A microscopia de força de tração é usada para medir forças geradas por células. Este protocolo simplifica a análise de coleta de dados de força de tração, a fim de torná-lo mais acessível a usuários inexperientes. A principal vantagem dessa técnica em relação às plataformas de microscopia de força de tração sem referência existentes, é que a litografia multifotal permite um redesign rápido e fácil de configuração de padronização de acordo com as necessidades experimentais individuais.
Existem muitos passos fundamentais na fabricação e implementação desta nova plataforma de tração sem referências que são mais fáceis de entender através da representação visual em vez de apenas texto. Para fotopolimerização do hidrogel base, primeiro adicione três microlitros da solução pré-polímero em uma fina folha plana de alkanes perfluoroalkoxy, e coloque tiras PDMS de 150 micrômetros de espessura planas ao redor, mas não em contato com a queda da solução pré-polímero. Coloque uma mancha de cobertura silanlada no PDMS, com a gotícula pré-polímera centrada sob a tampa para achatar a gotícula pré-polímero até a espessura dos espaçadores PDMS.
Exponha a solução de pré-polímero sanduíche à luz UV por cerca de um minuto. Quando um hidrogel estiver totalmente formado, separe cuidadosamente o deslizamento de cobertura dos espaçadores PDMS. Use adesivo acrílico de dupla performance de alto desempenho para anexar uma placa de Petri de fundo aberto ao deslizamento de tampa.
Tome cuidado especial ao aderir o deslizamento de cobertura carregado de hidrogel à placa de Petri. Um prato molhado ou pouca pressão durante a aplicação permitirá que vazamentos se formem, arruinando a amostra. Aplique pressão na superfície de contato adesivo para criar uma vedação completa entre a folha de cobertura, adesivo e placa de Petri, tomando cuidado para não quebrar o vidro.
Use PBS filtrado estéril para enxaguar o hidrogel. Em seguida, adicione oito microliters de NVP a 800 microliters da solução de laboratório preparada para a síntese de hidrogel. Para converter uma imagem binária em uma máscara digital, abra o MATLAB e abra e execute o runscript.
m roteiro MATLAB. Selecione o arquivo TIF binário para conversão e selecione uma pasta para salvar os arquivos da região. Insira o tamanho final desejado em mícrons da imagem selecionada.
A imagem de entrada será dimensionada e dimensionada para corresponder a esses parâmetros. Para criar uma matriz de um único pixel, na Região de Opções de Gerador de Juros, desmarque a caixa remova tic em Pequenas Regiões/Pixel únicos, verifique a caixa tic Squares e desmarque Use em Linhas de Quebra Horizontal. Em seguida, clique em OK. O arquivo OVL será encontrado na pasta especificada anteriormente.
Abra o arquivo no software do microscópio e carregue as regiões desejadas que controlaram o obturador a laser durante duas litografias de varredura a laser de fótons. As etapas a seguir devem ser realizadas em condições com luz mínima. Para fabricação de matrizes de marcadores fiduciais em condições de baixa luz, misture completamente 200 microliters da solução de laboratório NVP previamente preparada com 20 miligramas de Alexa Fluor 633 e remova todo o PBS do prato contendo o hidrogel.
Adicione a mistura PEG-633 ao hidrogel como uma gota que abrange completamente o hidrogel base e carregue a placa de Petri no suporte de amostra do estágio do microscópio. Em seguida, cubra o prato e deixe a solução de padronização mergulhar no hidrogel por pelo menos 30 minutos, protegido da luz. Para configurar o microscópio para imagem, selecione os lasers e filtros apropriados para visualizar o Alexa Fluor 488.
Localize o hidrogel usando o sinal PEG-488 e bloqueie a coleta de comprimentos de onda de emissão mais longos do detector. Use tomografias verticais e horizontais para localizar o centro do hidrogel no plano XY e zerar o estágio nesta posição. Use varreduras de linha na função Z-stack para localizar a superfície do hidrogel e zerar o foco nesta posição.
Nivele o hidrogel repetindo a linha escaneia para longe do centro XY para identificar a posição da superfície, ajustando os parafusos definidos para o estágio do microscópio, conforme necessário. Dentro do espaço de trabalho do software do microscópio, crie um arquivo de experimento separado para fotopatterning e defina a potência multifótons para 1,8% e a velocidade de digitalização para seis. Ajuste o tamanho do quadro de imagem e pixels para alcançar um tamanho de pixel de 0,1 micrômetro por pixel e uma proporção de 100 para um e carregue o arquivo das regiões na guia da região.
Use uma macro para definir todas as regiões para adquirir e ativar a função Z-stack. Ajuste o espaçamento para 3,5 micrômetros para uma profundidade total de 28 micrômetros e número total de fatias Z de nove. Em seguida, use a função Posições para definir locais específicos no hidrogel onde os conjuntos de marcadores fiduciais serão fotopatterados.
À medida que o tempo de imersão se aproxima da marca de 30 minutos, adquira sucessivas varreduras da linha Z-stack da superfície do hidrogel a cada cinco minutos para verificar se há inchaço com base em mudanças na localização da superfície em relação à posição de foco zerada. Se não houver alteração na posição da superfície durante o intervalo de cinco minutos, execute as configurações de padronização e use o laser de 488 nanômetros para verificar se a superfície do hidrogel não se moveu durante a padronização. Em seguida, remova o hidrogel do microscópio, aspire a solução PEG-633 da placa de Petri e enxágue a placa com PBS filtrado estéril.
Para adquirir uma célula e imagens de marcador fiduciário, devolva a placa de Petri ao porta-amostras para localizar as áreas padronizadas. Localize uma célula de interesse e adquira uma imagem transmitida ou fluorescente da célula. Em seguida, adquira uma pilha Z da matriz padronizada sob a célula como demonstrado, e adquira um segundo conjunto de imagens transmitidas ou fluorescentes da célula.
Ao coletar uma pilha de imagens, as imagens resultantes devem exibir uma matriz regular de recursos padronizados que oscilam em intensidade em função da posição Z dentro da pilha de imagens. O rastreamento. o script m fornece várias imagens diagnósticas, incluindo uma projeção Z dos marcadores fiduciários fluorescentes para avaliar a qualidade do pré-processamento, um plot dos centrosids detectados, a cor codificada em função da posição Z para avaliar a qualidade de detecção do objeto e um gráfico das faixas representando os centrosídeos marcadores detectados que foram ligados em colunas na direção Z para avaliar a qualidade de rastreamento do objeto.
O script DISP 3D.m fornece um gráfico de intensidade em função da posição Z para cada coluna de recursos detectados em uma determinada pilha de imagens para avaliar a qualidade dos perfis de intensidade do marcador fiducial. Ambos disp 3D.
m e tesoura DISP. m juntos fornecem histogramas do ruído de deslocamento medido em cada uma das dimensões coordenadas cartesianas, bem como mapas de calor interpolados de deslocamento. Além disso, o interp final3D_2.
m fornece mapas de calor das trações superficiais calculadas usando o código terceirizado. A coisa mais importante a ser lembrada durante este procedimento é que as soluções que contêm LAP são sensíveis à luz e devem ser protegidas o máximo possível de fontes de luz ambiente. Lembre-se que o NVP é um composto orgânico volátil e deve ser sempre manuseado em uma coifa de fluxo químico.
