Apoio financeiro para a maioria dos estudos foi fornecido pelo sueco Medical Research Council (concessão 5942).

1. Animais <ol><li> Pequenos roedores, como ratos, ratos e cobaias, foram utilizados como modelos animais. Infelizmente, os ratos adultos (muitas linhagens de camundongos foram avaliados) tendem a falta ou ter apenas um número muito baixo de potencial de pais microvasos (a partir do qual a angiogênese pode originar) dentro de suas janelas mesentérica, que faz estudos com ratos não-confiáveis. Portanto, o ensaio foi desenvolvido principalmente para ratos. </li><li> Os ratos, que são aclimatadas a um ambiente padrão para pelo menos 7 dias após a entrega do criador, são geralmente alojados em pares em uma gaiola com um padrão de 12 horas de ciclo claro / escuro, com livre acesso à água e pelotas. Cada animal é marcado. Usamos principalmente ratos adultos jovens (normalmente 7-10 semanas de idade de várias cepas, mas geralmente do sexo masculino Sprague-Dawley; em ratos com idade inferior a 5-6 semanas de idade o número de microvasos nativos tendem a ser baixas) obtido a partir de criadores diversos. No período anterior ao experimento e durante todo o experimento, os animais são pesados ​​a cada segundo dia, e sempre no dia do sacrifício. Quando os animais são tratados concomitantemente ip (para indução de angiogênese, veja abaixo) e sc ou iv ou po, eles são pesados ​​a cada dia. Isto permite a criação de grupos experimentais e controle do peso corporal igual no início do experimento, e permite o monitoramento da influência do tratamento sobre o corpo-ganho de peso durante o curso do experimento. Desde ratos machos adultos crescer robustamente fisiologicamente (ganhando cerca de 40-60 g por semana, dependendo do tipo de tensão), ganho de peso retardo é um marcador substituto sensíveis de toxicidade sistêmica, bem-estar, anorexia, e falha prosperar. </li></ol> Nós trabalhamos em uma instituição de cuidados de alto padrão animal e esforços consideráveis ​​são feitos para minimizar os níveis de estresse vivida pelos animais. As diretrizes atuais éticos são aqueles estabelecidos pela Workman P. et al. (Diretrizes para o bem-estar e uso de animais na pesquisa do câncer. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). O Animal Comitê de Ética da Universidade de Gotemburgo aprovou esses estudos. 2. Pró-angiogênicos tratamento intraperitoneal <ol><li> O candidato fator pró-angiogênico a ser testada é dissolvido e diluído no endotoxina livre de soro fisiológico utilizado para infusão de pacientes (mesmo em níveis extremamente baixos, endotoxina é pró-angiogênicos). Todas as soluções são compostas recentemente no dia da injeção, estéril, filtrada (Millipore 0,22 mM-filtração), marcada para pH neutro (7,1-7,3), e usado em temperatura ambiente. O agente de teste é injetado em concentrações baixas ou muito baixas. Por exemplo, rato rVEGF 164 (564-RV/CF; R &amp; D Systems Europe, Ltd., Oxon, Reino Unido), que é o VEGF-A isoforma predominante em ratos, é diluído a 96 pmole / ml em solução salina livre de endotoxina, congelados e descongelado e um volume de 5 ml é injetada ip em ratos. Usamos uma seringa de 5 ml com 0,8 mm-agulha (agulha verde, 21G) para a injeção ip. Este tratamento, administrado duas vezes por dia durante 4,5 dias, ie., De segunda-feira de manhã (Dia 0) a sexta-feira pela manhã (dia 4), ​​induz uma resposta robusta sprouting angiogênese no tecido de teste mesentérica, com pico em torno de dia 21. Administrando o ip solução garante que todo o volume é entregue para a cavidade peritoneal (e não para o intestino, bexiga ou qualquer outro órgão). A injeção rápida de 5 ml permite a confirmação tátil pelo operador que o jato de fluido passou através da parede abdominal para a cavidade abdominal. Seguinte, antes ou concomitantemente com o tratamento pró-angiogênico ip, qualquer agente de teste de escolha podem ser administrados por via sistémica. </li></ol> 3. Administrando sistêmico da angiogênese modulador agentes <ol><li> Qualquer outra via que o ip route pode ser usado, pois o tratamento ip pode afetar a reação em curso angiogênica através da indução da inflamação ou, possivelmente, pela ativação de mastócitos no tecido de teste, que pode levar a uma resposta pró-angiogênico forte. Além de administração oral ou injeção única sc ou iv, muitas vezes usamos sc administração usando minipumps osmótica (um ou mais, com vários volumes e bombeamento vezes) para entregar a solução a uma taxa constante por até duas ou várias semanas. </li><li> Perfusão subcutânea contínua de agentes de teste Enchimento e implantação de minipumps osmótica Normalmente no dia 5, ou seja, um dia após o término do tratamento VEGF ip, minipumps osmótico (por exemplo, Modelo 2ML2, com taxa de bombeamento constante de 5,0 mL / h para 14-15 dias; Alzet Bombas osmótica, Mountain View, CA , EUA) são preenchidos em condições estéreis com o agente de teste ou o veículo apropriado. Após armazenamento em estéril 0,9% (w / v) NaCl durante a noite a 37 ° C, a bomba (s) são implantados cirurgicamente sc nas costas (no lado da colu espinhalmn na região da escápula) de ratos que foram anestesiados com gás isoflurano (Isoba vet; Schering-Plough Animal Health, Merck &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EUA), inicialmente em uma câmara a vácuo transparente e posteriormente, através de uma máscara (para minimizar o stress causado ao animal seguinte, a câmara é lavada com ar antes de ser reutilizado). A incisão na pele feita para implantação da bomba é suturado imediatamente pós-implantação usando fio de seda. Uma vez que os animais ganho de peso fisiologicamente durante o período experimental e os agentes de teste são administrados em uma taxa constante, a dose real selecionado para um teste de drogas por kg de peso corporal é maior do que a dose média no início do período de infusão e é menor do que a dose média ao final do período de infusão. Infusão contínua, como descrito aqui, pode ser visto como uma forma estendida de tratamento metronomic. </li></ol> 4. Acabar com o Experimento <ol><li> Um animal de cada vez é colocado em uma câmara hermética transparente, que é lavada com gás CO 2, que rapidamente se mata o animal. A câmara é lavada com ar antes de ser usado novamente. </li></ol> 5. Amostras de tecido colheita <ol><li> Como mostrado no DVD, a parede abdominal é aberto, eo mesentério do intestino pequeno é identificado, incluindo a parte mais distal, que atinge a válvula íleo-cecal (a junção do intestino delgado e do intestino grosso). Quatro (ou mais) dos mais distais &quot;janelas&quot; são numeradas e espalhado objetivo padrão Superfrost não tratada Plus-slides (DAKO Dinamarca A / S, Glostrup, Dinamarca). É importante evitar, se possível, contaminando as amostras com conteúdo de sangue, tripas ou outros fluidos corporais, como esses materiais podem ser manchadas não especificamente, embora isso não invalida a visualização posterior imuno-histoquímica de microvasos. </li><li> Cada amostra janela mesentérica com o segmento do intestino pequeno é anexado espalhou em um slide e secas à temperatura ambiente por 20 minutos. Então, o coto intestinal é cortado, enquanto os espécimes intactos mesentério membranosa são armazenadas a -20 ° C por períodos prolongados. Isso é mostrado no DVD. </li></ol> Deve-se mencionar que a vasculatura de tecido e de patentes podem ser visualizadas antes da colheita com microscopia de luz transmitida intravital. 6. Protocolo para a coloração imuno-histoquímica de microvasos <ol><li> Dia 0 Os espécimes são permitidos para descongelar de -20 ° C à temperatura ambiente, secas em um armário a 60 ° C por 1 hr, e mantido à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> 1 dia Colocar as lâminas na coloração titulares slide (em cada faixa segundo) em uma tina de coloração e lavar duas vezes com TBS (pH 7,8) por 10 minutos em temperatura ambiente. A solução é descartada e substituída pela próxima solução, e assim por diante para todas as etapas a seguir. </li><li> Tratamento com tripsina Encha a tina de coloração que vai abrigar o suporte de slides coloração com solução de tripsina (25 ° C por 20 minutos). Descartar a solução e incubar duas vezes com solução de sacarose 2,5% (temperatura ambiente por 10 minutos cada tempo). Descartar a solução e lavar um par de vezes em água destilada (temperatura ambiente por alguns minutos cada). </li><li> Bloqueio Encha a tina de coloração que vai abrigar o suporte de slides coloração com 0,5% H 2 O 2 em metanol (temperatura ambiente por 30 minutos). Descartar a solução e enxágüe com água destilada (temperatura ambiente por alguns minutos). Descartar a solução e lavar duas vezes com TBS (pH 7,4) (temperatura ambiente durante 8 minutos de cada vez). </li><li> Incubação Todas as incubações estão em câmara úmida à temperatura ambiente. Aproximadamente 150 mL de cada uma das soluções listadas abaixo são usados ​​por slide. Os slides são colocados em uma câmara úmida e as soluções são pipetadas para os espécimes (as partes não-membranosa não precisa ser coberto pelas soluções). Para cada um dos seguintes passos, cuidadosamente sacudir toda a solução antes que a solução subseqüente é adicionado. <ol><li> Incubação com Normal (bloqueio) de soro (cavalo) (ABC kit) 3 gotas de solução amarela / 10 ml de tampão de diluição por 20 minutos. </li><li> Incubação com anticorpo primário ARU0181, que rotula de ratos células endoteliais vasculares. O anticorpo é diluída 1:600 ​​com tampão de diluição (Biosource) (100 l diluído 40 vezes [frozen] mais 900 mL de tampão de diluição) e incubação ocorre durante a noite a 4 ° C. </li></ol></li><li> Dia 2 Os slides são removidos da câmara úmida, o anticorpo primário é descartado, e os slides são colocados em um compartimento de slides, coloração, que está submersa na tina de coloração e lavadas duas vezes com TBS(PH 7,8) por 8 minutos. <ol><li> Incubação com anticorpo biotinilado (ABC kit) Os slides são colocados horizontalmente em câmara úmida e incubadas com 1 gota de solução de azul / 10 ml de tampão de diluição por 30 minutos. Descartar a solução e colocar as lâminas em porta-lâminas coloração submerso na tina de coloração e enxaguar duas vezes com TBS (pH 7,4) por 8 minutos. </li><li> Incubação com o reagente ABC As lâminas são novamente colocados horizontalmente em câmara úmida e as soluções a seguir são pipetados sobre as partes membranosa das amostras: 2 gotas de solução de laranja mais 2 gotas de solução marrom / 10 ml TBS (pH 7,4) por 30 minutos. Misture com cuidado 30 minutos antes de usar! Descartar a solução e coloque os slides no suporte de slides na tina de coloração e enxaguar duas vezes com TBS (pH 7,4) por 8 minutos. </li></ol></li><li> Coloração com DAB (0,05%) Esta etapa deve ser realizada em uma capela química ventilados! Coloque os slides e adicione o 3,3-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich) solução usando uma pipeta: solução DAB 0,1% em TBS (pH 7,4) [frozen] é diluído 1:1 com uma mistura de 10 ml H 2 O 2 e 7,5 ml TBS (pH 7,4). Esta solução é estéril filtrada imediatamente antes da utilização (para eliminar quaisquer partículas que podem obscurecer a imagem microscópica). Mancha as amostras por 8 minutos. Descartar a solução e coloque os slides no suporte de slides coloração submerso na tina de coloração. Enxágüe em água corrente e depois em água destilada por alguns minutos. </li><li> Desidratação Os slides são mantidos no compartimento de slides coloração. Enxágüe por devoluções e recarga do jar coloração contendo água destilada / etanol: água destilada, álcool 70%, álcool 95%, álcool absoluto, com dois minutos em cada solução. </li></ol> 7. Imagem e Avaliação da Rede Microvascular em cada amostra Janela mesentérica após coloração imuno-histoquímica de células endoteliais vasculares Como mostrado no filme, microvasos são microscopicamente visualizadas in situ no tecido intacto. <ol><li> Primeiro, usamos um microscópio desenho com faixa de ampliação de 14-34 (Leica M Selvagem 3Z) para lápis em papel branco a área de janela inteira, bem como a área vascularizada inteiro (VA) por janela mesentérica. VA, como uma porcentagem de toda a área, é facilmente medida por planimetria computadorizada ou não informatizado (ou simplesmente cortando e ponderação a imagem de toda a janela, e as imagens de todas as suas partes vascularizado). </li><li> Usando outro microscópio desenho, perfis microvascular individuais, que são facilmente identificados, são desenhadas em tinta preta sobre papel branco em 80 de ampliação dentro de campos escolhidos aleatoriamente. Este é o ponto de partida para a avaliação computadorizada subseqüente morfométricas de comprimento microvascular (MVL), que é basicamente uma medida de densidade microvascular. </li><li> Opcionalmente, variáveis ​​relacionadas à formação de padrões microvascular, bem como aqueles para a avaliação do número de brotos microvascular e comprimento de brotos individuais microvascular (No. SP e Le. SP, respectivamente) pode ser determinada. -O contraste entre o ideal representado estruturas vaso preto e fundo branco facilita a análise detalhada das imagens, na maioria dos comerciais morfométricas programas computadorizados. </li><li> Na maioria dos casos, as principais variáveis ​​são VA e MVL, que quando multiplicados juntos geram o comprimento microvascular total (TMVL). </li></ol> 8. Análise estatística Normalmente, usamos o padrão não-paramétrico Mann-Whitney U-teste para analisar unpaired (bicaudal) observações. Uma média de quatro janelas mesentérica por animal é usado como o ponto de dados independentes para cada variável da janela mesentérica. O critério de significância estatística é P ≤ 0,05.

<ol>
	<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+testing+with+angiogenesis+models.">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li><li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast-cell-mediated+angiogenesis:+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery.">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+angiogenesis.">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li><li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+meteronomic+chemotherapy:+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A.">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo.">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li><li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp;amp, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF(165)-mediated+angiogenesis+in+the+rat.">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis.">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li><li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dalteparin,+a+low-molecular-weight+heparin,+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo.">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis.">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O ensaio foi introduzida em 1986 3 e tem sido sucessivamente desenvolvidos e aperfeiçoados em nosso laboratório 7,10-12. Como discutido em artigos de revisão (convidado) 1, 2, o ensaio compara bem com outros mamíferos ensaio in vivo de angiogênese em consideração, nomeadamente, características importantes, como o tecido teste adultos é nativamente vascularizado e carece de angiogênese fisiológica; trauma mínimo, se houver, é infligida ao tecido; variáveis ​​quantitativas realmente são medidos, o que permite análise estatística de som em relação dose-resposta e atividade molecular estudos; angiogênese surgimento ocorre, que é predominante em tecidos normais e tumores, e dados de toxicidade são facilmente acumulada em ratos que crescer robustamente fisiologicamente na idade adulta. Características desfavoráveis ​​podem incluir o fato de que o ensaio é relativamente demorado, especialmente quando se avalia o número ea duração de segmentos individuais microvascular microvascular e brotos, que não permite observações real-time/serial, e que dificilmente é adequado para ratos uma vez que muitas janelas mesentérica em ratos falta microvasos pai potencial a partir do qual pode originar novos capilares. Observações em tempo real, no entanto, habilitado por microscopia intravital onde as janelas exteriorizado, mas ainda intacta mesentérica estão espalhados ao longo de um estágio do microscópio enquanto o animal é anestesiado, como discutido na 1. Avanços significativos na pesquisa da angiogênese foram alcançados nas últimas décadas com modelos como o micropocket da córnea, membrana pinto corioalantóicas e ensaios plug-sc Matrigel, que são ferramentas úteis, mas, em última análise limitada. Futuras aplicações clínicas de terapias anti-angiogênicos e pró-angiogênico exigir o estabelecimento e validação de mais sensível e biologicamente relevantes, verdadeiramente quantitativa modelos pré-clínicos, como o descrito no relatório atual.

Tampões e reagentes 0,5 M solução estoque Tris-HCl (pH 7,8) Tris (hidroximetil) aminomethan (60,57 g) é dissolvido em ~ 900 ml água destilada e ~ 45 ml de HCl 25% (concentrado) é adicionado para atingir pH 7,8, seguido de diluição para 1 litro com água destilada. Tris-buffer salina (TBS, pH 7.8) A 200 ml da solução-mãe é adicionado 18 g NaCl dissolvido em ~ 1800 ml água destilada com ajuste de pH para 7,8 usando solução-mãe, seguido de diluição de 2 litros com água destilada. TBS (pH 7,4) A 200 ml da solução-mãe é adicionado 18 g de NaCl dissolvidos em dissolvido em ~ 1800 ml água destilada com ajuste de pH para 7,4 usando solução-mãe, seguido de diluição de 2 litros com água destilada. Solução de tripsina (0,05% de tripsina, 0,1% CaCl 2) Contém 0,1 g e 0,2 g de tripsina CaCl 2 em 200 ml TBS (pH 7,8). Solução de sacarose 2,5% Contém 5 g de sacarose em 200 ml TBS (pH 7,8). Solução estoque de azida de sódio 1% em TBS (pH 7,4) Contém 1 g Na-azida em 100 ml com TBS (pH 7,4). Diluindo buffer: 0,1% BSA, 0,01% Na-azida (Usado para diluir os anticorpos no ABC Vectastain kit). Contém 0,1 g de albumina bovina sérica (BSA) e 1 ml de 1% Na-azida, diluído para 100 ml com TBS (pH 7,4). ABC kit Vectastain PK 4002, peroxidase ABC rato IgG Soro de cavalo normal; bloqueio soro; solução amarela: 3 drops/10 ml de tampão de diluição. Anticorpo biotinilado; anti-mouse IgG; solução de azul: um tampão de diluição drop/10 ml. ABC reagentes: solução de laranja, 2 gotas mais marrom solução de 2 ml drops/10 TBS (pH 7,4). Misture as soluções 20 minutos antes de usar! Mouse (monoclonal) endotélio anti-rato (Biosource International, Camarillo, CA, EUA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalogo </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clone # </td><td> OX MRC-43 </td></tr></tbody></table> Este anticorpo é dirigido contra todas as células do endotélio vascular em ratos, com exceção dos que estão no cérebro. Peroxidase Vectastain Avidin Biotina Complexo (ABC) kit O kit contém o anticorpo primário, o anticorpo secundário biotinilado, avidina-biotinilado complexo enzimático (ABC), e do substrato da enzima. Ver <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> ou <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> para protocolos. Albumina sérica bovina (BSA) (catálogo da Sigma-Aldrich, # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-diaminobenzidina Isopac (Sigma-Aldrich, catalogo D 9015). Tripsina de pâncreas bovino (Sigma-Aldrich, catalogo T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Jarfalla, Suécia)

rat mesentery angiogenesis assay

O adulto de ratos mesentério ensaio angiogênese janela é biologicamente apropriada e é excepcionalmente adequado para o estudo de germinação angiogênese in vivo [ver artigos de revisão], que é a forma dominante de angiogênese em tumores humanos e não-tecidos tumorais, como discutido na revisão solicitada papers 1,2. Angiogênese induzida nas partes membranosas mesentérica por injeção intraperitoneal (ip) de um fator pró-angiogênico pode ser modulada por via subcutânea (sc), intravenosa (iv) ou oral (po) o tratamento com agentes modificadores de escolha. Cada parte membranosa do mesentério é translúcido e emoldurado por tecido adiposo, dando-lhe uma aparência janela-like. O ensaio tem as seguintes características vantajosas: (i) o tecido de teste é nativamente vascularizado, apesar da baixa densidade, e uma vez que é extremamente fina, a rede microvascular é praticamente bidimensional, que permite que toda a rede a ser avaliados microscopicamente in situ; ( ii) em ratos adultos o tecido teste carece de angiogênese fisiológica significativa, o que caracteriza a maioria dos adultos normais tecidos de mamíferos, o grau de vascularização nativa é, no entanto, correlacionada com a idade, como discutido no 1; (iii) o nível insignificante de trauma angiogênese induzida garante alta sensibilidade; (iv) o ensaio reproduz a situação clínica, como as drogas angiogênese modulador de teste são administrados por via sistémica e as respostas observadas refletem o efeito líquido de todos os metabólica, celular e alterações moleculares induzidas pelo tratamento, (v) o ensaio permite avaliações de objetivo, quantitativo, variáveis ​​imparciais sobre extensão espacial microvascular, densidade e formação de padrões de rede, bem como de germinação capilar, permitindo assim robusta análises estatísticas da dose-efeito e molecular relações estrutura-actividade, e (vi ) o ensaio revela com alta sensibilidade aos efeitos tóxicos ou nocivos dos tratamentos em termos de diminuição da taxa de ganho de peso-fisiológicos, como ratos adultos crescer robustamente. Mast-mediada por células angiogênese foi demonstrada pela primeira vez com este ensaio 3,4. O modelo demonstra um alto nível de discriminação em relação dose-efeito e os efeitos medidos administrada sistemicamente quimicamente ou funcionalmente drogas intimamente relacionados e proteínas, incluindo: (i) de baixa dosagem, administrada metronomicamente quimioterápicos padrão que produzem diversos, drogas efeitos específicos (isto é, atividades angiogênese-supressiva, neutro ou angiogênese estimulante 5), (ii) natural de ferro-insaturados lactoferrina humana, o que estimula VEGF-A-angiogênese mediada 6, e natural de ferro-insaturados lactoferrina bovina, que inibe o VEGF-A- angiogênese mediada 7, e (iii) as frações de baixo peso molecular, a heparina produzida por vários meios 8,9. Além disso, o ensaio é altamente adequado para estudos dos efeitos combinados sobre a angiogênese de agentes que são administrados por via sistémica, de forma concomitante ou seqüencial. A idéia de fazer este vídeo originou-se do falecido Dr. Judah Folkman, quando visitou nosso laboratório e testemunhou a metodologia que está sendo demonstrada. Revisão papers (convidados) discutindo e avaliando o ensaio Norrby, K. Em modelos in vivo da angiogênese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, K. O teste de drogas com modelos de angiogênese. Especialista Opin. Drogas. Descoberta. 3, 533-549 (2008).

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Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K visualizações.  University of Gothenburg. Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: Um modelo in vitro para o Estudo da angiogênese (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Biologia

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Otimizado de fibrina Gel Assay Bead para o Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primária de Miócitos Coração Adulto Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Intracellular Refolding Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds with inhibitory/stimulating activity. Molecular chaperones are proteins involved in regulation of protein folding1 and have a crucial role in promoting cell survival upon stress insults like heat shock2, nutrient starvation and exposure to chemicals/poisons3. For this reason chaperones are found to be involved in events like tumor development, chemioresistance of cancer cells4 as well as neurodegeneration5. Design of small molecules able to inhibit or stimulate the activity of these enzymes is therefore one of the most studied strategies for cancer therapy7 and neurodegenerative disorders9. The assay here described offers the possibility to measure the refolding activity of a particular molecular chaperone and to study the effect of compounds on its activity. In this method the gene of the molecular chaperone investigated is transfected together with an expression vector encoding for the firefly luciferase gene. It has been already described that denaturated firefly luciferase can be refolded by molecular chaperones10,11. As normalizing transfection control, a vector encoding for the renilla luciferase gene is transfected. All transfections described in this protocol are performed with X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cells. In the first step, protein synthesis is inhibited by treating the cells with cycloheximide. Thereafter protein unfolding is induced by heat shock at 45&deg;C for 30 minutes. Upon recovery at 37&deg;C, proteins are re-folded into their active conformation and the activity of the firefly luciferase is used as read-out: the more light will be produced, the more protein will have re-gained the original conformation. Non-heat shocked cells are set as reference (100% of refolded luciferase).

In this protocol a method to measure intracellular protein refolding after heat shock is described. This method can be used to study foldases like molecular chaperones and their co-factors or compounds able to influence their activity. Firefly luciferase activity is used as reporter to measure chaperone refolding activity.

Ensaio redobrando intracelular

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...