Os autores gostariam de agradecer a E. de la Rosa e AI Valenciano para ajuda inicial com o estabelecimento das culturas organotípicas e U. Laub e U. Gerster para assistência técnica.

Todos os equipamentos e reagentes têm de ser comprados estéril ou deve ser de calor ou vapor esterilizado ou esterilizado com ETOH 70%. Os autores afirmam que experiências em animais foram realizados de acordo com as Comunidades Europeias Directiva do Conselho (86/609/CEE), seguindo as orientações do NIH sobre o cuidado e uso de animais em procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo animal Institucional Cuidado e Uso Committee (IACUC) da Universidade de Duisburg-Essen (Alemanha). Parte 1: Enucleação de olhos murino de diferentes estágios de desenvolvimento Enucleação dos olhos embrionárias <ol><li> Acasalamentos tempo grávidas são criados e na manhã do dia em que um plug vaginal é detectado em acasalar fêmeas é designada 0 dias de gestação. </li><li> A fêmea grávida, foi sacrificado por deslocamento cervical quando o desenvolvimento dos embriões chegou ao estágio desejado (aqui: dia embrionário (E) 15) e fixado em uma placa de cera 6. </li><li> A parede abdominal é umedecido com ETOH 70%, corte ao longo da linha média e os retalhos cutâneos são fixados lateralmente por pinos 6. </li><li> O uterusses são removidos do abdômen, individual e transferidos para um copo com PBS frio 6. </li><li> Os embriões são separados, transferidos para uma placa de Petri e parede do útero e as membranas embrionárias são removidos cuidadosamente pelo uso de fórceps 6. </li><li> Embriões são mortos por decapitação. </li><li> Olhos são enucleados ser o uso da multa, fórceps curvos, &quot;descascar&quot; os olhos da órbita ocular. </li></ol> Enucleação dos olhos pós-natal e adulto <ol start="1" type="1"><li> Filhotes jovens são mortos por decapitação, filhotes e adultos por deslocamento cervical. </li><li> Até estágio pós-parto P15, o ponto de tempo em ratos abrir os olhos, fendas dos olhos tem que ser mecanicamente aberta pelo uso de fórceps e alargada por dois cortes transversais das pálpebras com uma tesoura de mola. </li><li> Olhos são enucleados com a ajuda de uma pinça curva, aplicando a pressão à órbita. </li></ol> Nota: Em dia pós-natal 2, os ossos ainda estão orbital cartilaginoso, é importante para não aplicar pressão demasiada ao tentar remover os olhos. Pelo contrário, nos ratos adultos, os ossos são firmes orbital. Assim, a fim de enuclear os olhos é suficiente para aplicar pressão à órbita sem aumentar as fendas dos olhos de antecedência. Parte 2: Dissecção da embrionário, pós-natal e adulto retinas murino Dissecção das retinas <ol><li> Os olhos são colocados em uma placa de Petri pequena com PBS estéril e as camadas ao redor dos olhos são removidos sob um microscópio de dissecação. </li><li> Para remover as camadas externas do olho, em estágios pós-natal e os olhos de adulto, o nervo óptico tem que ser cortado com a ajuda de uma tesoura de mola ou off prensado por fórceps tão perto da base quanto possível. </li><li> Por sua vez o olho, de modo que a parte de trás com o buraco onde o nervo óptico originalmente residiam é voltado para você. Entrar no espaço sub-retiniano entre retina e epitélio pigmentar com as pontas de dois pinça muito fina a partir do local onde o nervo óptico penetraram as camadas do olho. Nota: Normalmente, o epitélio pigmentar pode ser facilmente identificado por sua cor escura. Em algumas linhagens de camundongos mutantes - especialmente em animais albinos - esta camada de pigmento pode, no entanto, não ser coloridas e, portanto, não podem ser facilmente detectar. </li><li> Remover o epitélio pigmentar com a membrana coróide e esclera associadas com cuidado rasgando para ambos os lados com as duas pinças. </li><li> Descolar as camadas até o nível da córnea, em seguida, vire o copo olho para o lado da lente e retire a córnea, juntamente com epitélio pigmentar, membrana coróide e esclera, enquanto segurando o copo restante da retina pelo fórceps outros. </li><li> Segure o vítreo, juntamente com a lente pequena e enquanto rasgando com uma pinça, mantenha o wholemount retina no lugar com a pinça segundo. Nota: Ao dissecar os olhos embrionárias, certifique-se de remover completamente o triangular, barraca-como plexo capilar debaixo do corpo vítreo, juntamente com o vítreo. No olho do adulto, o vítreo precisa ser compreendido nas laterais e cuidados tem que ser tomado para não furar o vítreo com as pontas do fórceps como seu conteúdo é viscosa e adere ao fórceps, o que dificulta a sua remoção. </li><li> Para a cultura wholemount organotípicas os copos da retina são coletados em uma placa de 96 poços contendo 200 meio modificado Dulbecco águia mL (veja abaixo). </li></ol> Nota: Entre dissecação de retinas individual, manter o prato de coleta de 96 poços contendo meio de cultura na incubadora como o pH do meio de cultura é desencadeada por CO 2, através do sistema carbonato. Parte 3: wholemount organotípicas murino da retinacultura <ol><li> Prepare 500 ml de cultura por meio modificado ponderação 7.8g Dulbecco águia / mistura de nutrientes HAM F-12 (DMEM) e NaHCO 3 0,6 g e dissolver tanto em água MiIliQ. Ajustar o pH a 7,15. Adicionar 50mg apo-transferin, 50μl putrescin (stock: 60mg/ml), 50μl selenito de sódio (stock: 52μg/ml), progesterona (stock: 60μg/ml), e 2,5 ml de gentamicina (200 mM) sob o capô. Homogeneizar e filtrar através de um filtro superior do frasco. Imediatamente antes do uso adicionar 10μl glutamina (200 mM) por ml de meio de cultura. Nota: Este meio de soro e insulin-livre pode ser armazenado a 4 ° C por até 2 semanas e utilizado para experimentos de indução de apoptose como nenhuma insulina neutraliza os efeitos. Se incubação de wholemounts por mais de 24h é desejada e as taxas de morte celular não será avaliado, soro de insulina (por exemplo, soro fetal bovino; FCS) ou suplementos deve ser adicionado para melhorar as taxas de sobrevivência. </li><li> Antes de iniciar a cultura, a wholemounts da retina são pré-incubadas por 15 min a 37 ° C com 200 mL quente, pH balanceado DMEM contendo hialuronidase 0,5 mg para pré-digerir a hialuronidase contendo interna e externa da membrana limitante da glia M ller células, facilitando a penetração de substâncias aplicadas exogenamente. </li><li> Retinas são transferidos para uma placa de 24 poços, com tão poucos quanto possível hialuronidase e culta como wholemounts organotípicas em 2ml Dulbecco modificado quimicamente definido médio águia. Nota: Para transferir as retinas, use uma pipeta de 1ml e cortar a ponta da pipeta alguns milímetros para alargar a abertura. Para os olhos do embrião, a 200 mL ponta da pipeta é suficiente. As arestas de corte deve ser alisado por inserção e torção de uma ponteira segundo. Por 24-48 horas a curto prazo as culturas, todas as etapas podem ser executadas no banco, mas se a contaminação das culturas passa a ser um problema, deve-se trabalhar sob o capô. </li><li> Culturas são mantidos por 24-48 horas a 37 ° C em uma atmosfera de 5% CO 2 e, por exemplo submetidos ao tratamento farmacológico com fatores recombinantes. </li></ol> Parte 4: A dissociação de culturas de retina wholemounts <ol><li> Após o tempo de cultura desejada, retinas são coletados em tubos Eppendorf de 2 ml com fundo redondo contendo 850 mL PBS e 50 ul de soro bovino albumina (BSA; 30 mg / ml). </li><li> Coloque os tubos Eppendorf com retinas em um bloco de aquecimento, aquecido a 37 ° C. </li><li> Adicionar 25 mL de colagenase (200 U / ml) e 25 mL de hialuronidase (20mg/ml) a cada tubo Eppendorf e começar a dissociar as retinas em suspensão única célula por 3 passa através de uma pipeta Pasteur siliconizada. </li><li> Adicionar 10 mL de tripsina (1mg/ml), espere por 3-5 min, e então lentamente pipeta 3-5 vezes para cima e para baixo com siliconizado pipeta Pasteur mecanicamente dissociar o tecido. </li><li> Adicionar 10 ml DNase I (5mg/ml), mais uma vez esperar por 3-5 min, em seguida, lentamente pipeta 3-5 vezes para cima e para baixo com siliconizado Pasteur pipeta. Nota: O tempo de incubação para dissociação enzimática varia e depende do tamanho dos olhos e do estágio de desenvolvimento, respectivamente. Verificar o estágio de digestão enzimática do tecido com cuidado pipetando cima e para baixo. </li><li> Se a suspensão de células não é homogênea por agora, mas ainda contém agregados de células grandes, adicione tripsina adicional de 10 mL e 10 ml DNase I. </li><li> Quando a suspensão de células é homogênea, a digestão do tecido é interrompido pela adição de 10 mL de EDTA (0,5 M), tubos Eppendorf são removidos do aquecedor e as suspensões de células são fixadas por 1h pela adição de 1 ml, paraformaldeído gelo fresco frio de 8% (PFA) em temperatura ambiente em um agitador de rotação. </li></ol> Parte 5: Lavagem de suspensões de células dissociadas <ol><li> A suspensão celular é centrifugado por 5 min a 4 ° C e em 0,2 rcf em uma centrífuga de resfriamento. </li><li> O sobrenadante é descartado eo pellet é ressuspenso em 1ml de PBS contendo 3mg/ml BSA. </li><li> Depois de repetir essas etapas de lavagem duas vezes, a pelota é, finalmente, re-suspenso em 500 mL de PBS contendo 3mg/ml BSA, EDTA 5mM e azida de sódio a 0,1%. </li></ol> Nota: A adição de ácido de sódio permitir o armazenamento da suspensão celular por vários dias a 4 ° C. No entanto, se uma coloração imunocitoquímica se seguirão, não adicionar ácido de sódio para o buffer de ressuspensão, pois isso resulta em perda de qualidade de coloração. Parte 6: Cytospin de células em suspensão de apoptose e análise quantitativa da proliferação <ol><li> A lâmina de microscópio fosco-end, um filtro cytospin com um ou dois furos e um funil cytospin são inseridos em um clipe de slides cytospin. O clipe de slides é fechada e posicionada no rotor cytospin. </li><li> A suspensão de células dissociadas é homogeneizada suavemente pipetando para cima e para baixo. Nota: Dependendo do estágio de desenvolvimento da retina, a suspensão de células a partir do procedimento de dissociação pode precisarser diluído com PBS para obter um número contável de células. </li><li> Uma alíquota (100 ml) da suspensão de células é aplicada a um funil cytospin. Nota: Quando pipetar a suspensão celular para o funil, a ponta da pipeta deve atingir todo o caminho até o fundo do funil. É importante não avançar com o ponto de pressão segundo a pipeta, pois isso cria bolhas de ar, que será visível no local de células após a cytospin e dificulta a contagem de células. </li><li> A suspensão de células é avistado em uma lâmina de 700 rpm por 7 min. </li><li> Para a determinação do efeito de fatores exógena aplicada sobre os níveis de apoptose de células podem ser marcadas com 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 2μg/ml), montado com fluorescentes meio de montagem. Mudanças na apoptose de células pode ser determinada através da contagem, pelo menos, 1000 células (que compreende pelo menos 10 núcleos picnóticos) nos pontos de células cytospin ea taxa de morte celular é calculada como porcentagem de células contagem total de 3,4. Nota: Como alternativa, a distribuição de núcleos apoptóticos podem ser avaliados em flatmounts 3 ou criostato sections4 de culturas de retina por wholemounts TdT mediada rotulagem final dUTP nick (TUNEL). </li><li> Para a detecção de proliferação celular, BrdU (5 mM) pode ser adicionado 6h antes do fim da cultura e da incorporação de BrdU visualizado em cytospins de homogenatos de células através de coloração imunocitoquímicos usando um anticorpo anti-BrdU (por exemplo, do Desenvolvimento Estudos Hibridoma Bank, Iowa, EUA). </li><li> O efeito do tratamento em diferentes tipos de células da retina pode ser visualizado na cytospins por anticorpos específicos, como o neurônio Brn3a (marcador de células ganglionares) ou opsina (fotorreceptor marcador) e contracoloração com DAPI. </li></ol> Parte 7: Resultados Representante <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1: Passos na preparação de murino organotípicas wholemounts da retina A Chefe do mouse com ambos os olhos. B olho murino com o lado lente para cima, todas as camadas ainda no lugar. C olho murino da parte traseira com o nervo óptico ainda ligado. D olho murino com esclera e epitélio pigmentar parcialmente removida. E retina murino com epitélio da córnea, esclera e pigmento completamente removido, mas cristalino e vítreo ainda no lugar. F copo retina murino wholemount com lente e vítreo removido. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figura 2" /> Figura 2: Análise de organotípicas retina culturas wholemount por cytospin e seções Para a análise da apoptose, cytospins de suspensões de células dissociadas estão manchadas pelo DAPI e núcleos picnóticos podem ser distinguidos pela fragmentação nuclear ou condensação da cromatina (setas em A). Alternativamente, as seções wholemount (CE, dia retina de camundongos pós-natal (P) 2) ou flatmount retina (F) pode ser submetido a um ensaio de TUNEL e contrastado com DAPI (E). O efeito do tratamento em diferentes tipos de células da retina pode ser visualizado na cytospins por anticorpos específicos de neurônios, como o marcador de células ganglionares Brn3a (setas em B) GCL, camada de células ganglionares;. INL, camada interna em potencial nuclear. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

A vantagem de 2-5 murino organotípicas culturas de retina wholemount mais de dissociação, monocamada, retinospheroid ou re-agregados 3D culturas esferóide 1 encontra-se na preservação de interações e conexões neuronais, simulando a situação in vivo. Em comparação com os relatórios anteriores 2, o nosso artigo de vídeo oferece uma demonstração detalhada das peculiaridades em enucleação dos olhos murino e dissecção de retinas de diferentes estágios d...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

Ablações alvo de genes e análise de modelos animais é a estratégia clássica para se matricular a função do gene específico da retina. No entanto, transgênicos, modelos de mouse retina específicos ou condicional knockout freqüentemente exibem letalidade precoce ou sofrem de malformações graves, impedindo uma análise para além embrionárias ou início de estágios pós-natal. Cultura de células primárias é uma alternativa para investigar os efeitos da aplicação exógena fatores recombinantes, superexpressão de genes ou siRNA mediada knockdown do gene em um ambiente controlado. Cultura de células dissociadas tem a vantagem de que os sinais endógenos atingindo as células-alvo são reduzidos, facilitando assim a identificação de exogenamente efeitos desencadeados após manipulação farmacológica. No entanto, importantes interações célula-célula são inicialmente destruída por digestão enzimática ou dissociação mecânica, mesmo se re-agregados culturas retinospheroid 1 são utilizados. Pelo contrário, organotípicas retina culturas wholemount fornecer um sistema próximo ao fisiológico situação in vivo com as interações e conexões neuronais 2-5 ainda preservada. Neste artigo apresentamos uma video passo a passo de demonstração (1) o estabelecimento de in vivo da retina-como organotípicas culturas wholemount incluindo peculiaridades dissecção da embrionárias, pós-natal e adulto olhos murino e (2) um procedimento de dissociação e cytospin para análise de neuronal apoptose e proliferação das células da retina em wholemounts organotípicas, por exemplo, após a cultura na presença de fatores aplicada exogenamente recombinante.

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In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Este artigo vídeo demonstra o estabelecimento de culturas de retina organotípicas wholemount e um procedimento para análise de cytospin exogenamente efeitos induzidos. Organotípicas retina culturas wholemount imitar o<em&gt; In vivo</em&gt; Situação e facilitar consideravelmente a acessibilidade dos retinas murino para manipulações experimentais, contornando as desvantagens de clássicos modelos animais murino.

In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

in-vivo-like-organotypic-murine-retinal-wholemount-culture

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

17.7K visualizações.  University of Duisburg-Essen. Este artigo vídeo demonstra o estabelecimento de culturas de retina organotípicas wholemount e um procedimento para análise de cytospin exogenamente efeitos induzidos. Organotípicas retina culturas wholemount imitar o In vivo Situação e facilitar consideravelmente a acessibilidade dos retinas murino para manipulações experimentais, contornando as desvantagens de clássicos modelos animais murino.

Vídeo: In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Cultura organotípicas de Retina Coelho Adulto

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Biologia

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

De célula inteira Recordings of Light Evocados Excitatórios Correntes Synaptic na Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissecção eficiente e cultura de células epiteliais de pigmento de retina do rato primário

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Cultura Primária de Células Epiteliais do Pigmento da Retina Suína

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...