Este método permite medir a distribuição temporal espacial das forças aplicadas pelas células B na sinapse imunológica e correlacioná-las com o recrutamento de proteínas específicas. Microscopia de força de tração usando géis de poliacrilamida é fácil de implementar. Este protocolo pode ser usado para configurar rapidamente a medição das capacidades mecânicas de muitas células B.
Este método é flexível e pode ser adaptado para gráfico de outros ligantes como integrinos ou para estudar outros tipos de sinapses imunológicas como células T ou fagocitose frustrada. Devido às propriedades físicas e químicas dos géis exigidas por este experimento, a adaptação dos métodos clássicos de microscopia de força de tração para células B pode ser complicada. Comece salinizando o suporte de gel.
Ative a tampa ou o fundo de vidro da placa petri com uma lâmpada UV por dois minutos e, em seguida, salinize-a com 200 microliters de APTMS por cinco minutos. Isso preparará o suporte para a ligação covalente do gel. Lave bem o deslizamento ou o prato de fundo de vidro com água ultra pura e seque-o usando aspiração de vácuo.
Para preparar as tampas para achatar o gel, coloque-os em um suporte de deslizamento de cerâmica, coloque o suporte em um pequeno béquer e despeje o reagente de silício sobre as tampas certificando-se de cobri-los completamente. Cubra o béquer com papel alumínio e deixe-o em temperatura ambiente por três minutos. Enquanto isso, encha um grande béquer com água ultra pura.
Após três minutos de incubação no reagente de silício, transfira o suporte de deslizamento de tampas com as tampas para o béquer com água. Enxágue bem as tampas com água ultra pura. Seque-os bem e coloque-os em lenços de papel.
Para obter melhores resultados, proceda imediatamente com polimerização de gel. Prepare um pré-mix de gel pascal de 500 de acordo com as instruções do manuscrito, em seguida, combine 167 microliters da pré-mistura com 1,67 microliters de contas. Vórtice e sonicar a mistura em um sonicator de banho por cinco minutos.
Proteja a mistura da luz com papel alumínio. Para capitalizar a polimerização, adicione 1,67 microlitadores de persulfito de 10% de amônio à mistura de gel, em seguida, inicie a polimerização adicionando 0,2 microliters de TEMED e misturando o gel com uma pipeta. Para lançar o gel, pipeta nove microliters de gel misturam em cada folha de cobertura salinizada ou prato de fundo de vidro.
Imediatamente achate o gel com o deslizamento de cobertura siliconizado, pressionando-o com fórceps para garantir que o gel se espalhe por toda a área do deslizamento de tampas e que parte dele vaze. Inverta a tampa ou a placa de fundo de vidro em uma grande placa de Petri e bata-a no banco para forçar as contas em direção à superfície do gel. Coloque um tecido umidificado no prato para criar uma câmara molhada.
Cubra-o com papel alumínio e incuba-o por uma hora. Após a incubação, facilite a liberação do deslizamento de cobertura adicionando PBS à amostra. Remova cuidadosamente a tampa com uma agulha, inclinando ligeiramente o prato, mas certificando-se de que o gel está submerso no PBS.
O agente silício, acrilamida, acrilamida de base e TEMED podem ser tóxicos por inalação. Use equipamentos de proteção pessoal padrão e manipule esses produtos sob uma capa química. Aspire o PBS dos géis e adicione 150 microliters de Sulfo-SANPAH à temperatura ambiente.
Exponha o gel ao tratamento UV por dois minutos e depois lave o gel três vezes com PBS. Repita o tratamento com Sulfo-SANPAH e as lavagens PBS, depois adicione 250 microliters de lysozyme de ovo de galinha ou HEL ao gel e incuba-o durante a noite em uma câmara de umidade a quatro graus Celsius coberto com papel alumínio. Após a incubação, remova o antígeno HEL e lave o gel com PBS três vezes.
Por fim, cubra o gel com 500 microliters de mídia de cultura celular B e deixe-o em temperatura ambiente. Use um microscópio confocal com controle térmico e de dióxido de carbono para imagem. Aspire a mídia do gel, deixando aproximadamente 200 microliters.
Posicione o gel no microscópio. Duas camadas principais de contas aparecerão na parte inferior e superior do gel. Concentre-se no plano de gel e encontre uma área uniforme para imagem.
Escolha a área de imagem cuidadosamente e certifique-se de manter o foco. Uma densidade de contas adequada e uma superfície uniforme são fundamentais para obter medições de força robustas e confiáveis. Adicione 80 microliters de linfócitos B primários de camundongos MD4 ao gel, evitando tocar o gel para manter o foco.
Certifique-se de que o foco ainda está correto e que as células podem ser vistas descendo na área. Lance a aquisição antes que as células cheguem ao gel. Abra o filme como uma pilha de imagens no ImageJ, em seguida, execute o macro cropandsave.ijm.
Escolha um diretório de saída e configure as configurações do canal de atributo. Selecione as regiões de interesse com a ferramenta retângulo e adicione-as à lista do ROI usando a tecla T. Quando terminar, clique em OK. Quando a macro propõe uma máscara da célula, clique em OK se for satisfatória.
Se não for satisfatório, clique em não OK e selecione manualmente uma região fechada com qualquer ferramenta de seleção e clique em continuar. Abra o MATLAB e execute o TFMV1.m. Insira os parâmetros necessários.
Especificamente, verifique as propriedades da imagem, como o tamanho do pixel e o intervalo de tempo de aquisição e as propriedades do gel, como a relação Young modulus E e Poisson. Quando terminar, localize as saídas do software no mesmo diretório do arquivo original. Imagens corretas de contas parecem uma distribuição uniforme e aleatória de pontos brilhantes semelhantes a um céu estrelado.
Dados e análises não são confiáveis quando o número de contas é muito baixo ou a imagem está fora de foco. É possível observar o movimento das contas por olho usando um quadro de referência que precedeu o primeiro contato da célula com o substrato. Resultados aproximados podem ser obtidos a partir do rastreamento de partículas únicas.
A análise fornece uma segmentação das contas na imagem de referência como controle. Usando software, também é possível obter o campo de deslocamento e estresse, que é o vetor do estresse local em cada pixel e cada ponto de tempo. O produto escalar dos campos de deslocamento e força integrados na área da célula fornece trabalho total exercido pela célula no substrato.
Ao comparar duas condições biológicas, uma curva média ou um valor médio ao longo dos últimos pontos de tempo onde a energia atinge um patamar pode ser calculado. Quando as informações espaciais das forças são relevantes, também é possível comparar pontos de tempo únicos de cada condição. Um exemplo de lapso de tempo de extração de antígeno de fluorescência é mostrado aqui.
O aparecimento progressivo de sinais fluorescentes na sinapse indica descolamento de antígeno do gel. Os dados de fluorescência podem ser usados para construir uma curva média de extração. O passo mais delicado no protocolo é a polimerização do gel sob o deslizamento de cobertura.
Esta etapa deve ser realizada de forma relativamente rápida e cuidadosa, garantindo que o gel seja espremido uniformemente sob a tampa. Após este procedimento, a proteína fluorescente que expressa linfócitos B pode ser usada para avaliar simultaneamente a localização de estruturas intracelulares e padronização da força. Esta técnica pode ser combinada com perturbações genéticas ou químicas para avaliar o papel de proteínas específicas na contração celular e absorção de antígenos.
