CaCl 2. Poliaminas catiônicas, tais como a espermidina, proteger o DNA de nuclease degradação in vivo. Desde espermidina é uma molécula instável, é importante para armazená-lo em pequenas alíquotas a -20 ° C, e fazer a solução certa antes de realizar o bombardeio. Com...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

O número de laboratórios usando o C. nematóide de vida livre elegans está crescendo rapidamente. A popularidade deste modelo biológico é atribuído a um tempo de geração rápido e vida curta, manutenção fácil e barata, o genoma completamente seqüenciado, e matriz de RNAi recursos e animais mutantes. Além disso, a análise do C. elegans genoma revelou uma grande semelhança entre worms e vertebrados superiores, o que sugere que a pesquisa em vermes pode ser um complemento importante para os estudos realizados em ratos inteiros ou células em cultura. Uma parte poderosa e importante de pesquisa worm é a capacidade de usar animais transgênicos para estudar a localização ea função do gene. Animais transgênicos podem ser criadas através de microinjeção da linha germinativa worm ou através do uso de bombardeio biobalística. Bombardeio é uma nova técnica e é menos familiar para uma série de laboratórios. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para gerar worms transgênicas por biobalística bombardeio com partículas de ouro usando o Bio-Rad PDS-1000 do sistema. Em comparação com a microinjeção de DNA em células germinativas hermafroditas, este protocolo tem a vantagem de não exigir habilidades especiais do operador com relação à identificação de anatomia worm ou realizar microinjeção. Além disso várias linhagens transgênicas são normalmente obtidos a partir de um único bombardeio. Também em contraste com a microinjeção, bombardeio biobalística produz animais transgênicos com ambos os arrays e extracromossómicos transgenes integrados. A capacidade de obter linhagens transgênicas integrada pode evitar o uso de protocolos mutagênico para integrar DNA estranho. Em conclusão, o bombardeio biobalística pode ser um método atrativo para a geração de animais transgênicos, especialmente para os pesquisadores não estão interessados ​​em investir o tempo eo esforço necessário para se tornar hábil em microinjeção.

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Worms transgênicos são comumente usados ​​em<em&gt; C. elegans</em&gt; Pesquisa. Descrito é um protocolo simples, mas eficaz, para introduzir transgenes em vermes usando biobalística bombardeio com partículas de DNA revestido de ouro. O esforço envolvido e os resultados do bombardeio comparam favoravelmente com microinjeção para a geração de animais transgênicos.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K visualizações.  University of Pittsburgh. Worms transgênicos são comumente usados ​​em C. elegans Pesquisa. Descrito é um protocolo simples, mas eficaz, para introduzir transgenes em vermes usando biobalística bombardeio com partículas de DNA revestido de ouro. O esforço envolvido e os resultados do bombardeio comparam favoravelmente com microinjeção para a geração de animais transgênicos.

Vídeo: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Geração de RNA / DNA híbrido em DNA genômico por transformação por meio de RNA contendo Oligonucleotídeos

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

A cultura<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; Em Axenic Liquid Media e Criação de transgênicos Worms por bombardeamento com micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.