Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenções HL44485 e HL28607.

Declaração de Ética: Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional. 1. Fabricação preliminar de Micropipetas, contenção e bloqueadores <ol><li> Puxar vários tubos capilares de vidro de borosilicato limpas ao meio usando um extractor de electrónica ajustada de modo que, quando puxado, a parte alongada do tubo é de cerca de 1 cm de comprimento e as duas metades são um tanto simétrica. Certifique-se de que a vela é coerente com as dimensões em Figura 1. Use as duas metades para micropipetas, limitadores e bloqueadores. <ol><li> Bevel as micropipetas usando um rebolo ar impulsionado 30 com 0,5 um papel abrasivo banhado com água. Definir o ângulo do suporte de micropipeta de modo que é cerca de 30 graus a partir da horizontal. </li><li> Lave e seque as micropipetas usando sucção para puxar acetona limpa através da ponta e até o eixo. Inspecionar as micropipetas (Figura 1A), utilizando um pequeno microscópio vertical com 4 × 40 × objectivos e equipados com um titular micropipeta jacaré e um retículo ocular. </li><li> Seleccione micropipetas com abertura da ponta cerca de 50 um longo com um chanfro cuja relação comprimento / largura é de entre 3,1 e 3,5 e com um ponto agudamente afilada o que ajuda a penetrar nas fibras de colágeno difíceis no mesentério. </li><li> Armazenar 15-20 micropipetas de tamanhos ligeiramente diferentes em uma caixa livre de poeira. </li></ol></li><li> Faça limitadores utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segurar um tubo capilar de vidro removido brevemente perto de uma microflame para formar uma extremidade romba (Figura 1B). Armazenar vários em uma caixa livre de poeira. </li><li> Faça microoccluders utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segure um tubo capilar puxado sob uma microflame e dobre (usando um adaptador de tubulação, por exemplo., 23G), a ponta fina (cerca de 4 mm a partir da ponta) para fazer um ângulo de cerca de 120 graus para o eixo ( <sTrong&gt; Figura 1C). Fazer e armazenar vários. </li></ol> 2. Preparação animal e Cirurgia <ol><li> Anestesiar ratos fêmea Sprague-Dawley macho (350-450 g) ou (200-300 g) com pentobarbital de sódio (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761), por injecção subcutânea; proteger o mesentério, não utilizando injecção intraperitoneal. </li><li> Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, manter a anestesia por injecções suplementares (30 mg / kg), conforme necessário. Determinar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé ou reflexo da córnea. Após a conclusão do procedimento experimental, a eutanásia através de sobredosagem de pentobarbital de rato ou injecção intra-cardíaca de cloreto de potássio saturado, sob anestesia. </li></ol> 3. Prepare Soluções e Erythrocytes para uso como marcadores de fluxo <ol><li> Preparar a solução de Ringer de mamífero para a solução de controlo e superfusate perfusato (solução de Ringer contendo 10 mg / ml de ácido gordo de mamífero normalmentealbumina livre de soro bovino, BSA). <ol><li> Perfusato filtro através de 0.2 mm filtros de seringa para remover partículas minúsculas que podem bloquear a ponta micropipeta; filtrar para pequeno recipiente limpo. </li></ol></li><li> Prepare eritrócitos por tiragem de cerca de 0,2 ml de sangue a partir da veia da cauda do rato anestesiado em uma agulha 20G num pequeno seringa contendo 0,05 ml de heparina (1000 U / ml) e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo cerca de 14 ml de mamífero solução de solução de Ringer . <ol><li> Centrifugar para embalar suavemente as células vermelhas (cerca max 200 x g durante 7 min). Empate fora o sobrenadante e re-suspender as células vermelhas em solução de Ringer. </li><li> Após centrifugação e remoção do sobrenadante, três vezes deixar os glóbulos vermelhos no fundo do tubo para uso posterior. Note-se que este processo reduz as plaquetas em perfusatos finais para menos do que 0,1% dos níveis normais de 31. </li></ol></li></ol> 4. Organizar o tecido no animalBandeja <ol><li> Raspar o abdome do rato anestesiado abaixo do umbigo ao apêndice xifóide. Assegure-se que a área raspada se estende em torno do lado direito (para o rato colocado no lado direito), de modo que o cabelo não se forma um pavio para desenhar o superfusate fora do tecido bem. Remover cabelos cortados com uma gaze molhada ou tecido. <ol><li> Segurar a pele com uma pinça sem corte serrilhada e fazer uma incisão no centro da linha (2-3 cm de comprimento) através da pele utilizando uma tesoura resistentes. Usando uma multa (íris) tesoura fazer uma incisão semelhante através da linha alba, levantando a parede abdominal com uma pinça serrilhada para evitar danos ao intestino. </li><li> Com o animal em seu lado na bandeja do animal, puxe cuidadosamente o intestino a partir da cavidade abdominal utilizando aplicadores com ponta de algodão (vara de madeira) embebidos em solução de Ringer e uma pinça sem corte serrilhadas. Organizar o intestino no tecido bem para que o mesentério é estendida sobre o pilar para visualização através do microscópio tendo o cuidado de evitar tocar o mesentério (potentially danificar microvasos), quer com fórceps ou algodão. Nota: O tabuleiro do animal (Figura 2A) pode ser construído a partir de Plexiglas e requer um tecido bem (aproximadamente 3 mm de profundidade), uma coluna opticamente transparente (por exemplo, quartzo polido cerca de 2 cm de diâmetro e 5 mm de altura.), E uma almofada de aquecimento ajustada para manter a temperatura do animal. A espessura do pilar não deve exceder a distância de trabalho do objectivo. </li></ol></li><li> Posição da bandeja do animal sobre a platina do microscópio de modo que o mesentério é visível através das oculares. </li><li> Posicione uma linha de gotejamento alimentado por gravidade para superfuse continuamente o mesentério com solução de Ringer de mamífero mantida a 35-37 ° C. Use compressas de gaze para manter o intestino no lugar, ajudar a reter a umidade, e pavio excesso de solução de Ringer fora da superfície. Ajustar o fluxo e aspirar o efluente para manter uma espessura superfusate consistente. </li><li> Identificar alvo microvasos venulares, que sãonão ramificados segmentos a jusante do fluxo convergente, um ou dois ramos distais aos verdadeiros capilares. Encontrar um vaso não ramificada (de preferência, 600 a 1000 um de comprimento) com o fluxo de sangue livre e rápida de células brancas que furam na parede do vaso. </li><li> Posicionar o teste de microvasos no centro do campo do microscópio e mover o limitador para a posição perto do sítio de canulação escolhido. </li></ol> 5. Preencha Micropipeta e Monte em Detentor <ol><li> Pouco antes da canulação, suspender as células vermelhas no perfusato. Adicionar 7 ul de eritrócitos a 0,5 ml de perfusato em um tubo de ensaio limpo borosilicato. Nota: hematócritos de 1-3% pode ser usado, mas hematócrito consistente levará a concentrações de perfusão consistente de qualquer substâncias libertadas a partir das células vermelhas. </li><li> Caber numa seringa de 1 ml com um adaptador de tubulação de 23G e PE 50 tubos (5-15 cm de comprimento). Desenha-se a mistura de células do perfusato / vermelho para dentro da seringa. Inverta a seringa para misturar e expulsar todas as bolhas de tubulação eadaptador. Para maior eficiência, ajuste tubulação para várias seringas antes do experimento começa e mantê-los em uma caixa livre de poeira ou saco plástico. </li><li> Encher a micropipeta com o avanço do tubo na extremidade mais larga da micropipeta até a mesma se encostar a região cónica. Aplicar um empurrão rápido suave sobre o êmbolo da seringa para encher a ponta da micropipeta. Nota: Um pequeno córrego ou uma gota deve ser visível na ponta para comprovar o preenchimento completo. </li><li> Retirar o tubo enquanto empurrando suavemente o êmbolo para preencher a parte mais larga do eixo micropipeta. Remover pequenas bolhas no grande eixo sacudindo cuidadosamente o eixo micropipeta. Nota: Um procedimento semelhante foi ilustrado 32. </li><li> Coloque a micropipeta em um suporte da pipeta com uma porta lateral que permite uma ligação de fluido contínuo a um manómetro de água. Assegure-se que o suporte, o qual está ligado a um accionamento hidráulico usado para controlar o avanço muito fina da micropipeta, é com um ligeiro ângulo (15-25 °)com a horizontal, de modo que a aresta do cone micropipeta não atingiu o intestino ou o tabuleiro. </li><li> Montar a unidade hidráulica de um micromanipulador móvel, que tem x, y, z e unidades para permitir alinhamento próximo ao recipiente de ensaio (Figura 2). </li><li> Ajustar a pressão hidrostática aplicada ao fluido na micropipeta com uma seringa ou ampola de borracha cheio de água, para alterar a altura do fluido na coluna de água do manómetro de cerca de 40 cm H 2 O acima do mesentério. </li><li> Canular o de microvasos, logo que possível depois de encher a pipeta; células vermelhas assentar no fundo da pipeta, de modo que após cerca de 40 min muito poucas células vermelhas irá fluir para o vaso. </li></ol> 6. Microcannulation e microvasculares Medição Pressão <ol><li> Antes de posicionar a micropipeta preenchido sob o microscópio, pressione suavemente a restrição sobre o tecido perto do microvasos aplicar força suficiente para segurar o tecido. Desenhe olimitador de volta, que se estende ligeiramente o tecido de acordo com o de microvasos, de modo que as tensões nas fibras de colagénio mesentéricos são alinhados com o navio. <ol><li> Alinhe a micropipeta com a embarcação e abaixe-o na vista através das oculares. Colocar a ponta imediatamente a montante do sítio de canulação escolhido e colocá-la sobre o tecido, de modo que possa obstruir parcialmente o fluxo no interior do recipiente, mas isso não ocluir. </li></ol></li><li> Canular o navio dirigindo a ponta da pipeta lentamente para o lúmen do vaso usando a unidade hidráulica. Ter cuidado para não apertar através do lado inferior do recipiente. Observação: Como a micropipeta entra no lúmen, o perfusato lava-se rapidamente o sangue no vaso para fora do lúmen e flui livremente perfusato em circulação distal do animal ao teste de microvasos, deslocando algumas das perfusão normal do sangue nos vasos jusante. </li><li> Diminuir a pressão de perfusão, ajustando o manómetro até que o sangue (conforme indicadopelas células vermelhas do animal) é atraído de volta para o segmento de perfusão; esta determina a pressão de equilíbrio onde os glóbulos vermelhos oscilar suavemente no lúmen do vaso e mede a pressão hidrostática de microvasos (P C) na extremidade distai do segmento de microvasos. Manter a perfusão navio em todas as pressões acima essa pressão equilíbrio. </li></ol> 7. Microocclusion e Coleta de Dados <ol><li> Passo opcional: Antes de usar o micro-oclusor para bloquear o recipiente, que pressiona para o tecido numa zona não utilizada de mesentério longe de qualquer recipiente de modo que a ponta se acumula uma fina camada de tecido que protege o recipiente experimental durante micro repetido oclusões. </li><li> Colocar o bloqueador de cima do vaso perfundido perto da borda inferior do campo do microscópio. </li><li> Grave o seguinte com vídeo e áudio. <ol><li> Verbalmente registar a localização do sítio de bloqueio e o bordo inferior da tela, como visto no retículo ocular. </li><li> Com a pontado bloqueador colocado imediatamente acima do de microvasos, utilizar o controlo Z fina do micromanipulador para diminuir suavemente o bloqueador até que o fluxo no vaso está ocluso. Observe a pressão do manômetro (P c) em áudio. Aplicar oclusão normalmente para 3-10 segundos e solte, restaurando a perfusão livre. Mover o site quadra até o navio em direção à ponta da pipeta em 5-10 mm etapas com base no tempo (&gt; 5 min após o bloco inicial em um site), número de oclusões (3-5), para evitar danos da parede do vaso no local bloco . </li></ol></li></ol> 8. Análise de Dados e Medição da L p (de água) <ol><li> Durante a reprodução de vídeo, determinar a distância inicial (ℓ 0) a partir de um marcador de células vermelhas para o local de oclusão através da utilização de uma imagem de um micrómetro de plataforma e as posições conhecidas sobre as imagens. Determinar a velocidade inicial (dl / dt) da célula de marcador a partir da sua posição em vários quadros durante a 3-10 segundos de imagens gravadas. Dissuadirmina o raio do vaso (r) a partir das imagens captadas durante a oclusão (Figura 3). </li><li> Calcular J v / S para cada oclusão como (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Calcular G P a uma pressão constante como (J v / S) dividida pela pressão de condução (microvasos pressão - a pressão osmótica colóide eficaz; ver discussão). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Detalhes dos cálculos de L p. Embora o movimento fluido transvascular ocorre enquanto o navio é perfundido livremente, essa troca é pequena demais para ser medido durante a perfusão livre porque é tipicamente menor do que 0,01% da taxa de perfusão navio. No entanto, quando a perfusão é transitoriamente interrompido por oclusão da micro-vasos, o fluxo transvascular (isto é, por filtração) é medido a partir do movimento das células marcador vermelho no lúmen que a coluna de líq...

Microperfusão na vasculatura inclui estabelecer um fluxo de perfusato artificial de composição conhecida controlada através de uma micropipeta em um vaso sanguíneo geralmente menos de 40 um de diâmetro. O recipiente continua a ser perfundido no seu ambiente de tecido normal e é perfundido com sangue do animal até ao momento da punção. Quando usado em conjunto com uma série de imagens de vídeo ou técnicas fluorométricos, em microperfusão situ permite a medição de fluxos de água e de solutos através das paredes de microvasos em condições onde as forças de condução para estes fluxos são conhecidos e as propriedades de permeabilidade da parede vascular podem ser avaliada diretamente. Além disso, por controlo da composição do líquido que rodeia o de microvasos no tecido (perfusado e superfusate), a regulação da permeabilidade microvascular e podem ser investigadas de câmbio, permitindo que as células endoteliais que formam a parede de microvasos para ser exposta a uma variedade de econdições Xperimental (agonistas, condições de perfusão modificados, indicadores fluorescentes para medir a composição e sinalização intracelular) por períodos precisamente medidas de tempo (seg a hr). Além disso, as avaliações ultra-estruturais ou citoquímicos de estruturas moleculares celulares chave que regulam a barreira pode ser investigadas no mesmo microvasos em que a permeabilidade está diretamente medidos. A abordagem assim, forma uma ponte entre a investigação dos mecanismos celulares e moleculares para modificar a função de barreira endotelial em monocamadas de células endoteliais cultivadas e investigação em microvasos intactas. Consulte os seguintes comentários para uma avaliação mais aprofundada 1-6. Uma limitação de microperfusão é que ela só pode ser utilizada em leitos microvasculares que são finas, transparentes e possuem integridade estrutural suficiente para permitir a canulação com uma micropipeta de vidro. Enquanto as primeiras investigações usado microvasos rã no mesentério e fino cutânea pectoris muscle 7,8, de longe, a preparação mais utilizada em modelos de mamíferos é o mesentério de rato 9-15. A maioria das investigações concentraram-se em alterações agudas na permeabilidade vascular estudado ao longo de períodos de 1-4 horas, mas as investigações mais recentes foram estendidos para medições em navios individuais 24-72 horas após uma perfusão inicial 12,16. A tecnologia CRISPR recentemente desenvolvido, que promete tornar mais modelos de ratos geneticamente modificados disponível para estudar regulação da permeabilidade vascular 17 deverá permitir que os métodos descritos na presente comunicação a ser aplicado em microvasos venulares do mesentério nestes novos modelos importantes de ratos. O método requer um microscópio invertido equipado com um estágio de microscópio construído sob encomenda suficientemente grande para conter tanto a preparação dos animais e, pelo menos, três micromanipuladores usadas para microferramentas posição próxima do vaso e perfundidos para alinhar uma micropipeta de perfusão com o naviolúmen. Por exemplo, uma plataforma personalizada para um estágio de microscópio XY (cerca de 90 × 60 cm) pode ser fabricada a partir de uma chapa de aço de 1 cm de espessura com um revestimento à prova de ferrugem. O palco está ligado a uma tabela de índice de engenharia ou duas lâminas de cauda de andorinha montados em ângulos retos e apoiados em pilares de teflon ou transferências bola para o movimento no plano horizontal. Um equipamento típico (ver Figura 2) tem muito em comum com o microscópio e microposicionamento equipamento utilizado para uma série de experimentos microcirculação intravital tais como aqueles para medir o fluxo único dos vasos sanguíneos e hematócrito, entrega local de oxigênio pelo sangue perfusão microvasos, regulação da liso vascular tônus ​​muscular, eo acúmulo microvascular local dos marcadores fluorescentes injetadas em toda a circulação 18-26. O aspecto fundamental da técnica é a medição do volume do caudal (J v) através de uma área de superfície definido (S) da parede de microvasos. Cumpriresta via a técnica Landis modificado aqui descrito um microscópio invertido simples é adequada. Uma pequena câmara de vídeo está montado na porta e o sinal de imagem de vídeo, com uma base de tempo adicional, é apresentada num monitor de video e registadas na forma digital num computador ou como um sinal digital ou analógico de um gravador de vídeo. Uma vez que a microvasculatura é canulada a porção do microvasos visível para a câmara pode ser alterado movendo o palco e manipuladores como uma unidade, sem perturbar a canulação. Medição dos fluxos transvascular pode também ser combinado com investigações mais detalhadas, utilizando um microscópio de fluorescência com filtros adequados sofisticados, tais como sondas utilizadas para as medições de permeabilidade soluto, fluorescente monitorização relação de cálcio citoplasmático ou outros mecanismos celulares, e imagiologia confocal 6,12,13, 27. Uma das principais vantagens de todas as abordagens microperfusão é a capacidade de fazer medidas repetidas, no mesmo navio, Sob a mudança controlada de força motriz, tais como pressões hidrostática e oncótica, ou mudança induzida em respostas dos vasos para condições inflamatórias. O design mais comum é uma comparação pareada da condutividade hidráulica medida (L p) no mesmo navio com o primeiro recipiente de perfusão através de uma micropipeta preenchido com um perfusato controle e suspensão de eritrócitos para estabelecer um estado permeabilidade da linha de base, em seguida, com uma segunda pipeta com o agente de teste adicionado ao perfusado. Várias cânulas são possíveis com o ciclo repetido após reperfusão, com a pipeta de controle. O presente protocolo demonstra a canulação e microperfusão de um navio venular em mesentério de rato para gravar fluxos de água através da parede de microvasos e medir a G P da parede do vaso, um índice útil da permeabilidade da via comum para a água e os solutos através da intacta barreira endotelial. O procedimento é chamado de techniq Landis modificadoue porque o princípio original Landis de utilizar o movimento relativo de células vermelhas como uma medida de troca de fluido transvascular após perfusão é bloqueado é preservada 28, mas a gama de condições experimentais (por exemplo, as diferenças de pressão oncótica hidrostáticas e albumina através da parede de microvasos) disponível depois de microperfusão é muito maior do que no sangue perfusão microvasos canulados 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

As experiências para medir as propriedades de permeabilidade dos microvasos perfundidos individualmente fornecer uma ponte entre a investigação dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a permeabilidade vascular em monocamadas de células endoteliais em cultura e as propriedades de leitos microvasculares inteiros câmbio funcionais. Um método para canular e perfundir microvasos venulares de mesentério de ratos e medir a condutividade hidráulica da parede de microvasos é descrito. O principal equipamento necessário inclui um microscópio intravital com um palco modificado grande que suporta micromanipuladores para posicionar três microtools diferentes: (1) uma micropipeta de vidro chanfrado de canulação e perfundem o microvasos; (2) um micro-vidro oclusor para bloquear temporariamente a perfusão e permitir a medição de transvascular movimento fluxo de água a uma pressão hidrostática medida, e (3) uma vareta de vidro fechado para estabilizar o tecido mesentérico ao sítio de canulação. A Landis micro-oclusão techniq modificadoue utiliza células vermelhas suspensas no perfusato artificial como marcadores de circulação de fluido transvascular, e também permite medições repetidas destes fluxos condições experimentais são alteradas e diferença de pressão osmótica e hidrostática colóide através dos microvasos são cuidadosamente controlados. As medições de condutividade hidráulica primeiro usando um perfusado de controlo, em seguida, após a re-canulação da mesma microvasos com os perfusatos teste permitir comparações de resposta de microvasos sob estas condições bem controladas emparelhado. As tentativas para alargar o método de microvasos no mesentério de ratos com modificações genéticas que se espera modificar a permeabilidade vascular foram severamente limitada, devido à ausência de microvasos compridas rectas e não ramificados no mesentério do rato, mas a recente disponibilidade dos ratos com modificações genéticas semelhantes usando CRISPR tecnologia / Cas9 deverá abrir novas áreas de investigação onde os métodos aqui descritos podem ser aplicados. </p&gt;

A Figura 4 mostra os resultados da medição do curso de tempo das alterações no G P num rato venular microvasos canulada sucessivamente com quatro perfusatos. 33 A magnitude de L p calculado a uma pressão constante foi usada como uma medida de mudanças na microvasos permeabilidade da parede, primeiro no estado de controlo com um perfusato contendo 1% de albumina de soro bovino, em seguida, quando o recipiente foi exposta ao agente inflamatório bradicinina (BK) atra...

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Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K visualizações.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Vídeo: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Preparação de 2-dGuo-Tratada Culturas Organ Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biologia

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissecção e coloração de Drosophila Larval Ovários

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usando Seqüência de Detenção SECM como uma ferramenta para isolar Ribossomos Polipeptídeos encadernados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

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