We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da KU Leuven e estavam em estrita conformidade com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e com a legislação belga (KB de 29 de Maio de 2013). Cada possível esforço foi feito para minimizar o sofrimento dos animais e para reduzir o número de animais. 1 Tratamento e Anestésicos Animais <ol><li> Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cloridrato de cetamina (75 mg / ml) e cloridrato de medetomidina (1 mg / kg) em solução salina. </li><li> Confira os reflexos, beliscar os dedos dos pés com uma pinça para garantir o mouse é completamente sedado. </li><li> Aplicar álcool 70% para desinfecção das pálpebras e da região em torno do olho usando uma ponta de algodão. Confira o reflexo da pálpebra para avaliar adicionalmente o grau de sedação. </li></ol> 2 Retirar o Eye <ol><li> Certifique-se de que o animal reside em um plano, seco esuperfície lisa. </li><li> Esterilizar uma pinça com uma curva, ponta serrilhada (tamanho da ponta preferido: 0,5 x 0,4 mm). </li><li> Pressione suavemente para o canto (canto do olho) com a pinça até que o globo ocular é deslocado do soquete e do nervo óptico é alcançável. </li><li> Guia da pinça por trás do olho. Pressione e segure o nervo óptico firmemente, de preferência com o início da curva e não na ponta da pinça. Isso vai ajudar a levantar o globo da tomada e apertar o nervo óptico completo. </li><li> Faça movimentos circulares com a mão que segurava a pinça na direção com o mínimo de resistência, enquanto o mouse permanece sobre a superfície plana. O rato vai oscilar ao longo da superfície de acordo com a direcção do movimento da mão. </li><li> Executar esta ação com um aumento gradual de velocidade até o nervo óptico é restrito em dois (geralmente entre 7 a 15 movimentos circulares, aproximadamente meia a uma volta completa por segundo). Por isso, o globo ocular é destacadaremovido. </li></ol> Cuidado 3 Pós-operatório <ol><li> Em caso de sangramento (raro), preencher a órbita com um coagular viscoso e agente hemostático. </li><li> Inverta a anestesia por injeção de 1 mg / kg de cloridrato de atipamezol em soro fisiológico por via intraperitoneal. </li><li> Administrar 1 mg / kg de meloxicam por via intraperitoneal a cada 24 horas, para aliviar a dor. </li><li> Aplicar pomada para o olho restante para evitar a desidratação da córnea. </li><li> Deixar o animal recuperar em uma placa de aquecimento ou envolva o animal em material isolante em uma gaiola separado para controlar a temperatura do corpo. </li><li> Medir o peso do rato a cada dia durante pelo menos 2 dias. A perda de peso pode indicar sofrimento e, neste caso, continuar o tratamento com meloxicam, até que o animal é completamente recuperado. </li></ol>

<ol>
	<li>Toldi, J., Feh&#233;r, O., Wolff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+plasticity+induced+by+neonatal+monocular+(and+binocular)+enucleation.">Neuronal plasticity induced by neonatal monocular (and binocular) enucleation.</a> Progress in Neurobiology. 48 (3), 191-218 (1996).</li><li>Steeves, J. K. E., Gonz&#225;lez, E. G., Steinbach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vision+with+one+eye:+a+review+of+visual+function+following+unilateral+enucleation.">Vision with one eye: a review of visual function following unilateral enucleation.</a> Spatial vision. 21 (6), 509-529 (2008).</li><li>Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+cross-modal+plasticity+in+adult+mouse+visual+cortex+following+monocular+enucleation.">Evidence for cross-modal plasticity in adult mouse visual cortex following monocular enucleation.</a> Cerebral Cortex. 21 (9), 2133-2146 (2011).</li><li>Nys, J., Aerts, J., Ytebrouck, E., Vreysen, S., Laeremans, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cross-modal+aspect+of+mouse+visual+cortex+plasticity+induced+by+monocular+enucleation+is+age-dependent.">The cross-modal aspect of mouse visual cortex plasticity induced by monocular enucleation is age-dependent.</a> Journal of Comparative Neurology. 522 (4), 950-970 (2014).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping.">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e57 (2011).</li><li>Morales, B., Choi, S. -. Y., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark+rearing+alters+the+development+of+GABAergic+transmission+in+visual+cortex.">Dark rearing alters the development of GABAergic transmission in visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 22 (18), 8084-8090 (2002).</li><li>Chen, X. J., Rasch, M. J., Chen, G., Ye, C. Q., Wu, S., Zhang, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binocular+input+coincidence+mediates+critical+period+plasticity+in+the+mouse+primary+visual+cortex.">Binocular input coincidence mediates critical period plasticity in the mouse primary visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (8), 2940-2955 (2014).</li><li>Konur, S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+and+filopodial+motility+in+primary+visual+cortex:+Reduced+effects+of+activity+and+sensory+deprivation.">Developmental regulation of spine and filopodial motility in primary visual cortex: Reduced effects of activity and sensory deprivation.</a> Journal of Neurobiology. 59 (2), 236-246 (2004).</li><li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush:+A+comparative+study.">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: A comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li><li>Galindo-Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+adult+mice:+Quantitative+and+topographic+time+course+analyses.">Axotomy-induced retinal ganglion cell death in adult mice: Quantitative and topographic time course analyses.</a> Experimental Eye Research. 92 (5), 377-387 (2011).</li><li>Kanold, P. O., Kim, Y. A., GrandPre, T., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+ocular+dominance+plasticity+and+NMDA+receptor+subunit+expression+in+glutamic+acid+decarboxylase-65+knock-out+mice.">Co-regulation of ocular dominance plasticity and NMDA receptor subunit expression in glutamic acid decarboxylase-65 knock-out mice.</a> The Journal of Physiology. 587 (12), 2857-2867 (2009).</li><li>Van Brussel, L., Gerits, A., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+localization+of+functional+subdivisions+in+the+visual+cortex+of+the+adult+mouse.">Identification and localization of functional subdivisions in the visual cortex of the adult mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 514 (1), 107-116 (2009).</li><li>Avwenagha, O., Bird, M. M., Lieberman, A. R., Yan, Q., Campbell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+expression+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+tyrosine+kinase+B+mRNAs+and+distribution+and+ultrastructural+localization+of+their+proteins+in+the+visual+pathway+of+the+adult+rat.">Patterns of expression of brain-derived neurotrophic factor and tyrosine kinase B mRNAs and distribution and ultrastructural localization of their proteins in the visual pathway of the adult rat.</a> Neuroscience. 140 (3), 913-928 (2006).</li><li>Hernandes, M. S., Britto, L. R. G., Real, C. C., Martins, D. O., Lopes, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+the+structural+remodeling+of+the+visual+system+after+ocular+enucleation.">Reactive oxygen species and the structural remodeling of the visual system after ocular enucleation.</a> Neuroscience. 170 (4), 1249-1260 (2010).</li><li>Cuyvers, A., Paulussen, M., Smolders, K., Hu, T. -. T., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+cell+proliferation+upon+enucleation+in+direct+retinal+brain+targets+in+the+visual+system+of+the+adult+mouse.">Local cell proliferation upon enucleation in direct retinal brain targets in the visual system of the adult mouse.</a> Journal of Experimental Neuroscience. 4, 1-15 (2010).</li><li>Smith, S. L., Trachtenberg, J. 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L., Klistorner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+degeneration+along+the+visual+pathway+after+optic+nerve+injury.">Anterograde degeneration along the visual pathway after optic nerve injury.</a> PLoS ONE. 7 (12), e52061 (2012).</li><li>Kelly, K. R., McKetton, L., Schneider, K. A., Gallie, B. L., Steeves, J. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+anterior+visual+system+development+following+early+monocular+enucleation.">Altered anterior visual system development following early monocular enucleation.</a> NeuroImage: Clinical. 4, 72-81 (2014).</li><li>Chow, A. M., Zhou, I. Y., Fan, S. J., Chan, K. W. Y., Chan, K. C., Wu, E. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+visual+cortex+of+neonatal+monocular+enucleated+rat:+a+proton+magnetic+resonance+spectroscopy+study.">Metabolic changes in visual cortex of neonatal monocular enucleated rat: a proton magnetic resonance spectroscopy study.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 29 (1), 25-30 (2011).</li><li>Dyer, R. S., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+enucleation+in+retinal+degenerate+mice.">Effects of enucleation in retinal degenerate mice.</a> Physiology &amp; behavior. 14 (2), 207-210 (1975).</li><li>Smith, S. A., Bedi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+eye+enucleation+in+adult+rats+causes+neuronal+loss+in+the+contralateral+superior+colliculus.">Unilateral eye enucleation in adult rats causes neuronal loss in the contralateral superior colliculus.</a> Journal of Anatomy. 190 (4), 481-490 (1997).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+monocular+enucleation+on+calbindin-D+28k+and+c-Fos+expression+in+the+lateral+geniculate+nucleus+in+rats.">Effects of monocular enucleation on calbindin-D 28k and c-Fos expression in the lateral geniculate nucleus in rats.</a> Okajimas folia anatomica Japonica. 82 (1), 9-18 (2005).</li><li>Faguet, J., Maranhao, B., Smith, S. L., Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ipsilateral+eye+cortical+maps+are+uniquely+sensitive+to+binocular+plasticity.">Ipsilateral eye cortical maps are uniquely sensitive to binocular plasticity.</a> Journal of Neurophysiology. 101 (2), 855-861 (2008).</li><li>Van der Gucht, E., Hof, P. R., Van Brussel, L., Burnat, K., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+protein+and+neuronal+activity+markers+define+regional+architectonic+parcellation+in+the+mouse+visual+cortex.">Neurofilament protein and neuronal activity markers define regional architectonic parcellation in the mouse visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 17 (12), 2805-2819 (2007).</li><li>Chaudhuri, A., Matsubara, J. A., Cynader, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+in+primate+visual+cortex+assessed+by+immunostaining+for+the+transcription+factor+Zif268.">Neuronal activity in primate visual cortex assessed by immunostaining for the transcription factor Zif268.</a> Visual Neuroscience. 12 (1), 35-50 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Para realizar a enucleação de sucesso de acordo com o nosso método, os passos mais críticos a serem considerados são: 1) usando uma pinça com ponta curva e serrilhada de tamanho adequado; 2) realizar a enucleação em uma superfície lisa e seca; e 3) aumentando gradualmente a velocidade até os movimentos circulares no sentido com o mínimo de atrito. Para um resultado eficaz, é imprescindível a utilização de uma pinça adequada, caracterizada por uma ponta curvada e dentada (tamanho do bico preferido: mouse: 0,5 x 0,4 mm; rato: 2,15 x 1,3 mm). A curvatura permite um fácil acesso ao nervo óptico após o deslocamento do globo ocular e é necessário para a colocação correta das mãos ao executar os movimentos circulares. Dicas lisos não são recomendadas, uma vez que não têm a aderência necessária ao segurar o nervo óptico. A falha em realizar o nervo óptico adequadamente durante os movimentos circulares resulta na ruptura da artéria oftálmica, pobre descolamento do olho e, por conseguinte, uma fraca reprodutibilidade.Por isso recomenda-se a primeira prática desta técnica em animais sacrificados para a otimização da pinça de manipulação para garantir bem-estar animal máximo uma vez a aplicação do método in vivo. Enucleação ocular sucesso tem sido, recentemente, também realizado no rato no nosso laboratório utilizando a mesma técnica, excepto para virar o corpo do animal e manter manualmente a pinça estacionário. Uma limitação da técnica é que ela poderia danificar a retina. Portanto, este método é menos adequado para a recolha de retinas de realizar histologia 5. Além disso, o nosso método é limitada para deixar a abertura do olho idades desde o olho tem de ser deslocado a partir da tomada, sem remoção ou corte das pálpebras. Enucleação dos olhos de diferentes espécies, incluindo roedores, é rotineiramente realizado utilizando métodos alternativos, que frequentemente implicam a remoção das pálpebras e o corte do nervo óptico 18,23-25. Estes metods tendem a ser mais invasivos e têm uma curva de aprendizagem mais elevada do que a técnica aqui descrita. Sem a necessidade de remover ou suturando as pálpebras, o tempo de recuperação pós-operatório é minimizado, resultando em maior bem-estar dos animais e os resultados mais reprodutíveis.

Remoção de um olho e, assim, de forma irreversível destruindo a superfície receptor sensorial (retina), impõe uma perda considerável de informações sensoriais ao longo da via visual. O modelo de enucleação no sistema visual juvenil e adulta tem provado ser valiosos para compreender o desenvolvimento, plasticidade e função de diferentes centros visuais 1-4. As conseqüências moleculares, celulares e fisiológicos desta privação sensorial pode fornecer insights sobre como o desenvolvimento normal é regulada e como estabelecido circuitos corticais enfrentar e mudar sua estrutura e função em resposta a uma extensa tal alteração na experiência. Existem diferentes métodos de privação visual e todos eles têm suas vantagens específicas em pesquisas relacionadas à visão. Por exemplo criação escuro especificamente elimina impulsionado visualmente atividade, no entanto, não afeta a atividade da retina espontâneo. Da mesma forma, suturas tampa ou tapa-olhos remover modelada vil entrada sem perturbar a atividade espontânea, mas eles permitem a penetração da luz dispersa através dos olhos fechados. Esses métodos são reversíveis e têm mostrado ser úteis para a compreensão do papel de visão e de baixo nível de correlação modelado de entradas binocular em esculpir circuitos corticais durante o desenvolvimento 6-8. Na pesquisa de glaucoma, o modelo de esmagamento do nervo óptico em animais adultos, tem sido amplamente utilizado porque estabelece uma perda progressiva das entradas de células do gânglio retinal que formam o nervo óptico 9,10. Por outro lado, a enucleação, em que o olho e a retina é completamente removido e, instantaneamente, é a escolha apropriada de privação quando o objectivo é o de remover irreversivelmente visão tanto espontânea e modelado de uma só vez. Ela induz também um desequilíbrio actividade intra-ocular robusta que pode melhorar a relação sinal-ruído em estudos de mapeamento de actividade 11,12. Comparando as mudanças funcionais e estruturais em resposta a enucleação com those após a privação por métodos menos drásticas, como sutura tampa por exemplo, também pode expor novos insights sobre o papel da atividade da retina espontâneo em ambos os tipos de homeostase e de plasticidade sináptica. Enucleação desencadeia uma perda de influências tróficas em alvos diretos da retina. Por exemplo, os níveis de BDNF são significativamente downregulated no núcleo lateral geniculado (LGN) e colículo superior de ratos adultos enucleadas 13. Espécies reativas de oxigênio, que funcionam como moléculas mensageiras para mediar remodelação estrutural, também foram detectados em estruturas subcorticais do rato adulto sistema visual 14. Além disso, microglia e ativação astrocitária através de diferentes estruturas alvo visuais subcorticais no rato ocorrer em um período de tempo pós-enucleação específico de uma semana 15. Juntos, os resultados desaferentação ópticas em diferentes respostas subcorticais no glial, nível estrutural e molecular. Apesar destes subcorticalefeitos, não implica necessariamente efeitos no nível cortical 16. Notável, plasticidade cortical inter-modal, incluindo modificações em outras áreas sensoriais ao lado do fortalecimento de insumos não-visuais para o córtex visual privados ocorrer após tanto monocular (ME) 3,4,17,18 e binocular (BE) 1,17 enucleação. Para além de contribuir para neuroscience visual, enucleação como um tipo de desaferentação pode ser utilizado para estudar o equilíbrio entre a 19 neuroprotectores e neurodegenerativos 20-22 propriedades do sistema nervoso central. Diferentes procedimentos para realizar a enucleação já descritos na literatura. Certas metodologias para in vivo ME em ratos e camundongos são menos simples devido ao corte desnecessário de músculos orbitais e tecido 23-25. Outras publicações, tais como Mahajan et al (2011) 5. Fornecer um protocolo detalhado usando<html> dissecção romba para uma coleção de alto rendimento de olhos para estudar as correlações genótipo-fenótipo, provavelmente post-mortem. Para a sua finalidade, o método é rápido e conveniente. No entanto, este método é menos adequado para visualização in vivo, quando se opta enucleação para estudar o caminho visual aferentes a seguir a enucleação (em animais vivos) em vez do próprio olho. Em tal cenário, a sobrevivência pós-enucleação é de grande importância. Além disso, um mínimo de danos vivo e preservação do nervo óptico e do tecido orbital é favorável. Aqui, nós apresentamos um método alternativo enucleação, mais semelhante ao descrito por Faguet et al (2008) 26, que oferece certas propriedades vantajosas:. Está associado com uma recuperação pós-operatória rápida e é caracterizado por um limite muito baixo de aprendizagem para os pesquisadores. Em geral, os métodos são complementares diferentes dependendo do foco de pesquisas subsequentes: morfologia do olho ou de investigação via visual. ve_content &quot;&gt; Em suma, a enucleação pode ser aplicado a partir de pesquisas de visão para investigações de plasticidade homeostática e cross-modal cérebro, propriedades de resposta da glia, e estabilidade axônio. Neste artigo visualizados, demonstramos um método viável e confiável para in vivo enucleação do olho em o mouse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (Anesketin)</td>
			<td>Dechra Veterinary Products (Eurovet)</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine hydrochloride (Domitor)</td>
			<td>Orion Corporation (Janssen Animal Health)</td>
			<td>BE-V151742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezol hydrochloride (Antisedan)</td>
			<td>Orion Corporation (Elanco Animal Health)</td>
			<td>BE-V153352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim Vetmedica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment (Fucithalmic)</td>
			<td>Leo Pharma nv-sa</td>
			<td>BE 144654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC31 Forceps - Serrated Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps - Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11003-13</td>
			<td>For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic cotton wool</td>
			<td>Qualiphar</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening

Enucleação ou a remoção cirúrgica de um olho pode ser geralmente considerado como um modelo para deaferentação nervo. Ele fornece uma ferramenta valiosa para estudar os diferentes aspectos do visual, cross-modal e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos 1-4. Aqui, demonstramos uma técnica elegante e simples para a remoção de um ou ambos os olhos no rato, que é validado em ratinhos de 20 dias de idade até adultos. Resumidamente, um desinfectadas pinças curvas é utilizado para fixar o nervo óptico atrás do olho. Subsequentemente, os movimentos circulares são realizadas para comprimir o nervo óptico e retirar o globo ocular. As vantagens desta técnica são de alta reprodutibilidade, o mínimo de sangramento, recuperação pós-operatória rápida e um limiar de aprendizagem muito baixo para o experimentador. Assim, uma grande quantidade de animais pode ser manipulado e processado com uma quantidade mínima de esforço. A natureza da técnica pode induzir danos ligeiros ada retina durante o procedimento. Este efeito secundário torna este método menos adequado em comparação com Mahajan et al. (2011) 5, se o objetivo é coletar e analisar tecido da retina. Além disso, o nosso método é limitado a pós-olho abrindo as idades (rato: P10 - 13 em diante) desde o globo ocular precisa ser deslocado do soquete sem a remoção das pálpebras. A técnica in vivo enucleação descrito neste manuscrito foi recentemente aplicado com êxito com modificações menores em ratos e parece útil para o estudo da via visual aferente de roedores em geral.

A Figura 1 ilustra a remoção bem sucedida do olho, utilizando o protocolo descrito e é caracterizado pela ausência de sangramento ou danos físicos aparentes para o tecido orbital ou cavidade ocular (Figuras 1A, 1B). Além disso, o olho tem uma córnea removido suave, coróide e disco óptico, indicativo de um globo completamente intacto (Figura 1C). Uma vez que o nosso protocolo engloba o aperto do nervo óptico por trás do olho e viragem mecânica, o nervo óptico do olho é removida constrito na base da retina (Figura 1E). Realizando os resultados do procedimento descrito em um nervo óptico clean-cut, sem qualquer dano para a área cerebral circundante (Figura 1E). Enucleação monocular, em combinação com o mapeamento de actividade (Figura 2), permite delinear acentuadamente as regiões funcionais de entrada ou no olho específicos vi contralaterall córtex do rato 12,27 ou colunas de dominância ocular mesmo em mamíferos de ordem superior, como macacos 28. Em experiências com ratos, a remoção de um (ME) ou ambos os olhos (SER) combinado com estimulação visual alvejado e a detecção de ARNm de Zif268 ou c-Fos níveis de expressão da proteína foi aplicado para detectar a activação neuronal regional, no córtex visual 12,27 . Em contraste com controles estimulados visualmente (Figura 2A), seja camundongos mostraram atividade basal no córtex visual devido à completa falta de input visual (Figura 2B). Como tal, as fronteiras entre o córtex visual com não-visual (ie. Córtex somatossensorial em mais seções anterior e córtex auditivo em mais seções posteriores) foram descobertos. Os resultados do ME camundongos com um tempo de sobrevivência de uma semana visualizados nas regiões de entrada específicos olho no córtex visual contralateral. As duas regiões foram acionados monocularmente hipoativo e localizado mediai e lateral da zona binocular central (Figura 2C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51936/51936fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 avaliação qualitativa do estado pós-enucleação da cavidade ocular, o olho removido eo nervo óptico. Após a remoção do olho com uma pinça curva (A) sem sangramento ou dano é observado na cavidade ocular (B). O olho removido é completamente intacto como refletido por uma aparência normal da córnea e coróide (C, D). O nervo óptico, é constrangido no disco óptico onde sai o olho (D). A análise da parte ventral do cérebro revela um nervo óptico de corte limpo (asterisco) e nenhum dano aparente para outras estruturas (E). Barras de escala em C, D: 1 mm. Barra de escala em E: 5 milímetros. A: anterior; L: esquerda; P: posterior; R: direita. Figura 2 subdivisões específicas olho-entrada funcionais no córtex visual do rato como reveladas por enucleação. Linhas pretas e cinzas que conectam os olhos eo córtex representam a travessia dos aferentes da retina e as regiões de entrada específicos do olho. A atividade neural é visualizada em cortes coronais de controle (A), BE (B) e ME (C) ratos por radioativo hibridização in situ (ISH) para Zif268 (escala de cinza) em torno do nível Bregma -3,40 mm. Em animais de controlo (A), o córtex visual em ambos os hemisférios expressa elevada actividade no seguimento da estimulação visual. Quando um ou ambos os olhos (s) são extirpados, uma clara diminuição na actividade do sinal é visível nas correspondentes regiões corticais privadas. Monocularmente enucleados (C) ratos mostram uma zona de alta actividade na zona binocular do córtex visual rodeado por uma diminuição de sinal em zonas monoculares contralateral ao olho removido. Barra de escala: 2 mm. Reproduzido com a permissão de Van Brussel et al 12.

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A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação.

Um método altamente reprodutível e fácil de executar<em&gt; In Vivo</em&gt; Ocular Enucleação no Rato após a abertura dos olhos

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

23.2K visualizações.  KU Leuven - University of Leuven.  A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação. 

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biologia

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Geração eficiente e consistente de epitélio/coroide de pigmento da retina a partir de olhos humanos para análise histológica

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...