A privação visual monocular é um excelente protocolo experimental para induzir a plasticidade de resposta visual primária. Normalmente, os neurônios no segmento binóculo do córtex visual primário no camundongo respondem cerca de duas vezes mais fortemente à estimulação do olho contralateral do que ao olho ipsilateral. No entanto, a sutura fechou o olho contralateral durante o período crítico para a plasticidade de dominação ocular resultando na rápida perda de responsividade pelos neurônios V1 para a estimulação ocular contralateral e também seguida por um aumento subsequente na resposta ao olho ipsilateral.
Aqui, introduzimos o protocolo experimental para privação monocular e sugerimos um método comumente utilizado para analisar a tendência de dominação ocular durante a privação visual. Coloque as ferramentas cirúrgicas em uma caixa de alumínio e autoclave-as abaixo de 120 graus centígrados por meia hora. Prepare a solução de 2% de agarose na chaleira de banho de água e mantenha-a a 75 graus centígrados.
Aplique uma fina camada de pomada ocular em ambos os olhos. Sob o microscópio anatômico com iluminação, sutura as pálpebras. Faça cerca de quatro pontos.
Faça de dois a três nódulos do fio. Aplique três microliters de cola de secagem instantânea 502 na cabeça do nó para aumentar a estabilidade do nó. Em seguida, corte o fio tão curto quanto.
Quando o rato estiver totalmente acordado, coloque-os em uma gaiola separada. Antes da gravação eletrofisiológica, use isoflurane para anestesiar o rato. Remova os pontos e exponha o globo ocular.
Aparar cuidadosamente a pálpebra. Lave os olhos com soluções de lentes de contato e verifique os olhos em busca de clareza. Apenas o mouse com boa condição dos globos oculares pode ser usado.
Depois de anestesiar o mouse, coloque o mouse em uma moldura estereotaxic. Use uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante todo o procedimento. Aplique a pomada ocular na superfície dos olhos para mantê-la úmida.
Remova o cabelo do rato para expor sua pele. Incisar uma área de oito milímetros multiplicada por oito milímetros de área da pele entre ambas as orelhas para expor o crânio e remover o tecido do couro cabeludo. Em seguida, remova o tecido conjuntivo sobrelado com peróxido de hidrogênio.
Faça um buraco no crânio acima do cerebelo. Fixar um pequeno parafuso ósseo no orifício como referência. Realize uma pequena craniotomia de um milímetro de diâmetro na região binóculo V1.
Remova cuidadosamente o fragmento do crânio sem ferir o cérebro. Cubra a superfície cortical exposta com 2% de agarose para evitar a secagem. Fixar um eletrodo de tungstênio no quadro estereotaxic.
Coloque o eletrodo de tungstênio verticalmente na região do binóculo V1 para garantir que as células que são registradas reagem aos dois olhos. O estímulo é separado por 30 graus em um bloco aleatório. Foram apresentados de três a cinco blocos em cada medição.
Mascarar um olho com placa de plástico não transparente. Apresentar LCD1 para posicionado em 23 centímetros dos olhos do mouse. Avanço microelerode lentamente pelo micromanipulador hidráulico de óleo.
Pare o sinal de alta relação de ruído do sinal quando o eletrodo for avançado para a camada quatro e inicie a medição. Amplificamos as atividades de pico a um fator de 1.000 e filtramos de 300 a 10 kilohertz e depois amostramos a 40 kilohertz. Em seguida, mascarar o outro olho e medir a resposta do olho contralateral.
Sinais medidos por eletrodos únicos são atividades populacionais. Use software para separar picos de diferentes células. Primeiro, filtrar o sinal de 500 a 5.000 hertz.
Coloque dois cursores, um para deflexão positiva e outro para picos negativos de deflexão. Configure modelos de espetos. Defina a área de modelos onde apresenta a maior variação entre diferentes classes de picos.
Use a análise dos componentes principais para separá-los em clusters. Classificar os picos de um limite usando o algoritmo k significa. Correlacionar a orientação com a taxa de disparo de picos e traçar as curvas de ajuste de orientação para os olhos ipsilaterais e contralaterais.
Em seguida, calcule o índice OD para células únicas que representam a resposta contralateral e ipsilateral Atribua um escore de OD para cada célula de acordo com o índice OD. Calcule o índice de viés contralateral de acordo com a fórmula. Este diagrama mostra as curvas de ajuste de orientação do olho ipsilateral e contralateral em camundongos monoculares privados e sem privação.
Este protocolo permite uma privação visual monocular bem sucedida e a medição de dominância ocular de um rato privado e não privado em período crítico. Acabamos de mostrar como realizar este experimento e analisamos a mudança na dominância ocular durante a privação visual. Durante o experimento, é importante evitar a infecção no processo de sutura e interação durante o registro eletrofisiológico.
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