Os autores gostariam de agradecer ao Programa Iniciativa Interdisciplinar de Inovação da Universidade de Illinois, conceder 12035. SK foi financiado pelo UIUC da National Science Foundation (NSF) Grant 0.965.918 IGERT: formação da próxima geração de Pesquisadores em Celular e Mecânica Molecular e bionanotecnologia.

Fabrico e funcionalização géis PA variando de rigidez com microesferas fluorescentes incorporadas perto da superfície da cultura de células. 1. Funcionalização o tampo de vidro lamínulas <ol><li> Limpo lamelas de vidro (# 1,0, 12 mm de diam.) Com sabão e água, seguida por etanol, para remover o pó estranhos. </li><li> Tampa de vidro lugar desliza sobre uma superfície ralado (ou seja, o titular da ponteira) de tal forma que eles não estão tocando para facilitar a facilidade de interação com as lamelas. </li><li> Bata de toda a superfície da tampa desliza com poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 hora (Figura 1A). </li><li> Durante este tempo, realizar uma diluição de 1: a solução de colóide de 0,1 um de diâmetro de 10.000, microesferas fluorescentes vermelhas com desionizada (DI) de água para se obter uma densidade de partícula de cerca de 1 por microesfera 20 mM 2 sobre a superfície do gel. Ver Figura 2 para os resultados de várias diluições. Este dilution pode ser modificado para atender a necessidade de experimentos específicos. </li><li> Coloque a solução diluída em um banho de água de ultra-sons durante 30 min. </li><li> Depois de 1 hora, use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne os lamínulas secos à superfície ralado. </li><li> Remover a solução de colóide diluído a partir do banho de ultra-sons e uma pipeta de 150 uL em cada lamela. Deixe descansar por 10 min (Figura 1B). </li><li> Use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne a tampa seca desliza para a superfície e loja ralado no escuro até que esteja pronto para uso. </li></ol> 2 Preparando PA Gel Diretamente na Glass Bottom placas de Petri <ol><li> Placa de aquecimento de pré-aquecimento a 100 ° C. </li><li> Coloque para fora o número desejado de fundo de vidro placas de Petri (35 milímetros prato com 14 milímetros micro-bem, # 1.0) em uma superfície plana em um exaustor química. </li><li> Cubra a parte de vidro de cada placa de Petri micro-bem com 97% 3-Aminopropil-trimethoxysliane (3-APTES) para 7 min para ativação química. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida dos 3-APTES à superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do poliestireno. </li><li> Após 7 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos. </li><li> Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco. </li><li> Retirar as placas de Petri a partir da placa de aquecimento e voltar para uma superfície plana numa hote química. </li><li> Em uma coifa química, fazer uma solução de glutaraldeído a 0,5% e a porção de cobertura de vidro de cada placa de Petri bem com a solução durante 30 min. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida do glutaraldeído para a superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do plástico. </li><li> Após 30 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos para lavar e remover o glutaraldehyde. </li><li> Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco. </li><li> Antes de misturar os componentes da solução de gel de PA, mover as lâminas de vidro funcionalizadas no exaustor de fumos química de tal modo que eles são facilmente acessíveis, o que permite a rápida ensanduichar do gel com o fundo de vidro pratos de Petri depois de misturar a solução de gel. </li><li> Num tubo de centrífuga de 15 mL, misturar 40% bisacrilamida, 2% de acrilamida, e de ácido acrílico em sucessão imediata, nas concentrações listadas na Tabela 1 (adaptado do protocolo publicado 10) para atingir a desejada elasticidade da matriz. </li><li> Adicionar 100 mM de HEPES, 10% de persulfato de amónio e TEMED em quantidades indicadas na Tabela 1 correspondem a elasticidade da matriz desejada para completar a solução de gel. </li><li> Imediatamente pipeta 15 ul de solução de gel para o centro da porção de vidrodas placas de Petri. </li><li> Imediatamente pegar uma tampa de deslizamento de vidro funcionalizado com uma pinça. <ol><li> Vire a tampa de deslizamento de vidro sobre tal que as partículas fluorescentes estão na tomada de lado o contato com a solução de gel. </li><li> Coloque a tampa deslizante suavemente no topo do gel-líquido PA agora de tal modo que o lado funcionalizado está em contacto com o gel (Figura 1C). Nota: Para obter melhores resultados, uma segunda pessoa é recomendado para a função de adicionar o deslizamento da tampa, a fim de evitar a possibilidade de a polimerização parcial, enquanto pipetando solução líquida gel PA em várias placas de Petri. </li></ol></li><li> Virar todas as placas de Petri sobre para ajudar a evitar os efeitos da gravidade sobre nanopartículas fluorescentes polimerização em níveis mais baixos do gel PA. </li><li> Aguarde pelo menos 35 minutos, ou até que a solução estoque de gel PA visivelmente polimerizado em seu tubo de centrífuga. </li><li> Virar as placas de Petri de volta e enchê-los com PBS para ajudar com a remoção da tampa de deslizamento. </li><li> Com cuidado, faça contato com a parte de vidro da placa de Petri e os contornos da lamínula, usando uma pinça para raspar a circunferência da lamela. Execute vários ciclos até que a lamínula é desalojado. Retire a tampa de deslizamento e descarte em um recipiente de resíduos perfurocortantes adequada. </li><li> Após a remoção de todos os lamelas, contas fluorescentes terá transferido para o gel (Figura 1E). Cubra os géis PA completamente com PBS, coloque a tampa placa de Petri em cada prato, e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 3. Funcionalização gel PA com fibronectina <ol><li> Preparar as seguintes soluções de pré-misturados tal como descrito no protocolo estabelecido 11: solução Soak (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) e 2x tampão de conjugação (0,2 H 2 (N-morfolino) etanossulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5). </li><li> Use uma bomba de vácuo em uma capa biológico para remover toda a PBS dos pratos com fundo de vidro contendo os géis PA. </li><li> Pipetate embebe a solução para cada gel de tal forma que o gel é completamente submerso. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr. </li><li> Quente 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) e N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente. </li><li> Misturar 10x soluções de EDC (150 mM, 19 mg / ml em água desionizada) e NHS (250 mM, 29 mg / ml em água desionizada). </li><li> Misture uma parte de 10x EDC, uma parte 10x NHS, 3 partes de água DI e 5 peças 2x tampão conjugação. </li><li> Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover a solução de impregnação. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel. </li><li> Adicionar suficiente solução de NHS / EDC, para se cobrir a superfície do gel e encher o poço com fundo de vidro da placa de Petri (150-250 uL). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. </li><li> Fibronectina Descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, misturar água estéril DI para criar um / ml solução de fibronectina 50 ug. </li><li> Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover as solu NHS / EDCção. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel. </li><li> Adicionar 150 ul de solução de fibronectina para cada gel. Incubar à temperatura ambiente durante 35 min para permitir a ligação da fibronectina. </li><li> Após 35 minutos, adiciona-PBS a cada prato de Petri e armazenar a 4 ° C durante até 2 semanas. </li></ol> 4. Experimentos TRACCÇÃO <ol><li> Meios de célula quente, PBS, e tripsina a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Lavar géis 5x com PBS estéril, aspirar o PBS entre lavagens, e deixe coberto na capa. </li><li> Adicionar 1 ml de tripsina por cada 25 cm2 de frasco contendo células. Após as células são levantadas a partir de frasco, diluir a tripsina com meio celular e contar as células. Com base na área superficial do gel, determinar o número de células necessário por gel para uma densidade final de células de semeadura de 3000 células / cm 2. Dilui-se ou concentrar-se a suspensão de modo a que 150 uL da mistura de células-media contém este número de células. Alíquota de 150 mL de suspens celularesião positivo para cada gel. </li><li> Colocar as placas de Petri contendo as células numa incubadora durante 30 min. Em seguida, remove cuidadosamente os pratos de Petri e encher o restante da placa de Petri com meios de comunicação (aproximadamente 2 ml) de tal modo que a superfície do prato é completamente submerso. </li><li> Colocar as placas de Petri de volta na incubadora até que a aquisição de imagem. </li><li> Prepare o sistema de aquisição de microscópio e dados para geração de imagens: inserir a objetiva de imersão 40x de água, insira o contraste de interferência diferencial (DIC) Prisma, selecione o mCherry ou filtro fluorescente equivalente, e ligue a câmara ambiental. </li><li> Quando preparado para imagens, remover uma placa de Petri da incubadora e coloque-o suavemente sobre o estágio do microscópio. Remover a tampa do prato de Petri para DIC imagiologia. </li><li> Localize uma única célula e capturar uma única imagem da célula na DIC. </li><li> Sem mover o estágio do microscópio, mude o modo de imagem para fluorescência. Concentre-se nas microesferas fluorescentes e record uma imagem das microesferas. </li><li> Remover cuidadosamente a partir de meio celular a placa de Petri com uma pipeta e adicionar 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Imagem das microesferas sob a célula após as células têm destacado. </li><li> Velocimetria de imagem (PIV) Use análise de partículas no ImageJ 12 para calcular o campo de deslocamento devido a forças de celulares. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide.">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li><li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell&#8211;cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell&#8211;cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate.">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li><li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+chemistry,+topography,+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface:+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response.">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li><li>Mih, J. D., Sharif, A. 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P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells.">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li><li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ao utilizar esta técnica, é essencial que a solução do grânulo é adequadamente diluída e os grânulos são escolhidos com base no diâmetro desejado, PA rigidez substrato de gel, e a escala de tamanho dos fenómenos que é explorado na experiência desejada. O cuidado deve ser tomado ao diluir a solução talão antes de funcionalização top lamínulas de vidro. O espaçamento entre as esferas na superfície do gel pode ser alterada alterando o factor de diluição da solução coloi...

A interação mecânica de uma célula viva com o seu ambiente local tem sido comumente estudada utilizando géis PA. Estes substratos de contar com um protocolo simples, bem caracterizado estabelecida por Dembo e Wang, em 1997, 1. Uma das principais vantagens destes substratos é que a sua rigidez pode ser ajustado por modificação das concentrações de componentes específicos da solução de gel. Isso fornece uma plataforma desejável estudar a interação das células com ambientes de diferentes rigidez. Quando géis PA são revestidos com proteínas (ECM) de matriz extracelular, as células aderir a elas, a geração de força. Como resultado da força da célula, o gel se deforma como um corpo elástico. Esta deformação depende da intensidade da força aplicada pelas células e as propriedades elásticas do gel. Vários estudos têm empregado géis PA para investigar forças de tração celulares. Numa variação de fabricação de gel PA, microesferas fluorescentes (esferas) são incorporados turante o gel para quantificar as forças de tração na célula em géis de diferentes rigidezes 2. Após a aplicação da força de células, as contas de deslocar da sua posição inicial após a deformação de gel. O campo de deformação é medida a partir dos deslocamentos individuais grânulo. Este campo é utilizado com deformação teoria da elasticidade e as propriedades elásticas do gel para calcular as forças de tracção. Essas medidas fornecem uma visão de como as células perceber e interagir com seu microambiente local 3 mecanicamente. Em muitos PA protocolos de fabricação de gel utilizado, as contas são misturados em todo o gel PA na sua, não polimerizada estado líquido. Um gel de PA totalmente polimerizado contém pérolas fluorescentes todo o seu volume. Ao calcular as forças de tração na célula, contas a maioria perto da superfície do gel (interface de célula-substrato) são monitorados. Os deslocamentos destes grânulos são assumidos como ocorrem na superfície da cultura de células para manter a simplicidade da força CÁLCULOn. A localização exacta dos grânulos dentro da profundidade do gel é ignorado. No entanto, em um meio elástico (tal como gel de PA), um grânulo mais perto de um ponto de aplicação de força irá mover-se mais do que uma camada que está mais longe do ponto. Assim, tratando o deslocamento de um ponto (no local do grânulo) distal a partir da superfície como os resultados que a superfície em uma subestimação de trações celulares. O grau de erro depende da distância do rebordo a partir da superfície. O erro não pode ser estimado sem o conhecimento da localização do rolete. A necessidade de um método simples para limitar grânulos muito perto da superfície da cultura de células foi tratada por algumas técnicas. Uma maneira é a de aumentar a densidade dos grânulos durante todo o gel de modo a que haja um número suficiente de esferas no plano focal de cima para medir o movimento muito perto da superfície. Outra técnica envolve a construção de uma câmara de imagem confocal de imagem de células vivas, tais que a luz a partir deapenas as contas no plano superior mais focal é coletado 4. Um método diferente envolve a sobreposição de uma camada extremamente fina de gel PA contendo contas em cima de um gel já polimerizado sem contas 5. Uma desvantagem de cada uma destas técnicas é que o local exacto dos grânulos dentro do gel não seja conhecida. Isto introduz erro no cálculo do campo de deslocamento dos grânulos e, assim, o cálculo das forças de células. Outra técnica envolve a conjugação de grânulos para a superfície de topo de um gel de AP já polimerizado usando Sulfo-SANPAH 6. Esta técnica assegura que os grânulos são, de facto apenas no topo do gel de AP, mas o grau em que eles são incorporados na profundidade do gel é desconhecido. Isto pode, potencialmente, criar uma topografia local para as células, o que poderia alterar o comportamento celular, como o trabalho anterior sugeriu que as células podem sentir forças vários microns de distância 7. Recentemente, uma técnica de padronização géis PA com 1 mícron de diâmetro fluorescent marcadores fibronectina pontos em uma matriz regularizada foi estabelecido 8. Neste caso, a profundidade dos marcadores fluorescentes é conhecido, e é essencialmente zero, enquanto o padrão impresso é indirectamente fibronectina na superfície do gel. No entanto, este método não proporcionar um ambiente no qual as células contínua pode anexar, como a proteína de ECM está limitada a um um de diâmetro pontos. Um método para integrar plenamente contas rastreador dentro géis PA e confiná-los em um local conhecido muito perto da superfície ainda não foi estabelecida. Aqui, nós desenvolvemos uma técnica para limitar sub mícrons de diâmetro de partículas fluorescentes uM para um plano focal muito perto da superfície de cultura de células dentro de gel de PA. Um gel é geralmente curado por ensanduichamento solução gel líquido não polimerizado entre duas chapas de vidro. Uma das placas é funcionalizado de modo a que o gel adira fortemente a ele. A outra é não funcionalizados e é removido após a cura do gel. Nós modificar este vidro removível surface revestindo-o com uma camada de grânulos. Após a ensanduichar o gel líquido entre a superfície de vidro funcionalizada e a pérola revestida, a transferência de contas para o gel, ao passo que se a cura. Isto limita a distância de integração dos grânulos no gel a cerca de 1,6 uM da superfície. Pratos de Petri de vidro de fundo são usados ​​como a superfície aderente em que o gel é curado. Para formar uma superfície superior plana de gel durante a polimerização, uma lamela circular de vidro é usado para o gel de sanduíche com a placa de Petri com fundo de vidro. Antes da fabricação de gel, a parte superior da tampa deslizante de vidro é revestido com poli-D-lisina (PDL), obtendo-se uma carga de superfície positiva. O PDL é soprado com ar comprimido, e com uma solução de pérolas em água é depositada sobre as lamelas. Nós utilizamos microesferas fluorescentes carboxilados, que carregam uma carga negativa, e interagir com a superfície carregada positivamente criado por tratamento com PDL. Após a solução de sopro grânulo fora da lamela com ar comprimido, de uma única camada decontas permanece eletrostático acoplado à tampa de deslizamento seco. O revestimento PDL não afecta a adesividade da superfície de vidro para o gel, como as lâminas de vidro são sem danos e removido do gel de AP totalmente intacta. As placas de Petri de fundo de vidro são feitos aderente por tratamento com 97% de 3-aminopropil-trimethoxysliane e 0,5% de glutaraldeído. Géis PA de rigidez desejados são criados através da mistura de concentrações adequadas de bisacrilamida e acrilamida através de um procedimento padrão 9. Uma gota da solução de gel é pipetada para o fundo uma placa de Petri de vidro. A lamela de vidro contendo as pérolas é usada para sanduíche do gel com a placa de Petri. Quando o gel é curado, o topo da tampa deslizante é removido, deixando as pérolas embutidas no gel PA dentro de 1,6 pM a partir da superfície.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

PA géis têm sido muito utilizadas como uma plataforma para estudar as forças de tracção da célula devido à facilidade de fabrico e a capacidade para sintonizar as suas propriedades elásticas. Quando o substrato é revestido com uma proteína da matriz extracelular, as células aderem ao gel e aplicar forças, fazendo com que o gel para se deformar. A deformação de tracção depende da célula e as propriedades elásticas do gel. Se o campo de deformação da superfície é conhecido, a superfície de tracção pode ser calculada usando a teoria de elasticidade. Gel de deformação é normalmente medida por incorporação de grânulos de marcadores fluorescentes para o gel de modo uniforme. As sondas deslocam como o gel se deforma. As sondas perto da superfície do gel são rastreados. Os deslocamentos relatados por estas sondas são considerados como deslocamentos de superfície. As profundidades da superfície são ignorados. Esta hipótese apresenta erro na avaliação da força de tração. Para a medição precisa das forças de células, é essencial para a localização dos grânulos a ser conhecido. Nós desenvolvemosuma técnica que utiliza a química simples para limitar grânulos marcadores fluorescentes, 0,1 e 1 m de diâmetro, em géis de PA, dentro de 1,6 uM da superfície. Nós revestir uma lamela com poli-D-lisina (PDL) e esferas fluorescentes. Solução gel PA é então espremido entre a lamela e uma superfície aderente. As contas fluorescentes transferir para a solução de gel durante a cura. Após a polimerização, o gel PA contém pérolas fluorescentes num plano perto da superfície do gel.

Imagiologia confocal foi utilizada para determinar que os grânulos eram de facto sob a superfície do gel e para quantificar a sua localização precisa dentro da profundidade de gel. As contas fluorescentes de um comprimento de onda diferente do que os que estão dentro do gel foram deixadas a assentar sobre a superfície, e a distância entre as nanopartículas fluorescentes incorporadas e aqueles em que o revestimento foi calculada utilizando um algoritmo de identificação centróide. A localização do cordão na ...

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A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

As técnicas tradicionais para a fabricação de poliacrilamida (PA) géis contendo sondas fluorescentes envolvem imprensando um gel entre uma superfície aderente e uma lâmina de vidro. Aqui, mostramos que este revestimento de lâmina com poli-D-lisina (PDL) e sondas fluorescentes localiza as sondas para dentro de 1,6 pM a partir da superfície do gel.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K visualizações.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  As técnicas tradicionais para a fabricação de poliacrilamida (PA) géis contendo sondas fluorescentes envolvem imprensando um gel entre uma superfície aderente e uma lâmina de vidro. Aqui, mostramos que este revestimento de lâmina com poli-D-lisina (PDL) e sondas fluorescentes localiza as sondas para dentro de 1,6 pM a partir da superfície do gel. 

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Bioengenharia

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Microscopia de Força de Tração para Estudar ativação de linfócitos B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificação simultânea de kynureninas selecionadas analisadas por espectrometria de cromatografia líquida-massa em média coletada de culturas celulares cancerosas

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicação de microscopia de força atômica para detectar osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...