The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

Declaração de Ética: Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo envolvem a trabalhar exclusivamente com Drosophila melanogaster e não estão sujeitas às leis de protecção dos animais na Alemanha. 1. preparação de meios, ferramentas e Moscas <ol><li> Prepare modificado em pó meio de crescimento M3 disponível comercialmente, sem bicarbonato de potássio 17. CUIDADO: Irritante para os olhos e pele. Suplementar o meio com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina. Use soro fetal bovino inseto-cultura-testado inativado pelo calor e para obter melhores resultados. Filtra-se o meio completo (referido daqui em diante como forma) por meio de uma unidade de filtro de garrafa superior a 0,2 ^ m e no armazenamento de alíquotas a -20 ° C. Antes da sua utilização, o filtro (0,2 um filtro de seringa de ponta) do meio de novo para remover os precipitados. </li><li> Preparar soluções de inibidor para os ensaios farmacológicos. Dissolve os produtos químicos no solvente apropriado e armazenar-se em aliquotas. Por exemplo, preparar uma solução estoque de ácido anacárdico 28,69 mM (CUIDADO: Irritante para os olhos e pele) em dimetilsulfóxido. </li><li> Preparar as ferramentas para o rompimento dos testículos pupas dissecadas e dissecção de cistos simples. Use duas agulhas afiadas e duras, em vez de um par de fórceps. A força capilar que se desenvolve entre os dois braços de um par de fórceps faz a dissecação de cistos simples em pequenas quantidades de meio muito difícil. Por exemplo, utilizar a ponta de um pino de insectos aço inoxidável inserido num suporte de ansa de inoculação. </li><li> A fim de obter pupas apropriadamente idade, cerca de 10 sementes de frascos de cultura grandes (tubos com 4 cm de diâmetro) com um número suficiente de moscas adultas (cerca de 40-60 moscas). Para analisar o switch HP, use moscas expressando H2AvD-RFP e ProtamineB-EGFP em seu padrão endógeno 12,16,22. Incubar os frascos, sob condições normais, a 25; ° C por cerca de 4-5 dias até o terceiro instar as larvas rastreamento e começar pupation nas paredes dos frascos 25. </li></ol> 2 Marcação ou Coleta Branco Pré-pupas obter 24 horas de idade, pupas para Dissecção <ol><li> Para testar a influência de certas substâncias químicas no switch HP, dissecar testículos pupa em cerca de 24 horas APF 12. Para obter pupas encenado, tomar as preparados frascos de cultura voar com pupating larvas (ver secção 1.4) e identificar como muitos brancos pré-pupas possível. Pré-pupas durante a primeira etapa em pupation aparecer como imóvel, não-alimentação, as larvas em vez encurtado com spiracles evertidas e pupário de cor branca. O pupário torna-se tan-marrom dentro de 30 a 60 min, o que indica o próximo estágio de desenvolvimento das pupas 26. </li><li> Marcam as posições de pré-pupas com um marcador permanente no lado de fora dos frascos. Incubar os tubos a 25 ° C durante cerca de 24 horas. <ol><li> Alternativamente,escolher o pré-pupas do lado dos frascos com uma pequena escova humedecido com tampão PBS. Em seguida, transferir o pré-pupas para o lado de um tubo de reacção de 50 mL fresco e incuba-se a 25 ° C durante cerca de 24 horas. </li></ol></li></ol> 3. Dissecção da Pupal Testes em cerca de 24 horas após a formação pupário <ol><li> Distribuir várias gotas (cerca de 80 ul cada) de meio de cultura de células em um de plástico 10 cm ou numa caixa de Petri. Usando uma ampla par de fórceps ou um pincel embebido em média, escolher as pupas na fase APF 24 horas dos frascos incubados (ver secção 2). Transferir uma pupa de cada gota de meio no prato. </li><li> Para a dissecção, usar um microscópio estéreo equipado com um iluminador de fibra óptica. Não aquecer os testículos acima RT durante a dissecção, pois isso pode impedir o bom desenvolvimento da cultura. <ol><li> Dissecar pupas com dois pares de n º 5 fórceps. Com um par, agarrar a pupa, na sua mais posteriorparte (dos espiráculos posteriores) e mantê-lo na posição. </li><li> Pegue os espiráculos anteriores com o outro par de fórceps e abrir o opérculo de pupa em sua extremidade anterior. Retire o caso de pupas, até, pelo menos, parte do tórax está exposta. </li><li> Continue pressionando a pupa na posição pelo seu fim mais posterior. Para liberar a pressão interna da pupa, insira os dois braços de um par de fórceps para a região da cabeça da pupa. </li><li> Rasgar a pupa aberto abrindo as pinças e mover a pinça na direcção anterior. Assegure-se que a abertura gerado com este movimento é tão grande quanto possível na primeira tentativa. Evite danificar a pupa em sua extremidade posterior antes que a pressão foi liberada, pois isso pode resultar nos testículos sendo empurrado diretamente através da pequena abertura e na maioria das vezes ser interrompido. </li><li> Observe que uma vez que a pupa é aberta, a pressão interna lançado da pupa pressiona a aglomerados de células de gordura corporal e do tecido através do laabertura rge na região da cabeça. Verifique se os testículos pupa já foram empurrados para fora da pupa com este material; isto ocorre em alguns casos. Os testículos não estão ligados a qualquer outro tecido em 24 horas APF e, portanto, pode ser expulso facilmente da pupa 23. </li><li> Evite apertar a pupa com a pinça, pois isso pode danificar os testículos se eles permanecem na pupa. Aumentar o tamanho da abertura usando um par de fórceps. </li><li> Em seguida, mantenha a pupa em sua extremidade mais posterior. Feche o outro par de pinças e expelido suavemente o conteúdo da pupa de posterior para anterior para libertar os testículos das crisálidas. </li></ol></li><li> Recolha os testículos puxando-os em um pré-corte de 200 mL ponteira. Tentar transferir apenas uma muito pequena quantidade de meio para reduzir o número de células de gordura corporal transferidos com os testículos. Coloque os testículos em média em um prato de cultura fresco. Lave os testes várias vezes com meio até que só célula do corpo poucos gorduras permanecem. </li><li> Para imagens ao vivo, transferir testículos a uma cultura prato fundo de vidro com meio e usar um microscópio de imagem invertida. Para os ensaios farmacológicos, continue com o passo 5. </li></ol> 4. Dissecção da masculinos Cistos linha germinal e Imagens ao vivo <ol><li> Transferir um ou mais testículos pupa a uma cultura prato fundo de vidro. </li><li> Use um microscópio estéreo com iluminação de fibra ótica e duas agulhas de aço inoxidável (ver secção 1.3) para a dissecção das germinativas cistos do sexo masculino. <ol><li> Com uma agulha, cuidadosamente tentar fixar para baixo um testículo na sua anterior ou posterior final. Segure-o na posição. Inserir a agulha no outro testículo e perturbar a bainha testículo, movendo a agulha lateralmente. Muitos dos cistos será libertada do testículo por este movimento. </li><li> Continue a segurar o testículo em posição com uma agulha. Gentilmente raia os cistos restantes do testículo com a outra agulha. </li><li> Cistos agregados separados tanto por gently movimento de uma agulha para o lado através do conjunto de cistos ou transferindo os cistos para um prato de cultura fresca com o meio com uma pipeta de ponta de 200 ul. </li></ol></li><li> Mova a placa de cultura a um microscópio de imagem invertida para geração de imagens ao vivo de cistos simples. Dispersar cistos novamente com uma agulha, se necessário. <ol><li> Identificar a fase dos cistos utilizando contraste de fase e microscopia de fluorescência. </li><li> Concentre-se em um cisto do estágio desejado. Confirmar foco e posição do cisto frequentemente durante as experiências de imagiologia mais longas, como os cistos não aderir ao fundo do prato de cultura e, por conseguinte, tendem a flutuar fora de foco. NOTA: O revestimento da placa com poli-L-lisina para a imobilização é prejudicial para o desenvolvimento de quistos germinativas iniciais. Em vez disso, os cistos individuais podem ser isolados. Com alguma prática, é possível isolar um quisto nomeadamente por muito suavemente empurrando-a com a agulha. Isto irá permitir a transferência dos cistos simples de culto separadoure pratos com uma pipeta de Pasteur de vidro, com uma parte saliente que se encaixa dentro do campo de visão do microscópio. Os cistos isolados, em seguida, pode ser facilmente transferida em placas de cultura, mesmo após a incubação de longo prazo. </li></ol></li></ol> 5. farmacológica Ensaio com intactas pupais Testículos <ol><li> Encher cada poço de uma placa de 24 poços de cultura de células com 500 ul de meio para uma experiência de 12 repetições. Transferência de uma pupa testículo a cada poço, usando um pré-corte de 200 mL ponteira. <ol><li> Entrada para a presença de protaminas nos testículos isolados utilizando um microscópio invertido de fluorescência. Os testículos deve ser livre de sinal ProtamineB-eGFP, que indica que o comutador HP não ocorreu em qualquer dos cistos. Substitua testículos que já apresentam cistos ProtamineB-EGFP-positivos. </li><li> Para os primeiros 12 poços, adicionar 500 mL de meio contendo composto inibidor diluído (ácido anacárdico) para alcançar a concentração final desejada(150 fiM) em 1 ml de meio por poço. Use os poços restantes como controles não tratados; adicionar 500 mL de meio com a mesma quantidade de solvente utilizado como com os compostos inibidores. Nota: se forem utilizados diversos compostos e solventes diferentes, pode ser mais eficiente ao utilizar meio sozinho como controlo e para testar a influência de aumentar as concentrações de solventes, em experiências separadas. </li></ol></li><li> Incubar a placa a 25 ° C durante 24 horas no escuro. </li><li> Verificar novamente para a presença de protaminas nos testículos incubadas como descrito acima. Os testículos de controle deve agora mostrar cistos um ou mais ProtamineB-EGFP-positivos, o que indica a transição através do switch HP. </li><li> Com uma pipeta com uma ponta de 200 mL, transferir os testículos aos slides poli-L-lisina-revestido, fazer os preparativos de squash e mancha com anticorpos fluorescentes adequadas conforme descrito em outros lugares 12,27,28. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

Os autores não têm interesses conflitantes.

O protocolo apresentado descreve duas aplicações diferentes com base tanto na capacidade para dissecar os testículos de Drosophila e cistos único de linha germinal numa determinada fase de desenvolvimento e no desenvolvimento ex vivo destas células e tecidos em uma placa de cultura. Uma aplicação é o tratamento farmacológico de processos vitais, durante o desenvolvimento do esperma. É importante ressaltar que este permite o acesso a espermatogênese pós-meiótica que não é facilmente obtido utilizando análises funcionais baseadas na genética da mosca. A outra aplicação é a observação microscópica de vida e desenvolvimento de células germinativas e testículos. Especialmente esta aplicação benefícios da capacidade de células e órgãos de Drosophila em cultura para sobreviver e desenvolver à RT e sob atmosfera normal. Assim, uma imagem de microscópio invertido equipado com um estágio de aquecimento (aquecimento até à temperatura de reprodução padrão de 25 ° C) é suficiente para se obter resultados significativos em experimentos ao vivo por imagem. Maisexistem mais, muitas cepas transgênicas mosca expressando proteínas marcadas em proteínas fluorescentes para imagens ao vivo ou pode ser facilmente estabelecida. Para obter testículos pupa ou cistos em células germinais de um estágio específico do desenvolvimento, é fundamental que se está familiarizado com o tempo de desenvolvimento da Drosophila. O momento exato para cada estágio pode variar entre laboratórios, condições de cultura e estirpes de voar e deve ser estabelecido empiricamente. Como descrito acima, isso é especialmente importante para os ensaios farmacológicos que, por exemplo, têm como alvo o switch HP. Para estes experimentos, é aconselhável sempre verificar espermatídeos com um sinal ProtamineB-eGFP antes do teste real, porque o inibidor de temporização pode variar um pouco, ainda dentro de uma população. Seguindo o protocolo acima deve habilitar o experimentador para dissecar testículos de pupa início como órgãos intactos livres do tecido adiposo anexado corpo. Estes testes e, mais ainda, isolado gecistos de linha rm são muito frágeis. Por isso, é fundamental desenvolver a destreza manual ea experiência necessária para manusear e transferência de testículos e cistos com pinças, agulhas e pipetas. Especialmente os estudos que visam o desenvolvimento de células germinativas de pós-meiótica meiose e início iria beneficiar com isso. Embora seja relativamente fácil de dissecar cistos de espermátides final com longa flagelos de testículos de adultos, é difícil a obtenção de fases anteriores. Dissecando esses cistos de testículos pupa início seguindo este protocolo é muito mais eficiente. Tenha em mente que em uma cepa mosca de costume, apenas cerca de 50% das pupas será do sexo masculino. Portanto, prepare-se para dissecar, pelo menos, o dobro pupas como o número de testes necessários. Em alternativa, é possível identificar macho larvas L3 usando um estereomicroscópio, tal como os testículos pode ser identificado como órgãos redondos translúcidas incorporados nos tecidos do corpo gordo laterais da larva intacta 23,34, e recolher em frascos de cultura fresco que podeser usado para escolher pré-pupa para o estadiamento e dissecações. Também é possível identificar macho pré-pupas 35. Percebemos que ambos os isolados em células germinais cistos e os testículos pupa intactas em cultura são sensíveis à luz, como também já foi relatado anteriormente 18. Esta sensibilidade à luz também pode segurar por alguns compostos químicos utilizados em ensaios farmacológicos. Portanto, é melhor para manter as placas de cultura de um ensaio, no escuro, durante a incubação. Da mesma forma, ao planejar experimentos com imagens de lapso de tempo com testículos em desenvolvimento e, especialmente, cistos isolados, tenha em mente que os tempos de exposição muito longos e / ou taxas de amostragem demasiado elevadas podem inibir ex vivo de desenvolvimento. A taxa de amostragem adequado deve ser determinado experimentalmente. A infecção bacteriana e / ou fúngica e um excesso de crescimento em placas de cultura representa um problema grave. Placas de cultura infectados com muitas bactérias não suportam ex vivo desenvolvimento dos testículos e cistos. Portanto, o meio de cultura descrito contém penicilina e estreptomicina (ver passo 1.1), mas durante a incubação a longo prazo, estes antibióticos podem ser degradado e pode diminuir a sua actividade. Esta poderia ser uma das razões para o pouco tempo de sobrevivência (max. 72 hr) de cistos cultivadas observados quando se utiliza o protocolo acima. No entanto, esse prazo não poderá ser prorrogado por substituição regular do meio de cultura nos pratos. Conclui-se que outros factores podem influenciar a sobrevivência em cultura, tais como a falta de sinais de crescimento de outros tecidos do trato genital. Por outro lado, o desenvolvimento pós-meiótica é mais rápido do que em Drosophila nos mamíferos. Em Drosophila, espermiogênese leva cerca de 90 horas, eo switch HP tem lugar entre 50 e 60 horas após a meiose 9,12. Assim, o tempo habitual de sobrevivência de cerca de 48 horas alcançado com este protocolo é bem adequado para acompanhar os processos de desenvolvimento cruciais na spermatogenesis, como divisões meióticas ou o switch HP. Embora a contaminação bacteriana ou fúngica pode ser evitado pelo uso de ferramentas limpas e meios de comunicação, o protocolo apresentado não faz uso das condições de trabalho estritamente estéreis porque moscas e voar testículos já contêm bactérias quando criados em condições normais. No entanto, algumas aplicações desta técnica de cultura podem se beneficiar do moscas dissecadas ou mesmo criados em condições assépticas (para protocolos, consulte 17,36,37). Os ensaios farmacológicos dependem do uso de compostos químicos que actuam como inibidores, activadores ou de várias enzimas. Os compostos comumente usados ​​em tais experiências, muitas vezes diferem muito em sua especificidade alvo. Como vantagem, este oferece o potencial para atingir as classes de enzimas inteiras, por exemplo, com ácido anacárdico p300 inibidores / CBP, PCAF e membros da família MYST de HATs 38. A desvantagem desta situação poderia ser potencial off-alvo ou efeitos citotóxicos induced por tais compostos. Portanto, cada composto utilizado em um ensaio com testículos pupa ou cistos devem ser testados quanto à sua citotoxicidade e efeito específico, em diferentes concentrações. Além disso, pequenas variações nas condições de cultura, concentração de composto ou de actividade, e as variações de permeabilidade celular pode conduzir a variabilidade dos efeitos induzidos. Portanto, é necessário controlar o êxito do tratamento em cada experiência. Por exemplo, quando foi utilizado ácido anacárdico a 150 uM, observou-se ligeira variabilidade na força do fenótipo condensação da cromatina entre e, por vezes, dentro de alguns dos testículos, ao passo que a acetilação da histona H4, foi consistentemente reduzida. Os ensaios farmacológicos com testículos de Drosophila em cultura foram utilizados para analisar os mecanismos pré e pós-meióticas da espermatogênese 4,12,14,21. Uma vez que é difícil ter acesso a espermatogênese pós-meiótica com ferramentas genéticas para atingir os jogadores com essênciafunções l pré-meióticas e meiose, esta abordagem ex vivo constitui uma alternativa. Além disso, em princípio, o método pode ser adaptado para pulse-chase experiências para seguir o desenvolvimento de células germinativas tratados ao longo do tempo. No entanto, nós ainda não testou essa possibilidade. Fazendo uso de testículos de pupa precoce é uma vantagem em ensaios farmacológicos. Em primeiro lugar, a bainha exterior fina dos jovens testículos pupa (cerca de 24 hr APF) pode permitir a permeabilidade melhorada de compostos químicos. Em segundo lugar, quando se estuda o switch HP pós-meiótica, os testículos pupas dissecadas em 24 horas APF partir da linha de fly Protamine expressando-GFP permitir uma leitura direta de saber se o interruptor HP foi afetado ou não. Até à data, vários protocolos para a cultura ex vivo de órgãos e tecidos, incluindo os testículos e os cistos de linha de germe de Drosophila têm sido desenvolvidos (por exemplo, ver 4,14,17,20,39,40). O meio de cultura e as condições gerais usadasno protocolo aqui apresentado foram estabelecidos em 1979, 17. sistema de cultura foi mais tarde adaptado para visualização in vivo do mecanismo de individualização em cistos pós-meióticas final isoladas de testículos adultos 4. Anteriormente, relataram que estas condições também apoiar a sobrevivência e diferenciação de meiose e as células germinais pós-meióticas primeiros em seus cistos por cerca de 48 horas 12. Em contraste com outros sistemas de cultura de 19 a temporização do desenvolvimento observado nestas culturas foi de aproximadamente consistente com o tempo determinado a partir de amostras fixas (para mais detalhes, ver 12). Sinais de fluorescência H2AvD-RFP e de protamina-GFP pode ser utilizado para visualizar a morfologia e composição da cromatina nuclear das células germinais em cultura. Descobrimos que para a identificação clara dos estágios de desenvolvimento da cultura, isso é vantajoso em relação a outros critérios, como enrolando de cistos. É importante ressaltar que o protocolo apresentado não envolve adição de fly extalém do soro fetal bovino ract factores de crescimento ou outros. Além disso, mostramos aqui que as condições sejam compatíveis com a microscopia de fluorescência de imagem de divisões meióticas ex vivo na cultura. As imagens podem ser obtidas com resolução razoável em um meio fácil de usar que suporta o desenvolvimento de longo prazo. Isto está em contraste com os protocolos que permite observações a curto prazo (cerca de 3 horas) em Voltalef óleo 41,42. Os procedimentos acima descritos para o cultivo e tratamento farmacológico da testículos pupa e individuais germinativas masculinas cistos são facilmente adaptáveis ​​a muitos genética, epigenética, célula biológica, ou questões de desenvolvimento que pode ser pesquisado em Drosophila espermatogênese. Isso inclui principalmente pesquisa com foco em células-tronco germinativas. Foi demonstrado que o desenvolvimento das células estaminais pode ser seguido por meio de imagens ao vivo de adulto cultivadas testículos 20,43. No entanto, o movimento peristáltico do testículo madura bainhah interfere na aquisição de imagem. Portanto, ou de imagem é feita usando testes fragmentados 43 ou o número de experimentos de imagem realizados tem que ser aumentada para dar conta perdidos conjuntos de dados 20. Testículos pupa precoce (24 horas APF) ainda não está fechado com células musculares. Mesmo um pouco mais velhos (36-45 testículos hr APF) parecem mostrar alguns movimentos peristálticos (comparar Figura 3 e vídeo Suplementar 1). Assim, o cultivo de jovens testículos pupa como órgãos intactos poderia servir como uma alternativa. Além disso, uma vez dominada, a capacidade de dissecar testículos pupa e, eventualmente, isolados em células germinais cistos permitirá novas aplicações usando cistos simples como fonte de uma homogênea, embora pequena população de células. Por exemplo, é assim possível realizar a RT-qPCR para analisar a regulação da transcrição de genes específicos em fases definidas da espermatogénese, como já foi demonstrado <sup&gt; 15.

O desenvolvimento de células germinativas masculinas de muitas espécies é um processo sequencial. Caracteriza-se por uma série de eventos cruciais que culmina na formação de espermatozóides morfologicamente e epigeneticamente altamente especializada. Em Drosophila melanogaster, as células-tronco de linha germinal na ponta da divisão testículo assimetricamente para dar origem a uma nova célula-tronco ea spermatogonium, ou seja, a célula-filha que está comprometida com a diferenciação (ver Figura 1 para uma visão geral) 1,2 . O spermatogonium sofre quatro rondas de divisões de mitose e, com o início da meiose, uma fase de crescimento impressionante e actividade de transcrição denominado a fase de espermatócitos. As células provenientes de um spermatogonium permanecem ligados uns aos outros e desenvolver-se como um feixe sincronizado envolto por duas células somáticas uma estrutura referida como um cisto. Após a conclusão da meiose, a morfologia das células germinais masculinas é completamentereorganizado (esquematicamente mostrado na Figura 1). Inicialmente, espermatídeos redondos alongados para formar a estrutura de cabeça hidrodinâmico, e o flagelo desenvolve. Eventualmente, as células do esperma são separados um do outro por um mecanismo complexo, relacionados com a apoptose chamado individualização 3-5. Em muitas espécies, incluindo Drosophila melanogaster e espécies de mamíferos, as alterações morfológicas das células germinativas são acompanhados por um rearranjo epigenética notável da haplóides masculino germinal cromatina, chamado o interruptor histona-to-protamina (interruptor HP) 6-9. Possivelmente, a quase totalidade da histona canónica e várias moléculas de variantes de histona-são retirados a partir do ADN e são substituídas por pequenas proteínas básicas, as protaminas, resultando na estrutura altamente compacta nucleoprotamine específico para a cromatina de esperma maduro. Características gerais do interruptor HP são tele substituição de histonas canónicas primeiro por variantes de histona, em seguida, por proteínas de transição, e, finalmente, por protaminas. Tudo isto é acompanhada por várias mudanças a epigenética marcas, tais como um aumento nos níveis de acetilação da histona H4, imediatamente antes da remoção da histona 7,10 - 12. A maioria, se não todos, os processos acima mencionados são essenciais para o desenvolvimento de maturidade, esperma completamente férteis. Isto é verdade não apenas em Drosophila, mas também em seres humanos, com as ações da espermatogênese de mamíferos uma quantidade considerável de similaridade com o sistema 1,8,9 invertebrados. Estudo do desenvolvimento de células germinativas do sexo masculino é facilitada no sistema do modelo de Drosophila. As moscas são geneticamente muito acessível. A geração de mutantes, assim como o estabelecimento de linhagens de moscas expressando genes de fusão ou construções de interferência RNA leva pouco esforço. No entanto, no estudo de pós-meiótica espermatogénese, a utilização de mutantes de umad ferramentas genéticas simples poderia chegar a um limite. Em Drosophila espermatogênese, transcrição cessa quase completamente com entrada em divisões meióticas. Assim, a espermatogênese pós-meiótica é baseado principalmente em mRNAs traducionalmente reprimidos e armazenados sintetizadas em uma prófase meiótica estendida 13-16. Portanto, como ferramentas de interferência de ARN ou a utilização de mutantes não-condicionadas, não são adequados para estudar os papéis especificamente pós-meióticas de produtos de genes que desempenham funções essenciais também no desenvolvimento de células germinativas pré-meiótica ou meiose. Uma vantagem de Drosophila que pode ser explorada em tais casos, é a capacidade de testículos dissecados intactas e até cistos de células germinativas para desenvolver ex vivo, em meio de cultura 4,12,17 - 20. A dissecção e cultivo de testes ou cistos germinativas permite não só a observação microscópica do desenvolvimento de células germinativas em células vivas, mas umlso a utilização dos ensaios farmacológicos, por exemplo, inibidores de complexos de enzimas, tais como histona-acetiltransferases (HATs), histona desacetilases (HDACs), topoisomerases, ou o proteassoma. Assim, é possível manipular funções enzimáticas durante a espermatogênese pós-meiótica e monitorar os resultados de desenvolvimento, independentemente do embrionárias, pré-meióticas, ou meiose funções 4,12. Em ensaios farmacológicos, que previamente analisadas a localização dependente de acetilação de uma proteína bromodomain durante a prófase meiótica, bem como a relevância dos níveis de acetilação das histonas para o interruptor epigenético HP na espermatogênese pós-meiótica utilizando inibidores específicos visando chapéus e HDAC 12,21. Visando o interruptor HP nestes ensaios foi tornada possível pelo uso de uma estirpe da mosca que expressa os genes de fusão histone2AvD-RFP e protamineB-eGFP 12,22 nos padrões endógenos, e a observação de queos primeiros espermátides nos testículos pupa passar pelo interruptor HP entre 24 e 48 horas APF 12. O protocolo apresentado descreve a dissecção dos testículos e cistos de Drosophila pupas, as condições de cultura, e um ensaio farmacológico com testículos pupa intactas. Para esta finalidade, os testículos pupa em aproximadamente 24 horas após a formação pupário (APF) são dissecados (ver Figuras 1 e 2). Neste momento, os testículos não foram feitas ligações a outros tecidos e estão rodeados por apenas uma bainha externa fina, o que permite uma melhor penetração dos compostos inibidores de 23,24. Os testículos são órgãos bean- ou em forma de pêra que podem ser facilmente levados em cultura. Estes testes são dissecados e cultivados e tratados com inibidores específicos. Subsequentemente, os efeitos dos inibidores são monitorados utilizando imunofluorescência e microscopia de fluorescência de expressão de proteína de fusão, e por comparação da morfol nucleargia das células germinais tratados para que não tratados de células germinais. As condições apresentadas neste protocolo também permite que imagens ao vivo de desenvolver testículos e cistos germinativas em cultura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

Durante a espermatogénese em mamíferos e em Drosophila melanogaster, as células germinais masculinas em desenvolver uma série de processos de desenvolvimento essenciais. Isso inclui a diferenciação de uma população de células-tronco, a amplificação de mitose e meiose. Além disso, as células germinativas de pós-meióticas submetido a um processo de remodelação morfológica dramático, bem como uma reconfiguração epigenética mundial da cromatina a opção de linha de germe de histona-a-protamina. O estudo do papel da proteína na espermatogénese pós-meiótica usando mutagénese ou outras ferramentas genéticas é muitas vezes impedida por embrionário essencial, a pré-meiótica, meiose ou funções da proteína em estudo. O fenótipo de pós-meiótica de um mutante de uma tal proteína pode ser obscurecidos por meio de um bloco anterior de desenvolvimento, ou a interpretação do fenótipo pode ser complicado. O organismo modelo Drosophila melanogaster oferece um bypass para este problema: testículos intactos emesmo cistos de células germinativas dissecados a partir de pupas cedo são capazes de desenvolver ex vivo, em meio de cultura. Fazendo uso de tais culturas permite imagens microscópicas de células germinativas vivendo em testículos e de cistos de linha germinal. É importante ressaltar que os testículos cultivadas e células germinativas também tornar-se acessível a inibidores farmacológicos, permitindo assim a manipulação de funções enzimáticas durante a espermatogênese, incluindo as etapas de pós-meióticas. O protocolo apresentado descreve como dissecar e cultivar testículos pupa e cistos em células germinais. Informações sobre o desenvolvimento dos testículos pupa e condições de cultura são apresentadas juntamente com dados de imagens de microscópio de testículos ao vivo e cistos germinativas em cultura. Os requerentes também descrevem um ensaio farmacológico para estudar a espermatogénese pós-meiótica, exemplificado por um ensaio de direccionamento do comutador de histona-a-protamina usando o ácido anacárdico inibidor de histona-acetiltransferase. Em princípio, este método de cultivo pode ser adaptado para tratar o muitosquestões de pesquisa utras na espermatogênese pré e pós-meiótica.

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Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testículo e único macho da linha germinal Cistos: Dissection, Imaging, eo tratamento farmacológico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K visualizações.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Vídeo: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larval Dissection MNJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissecção e coloração de Drosophila Larval Ovários

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imagem Através do Pupal Caso de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus