We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Dissecção de tecido e fixação (60 min) <ol><li> Para cérebros de Drosophila, colocar larvas 3rdin uma gota de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato). Escolha grande larvas 3º que estão rastreando ativamente de frascos ou garrafas que não estão superlotadas. <ol><li> Use um par ultrafine pinça para agarrar os ganchos na boca e outro par de pinça para agarrar 2/3 para baixo o comprimento do corpo (Figura 1A, B). Puxe delicadamente sobre os ganchos na boca para expor o cérebro, os gânglios ventral, glândulas salivares e parte do trato digestivo das larvas. Use as pinças para separar o cérebro e gânglios ventral (Figura 1A, B) a partir de outros tecidos e introduzi-lo numa gotícula de 1x PBT (salino tamponado com fosfato com Tween) numa placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para Nasonia dissecções testículo, escolha do sexo masculino pupas 3 dias de idade (corpos amarelos com olhos vermelhos). Masculino Nasonia têm comprimentos pequenos almofada asa em relação à females durante a fase de pupa (Figura 1C). <ol><li> Segure a pupa, na parte superior do abdômen, perto da região torácica, com um par de pinça, e usando o outro par de pinça, pegue a ponta muito distal do abdômen e retirar os testículos lágrima em forma de gota (que será cercado por gordura corpo que pode ser abalado suavemente; Figura 1D). Retire qualquer parte do corpo exteriores dos testículos, o que evitará esmagamento adequada, e coloque em uma gota de 1x PBT em uma placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para cada slide, dissecar um total de quatro ou cinco amostras de tecido (ie., Drosophila cérebros larval ou testículos Nasonia). NOTA: Mais de cinco amostras levará a núcleos superlotadas e cromossomos. </li><li> Opcionalmente, para conseguir alguma separação de cromátides irmãs em regiões eucromáticos de cromossomos mitóticos, tratar o tecido com uma solução hipotônica: transferir cérebros de 1x PBT para uma gota de citrato de sódio a 0,5% para 5-10 (não mais do que 10) min. NOTA: A colchicina (um inibidor da mitose) pode ser útil para aumentar o número de figuras de mitose na metáfase 11. No entanto, o seu uso é desnecessário se muito grande larvas saudáveis ​​são usados, e até mesmo indesejável, pois pode afetar negativamente a resolução cromossomo, espalhando e morfologia. </li><li> Coloque uma gota (~ 20 ul) de solução fixadora (2,5% de paraformaldeído em ácido acético 45%) sobre a superfície de uma lamela de cobertura tratadas com Sigmacote limpo. NOTA: Certifique solução fixadora nova para cada dia de uso. Soluções fixadoras que variam 1,8-3,7% de paraformaldeído em ácido acético 45% produzir os melhores resultados para os peixes. Usando diferentes do cérebro ou testículos tecidos, ou adaptar este protocolo de imuno-FISH pode exigir experimentando com diferentes fixadores (para uma lista de diferentes fixadores, ver 12). </li><li> Transferir cuidadosamente cada amostra de tecido a partir do tampão de dissecação (1x PBT) na gotícula fixador com pinças ultrafinas, minimizing a transferência de tampão de dissecação para a solução fixadora. Colocar as amostras de tecido de modo a que eles estão uniformemente espaçados uns dos outros no interior da gotícula de fixador. Incubar os tecidos em fixador durante 4 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Com cuidado, coloque um slide rosto poli-revestido de lisina para baixo para o deslizamento de tecido e tampa. Não pressione a este ponto, mas sim permitir que os dois entrar em contato com levemente para que a lamínula varas para o lado de baixo do slide. Inverter o slide para que o deslizamento tampa está no topo. </li><li> Sanduíche do deslizamento slide / tecido / cobertura dentro de um pedaço dobrado de papel de filtro. Em uma superfície estável, usando o polegar, pressione muito firmemente em linha reta para baixo para a posição diretamente acima da lamela. Tenha cuidado para evitar deslizamento lateral da lamela (isso irá provocar manchas do tecido). </li><li> Mergulhe o slide / tecido / tampa de deslizamento em nitrogênio líquido (ver aparelho na Figura 1E, F), e deixe descansar até que o nitrogênio pára fervente (não é fINE). Remover o slide e encaixe imediatamente a lamínula com uma lâmina de barbear fresco sacudindo um canto da lamínula em um sentido ascendente (evitar riscar o tecido fixado com a lâmina de barbear). <ol><li> O pré-resfriamento do slide / tecido / lamela em um bloco de gelo seco, tampa escorregar, por 1-2 min antes de submergir em nitrogênio líquido vai ajudar a prevenir os slides de rachar. </li></ol></li><li> Colocar imediatamente o diapositivo com o tecido em um frasco Coplin preenchido com etanol a 100% à temperatura ambiente e deixar em repouso durante pelo menos 5 minutos (este tempo pode ser mais longo, se necessário). NOTA: etanol a 100% frio também poderia ser utilizado. </li><li> Remover o slide com o tecido, pavio fora excesso de etanol com uma Kimwipe (sem tocar no tecido fixo), e deixar o slide ao ar seco por 1 hora. <ol><li> Prossiga diretamente para a etapa 2 ou manter lâminas secas em baixa umidade do ar ou em uma câmara de dessecação por semanas a até meses antes de realizar a hibridação. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) A 3 rd instar Drosophila larva (à direita), com posições indicadas por onde pegar os ganchos na boca (indicado com *) e 2/3 do caminho para baixo as larvas para dissecar cérebros; (À esquerda) uma vista esquemática de uma larva de uma mesma fase de desenvolvimento, que descreve a posição relativa do cérebro no interior da cabeça de larvas. (B) O cérebro e gânglios dissecados a partir de uma ventral 3 Drosophila larva de terceiro instar (direita) e uma representação esquemática do presente tecido (à esquerda). pupa Nasonia (C) 3 dias de idade, em fase de olhos vermelhos corpo-amarelo. (D) Um par testis dissecado a partir de um velho pupa macho Nasonia 3 dia (à direita) com posições indicando onde pegar a pupa no posterior do abdómen (denotado com *) e a meio caminho no corpo; (À esquerda) esquemático masculino que descreve e feminino foip pupas; pupas macho pode ser distinguido pelas asas que não se estendem passado o perfil sagital (seta preta), em contraste com as fêmeas, que têm asas que se estendem para além do perfil; a posição relativa do par de testículo é mostrado na pupa de macho. (E) O aparelho de uma sequência de clipes-e método (F) utilizadas para mergulhar as lâminas em um vaso de azoto líquido. Várias cordas paperclip pode ser utilizado para a imersão simultânea de múltiplas lâminas. 2. A hibridação in situ (30 minutos no dia 1; 1 hr-2,5 h para sondas longas-no dia 2) <ol><li> Adicionar 1 ul (100 ng) de cada sonda de 20 ul de tampão de hibridação de 1,1x. Pipetar sonda / tampão de hibridação sobre a superfície do tecido fixado (evitar tocar no tecido). </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela diretamente sobre o tampão sonda / hibridação, certificando-se de que a tampa de deslizamento é centrado diretamente sobre o tecido. O tampão deve migrar para poenviar um e borda externa da tampa de deslizamento, sem deixar bolhas de ar. Nota: Pequenas bolhas que não contactam tecido não colocam quaisquer problemas para o procedimento. Remover grandes bolhas com cuidado levantando um canto da lamela e cuidadosamente soltando-o de volta para o slide. </li><li> Coloque o deslizamento slide / tecido / cobertura sobre a superfície de um bloco pré-aquecido a 95 ° C (cover escorregar). Cubra com um pedaço grande de papel alumínio para evitar a exposição à luz. Com o deslizar incubar a 95 ° C durante 5 min. NOTA: Um bloco de calor típico com furos para tubos podem ser viradas para proporcionar uma superfície plana para colocar o slide / tecido / lamela. </li><li> Retire o slide, deixando-a esfriar um pouco até que esteja quente ao toque. Cuidadosamente enrole um pedaço de Parafilm esticada ao redor da lamínula para selar o líquido abaixo dela. </li><li> Colocar a lâmina selada dentro de uma câmara de humidade e colocar a câmara numa incubadora com uma pré-aquecido a 30 ° C. Incubar a 30 ° C durante 4 h até durante a noite.<ol><li> Criar uma câmara de umidade a partir de uma caixa de ponta vazio ou recipiente Tupperware pálpebras com Kimwipes umedecidas ou toalhas de papel colocadas na parte inferior. NOTA: As sondas de oligo de ADN de cadeia simples foram concebidos para ser 28-33 bases para alcançar uma temperatura de fusão teórica (T m) dos 45-47 ° C. Estes m varia de comprimento e T refletir o fato de que muitas seqüências repetitivas que estudamos são AT-ricos e, portanto, têm baixo teor de GC. Sondas maiores, provavelmente, têm valores maiores M T; isto pode resultar em maior fundo de hibridação à temperatura de hibridação padrão de 30 ° C. Assim, resolução de alguns problemas com as temperaturas de hibridação podem ser necessários para obter os melhores resultados. Para encontrar a melhor temperatura de hibridização, aumento (ou redução) a temperatura de 5 ° C, de forma incremental. </li></ol></li><li> Retire cuidadosamente o Parafilm do slide e, em seguida, retire cuidadosamente a cobertura de vidro, levantando lentamente um canto. Wash o slide três vezes para 15 min cada lavagem em tampão SSC 0,1x. Cubra o recipiente Coplin com folha de alumínio durante as lavagens para minimizar a exposição à luz. </li><li> Se não estiver usando uma sonda biotinilado longa, vá para o passo 2.8. <ol><li> Se estiver usando uma sonda longa biotinilado, secar a área em volta do tecido com um Kimwipe, tomando cuidado para não tocar no próprio tecido. Coloque 100 ml de solução sobre o tecido bloqueio e cobrir suavemente com uma lamela, tomando cuidado para evitar bolhas de armadilhagem. Enrole a deslizar sobre a lamela com Parafilm e lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela e secar ao redor do tecido com um Kimwipe. Pipet 100 l de rhodamine-avidina diluído 1: 1.000 em cuidados SBT sobre o tecido e cubra delicadamente com uma lamela, tomando para evitar a captura de bolhas. Enrole a deslizar sobre a lamela com Parafilm e lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela e lavar o slide 3 vezes por 5 minutos cada em 4x SSCT e depois3 vezes por 5 minutos cada em 0,1x SSC. NOTA: As lâminas podem ser lavadas por longos períodos de tempo. </li></ol></li><li> Remover o slide e secar ao redor do tecido com um Kimwipe seco para remover o excesso de tampão (evite tocar no tecido). Coloque o lado do tecido slide-up em um local escuro durante 10-15 minutos ou até que a umidade se dissipa completamente. </li><li> Pipetar 11 ul de meio de montagem Vectashield (com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole-DAPI) sobre o tecido. Com cuidado, coloque uma lamela limpa (não tratados com Sigmacote) diretamente sobre o centro do meio de montagem e tecido. O meio de montagem deve migrar lentamente para fora, para as bordas da lamínula. NOTA: Se o meio de montagem não conseguir atingir a extremidade da lamela em todos os lados, em seguida, um adicional de 1-2 uL de meio de montagem pode ser aplicada a uma posição na borda da lâmina de cobertura para preencher o volume necessário. Neste caso, certifique-se de limpar qualquer excesso médio da superfície do slide antesvedação. </li><li> Selar as bordas da lamínula com unha polonês. Evite pintar a unha polonês sobre a amostra de tecido. </li><li> Coloque o slide na posição vertical em um local escuro e deixar a unha seca polonês até que esteja completamente rígido (normalmente, 30 min ou mais). Neste ponto, a imagem do tecido ou armazenar a -20 ° C durante até 1 semana mais tarde para a imagiologia. </li></ol> Buffer / Receitas Solution 10x PBS <ul><li> 80 g de NaCl </li><li> 2,0 g de KCl </li><li> 14,4 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g de KH 2 PO 4 </li><li> pH para 7,4, H2O a 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml de PBS 10x </li><li> 45 ml de H2O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g de NaCl </li><li> 88,2 g de Na Citrato </li><li> em 800 ml de H2O </li><li> pH a 7, H2O a 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml de 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml de 20x SSC </li><li> 995 ml de H2O </li></ul> Mistura de hibridação (20 ul; modificado a partir do 11) <ul><li> 10 ul de formamida </li><li> 4 ul de 50% de sulfato de dextrano </li><li> 2 ul de 20x SSC </li><li> 4 ul de H2O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 0,01 g de Albumina de Soro Bovino (BSA) </li><li> 10 ul de Tween 20 </li><li> 7,9 ml de H2O </li></ul> A solução de bloqueio 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g de BSA </li><li> 10 ul de Tween 20 </li><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 8 ml de H2O </li></ul> Solução fixadora com paraformaldeído (1 ml) <ul><li> 393,75 ul H 2 O (adicione água primeiro) </li><li> 450 ácido acético glacial ul </li><li> 156,25 ul 16% de paraformaldeído </li></ul>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISH é freqüentemente usado para mapear sequências específicas para os cromossomas. Nós descrevemos um método simples para o ADN ISH optimizado para elevado número de cópias, sequências de heterocromatina. Em vez de utilizar lavagens numa solução de formamida, que é um requisito em outros protocolos ISH ADN existentes, colocamos lâminas montadas-tecido directamente sobre um bloco de pré-aquecida para desnaturar o ADN. Este método evita o uso de grandes quantidades de formamida. Um passo fundamental par...

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Sondas para regiões de cópia única dentro euchromatin pode ser gerado através de um punhado de abordagens, incluindo nick-tradução ou de fim-de rotulagem dos produtos de ADN longas 1,2 ea incorporação de deoxygenin (DIG) nucleotídeos -attached e seu reconhecimento através de uma ampla variedade de anticorpos conjugados do grupo 1-3. Visualização das sequências eucromáticos em poucos ou número único de cópia requer a utilização quer de sondas individuais grandes, com uma actividade específica elevada ou um cocktail de sondas múltiplas mais pequenas, que aumentam colectivamente sinal. Em contraste, as sequências altamente repetitivas encontradas na heterocromatina, tais como DNAs satélite, são alvos mais fáceis para DNA ISH porque normalmente existe como dezenas de milhares de repetições agrupados em regiões cromossômicas únicos conhecidos como blocos. Elementos de transposição também pode serencontrado em altos números de cópia na distinta loci cromossômica 2. Nestes casos, as sondas individuais com baixa actividade específica pode rotular eficazmente sequências de heterocromatina, devido à sua hibridação em múltiplos locais. Sondas para seqüências repetitivas podem ser sintetizados oligonucleotídeos comercialmente como curtos (30-50 pb) e quimicamente conjugado com qualquer um dos vários grupos fluorescentes diferentes. Mapeando seqüências repetitivas dentro heterochromatin por meio de tecnologias de sequenciamento do genoma-se difícil devido aos desafios enfrentados em andaimes de construção dentro de blocos de satélite altamente repetitivas 4-6,7. Atualmente, ISH se destaca como a forma mais eficaz de mapear essas seqüências ao nível sub-cromossomo. Essa estratégia é importante para o mapeamento de um grande número de sequências repetitivas que estão sendo descobertos por estudos de genoma e transcriptoma de sequenciamento em curso. A eficiência e facilidade de mapeamento de seqüências repetitivas nos cromossomos-montado slides seria greatly reforçada por um protocolo simplificado de DNA ISH. Por exemplo, os protocolos existentes para ADN ISH envolver múltiplas lavagens de tecidos hibridados em solução de formamida a 2,8, adicionando assim substancialmente para o tempo requerido para as sequências de mapeamento e também a produção de grandes quantidades de resíduos químicos para este reagente dispendioso. Aqui nós descrevemos um método DNA ISH revista que contorna a necessidade de lavagens formamida e utiliza equipamentos básicos de laboratório e reagentes. Este método foi originalmente projetado para o rápido mapeamento de seqüências de DNA altamente repetitivos em regiões heterocromáticas de neuroblastos de larvas de Drosophila usando oligos sintetizados no mercado que são conjugados com corantes fluorescentes. No entanto, este método também funciona para o mapeamento de seqüências repetitivas usando sondas maiores sintetizados através de outros meios 9,10 e em vários tipos de tecidos e de cromossomos diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para mapear sequências eucromáticos utilizando mais ou multiple, sondas curtas dentro da sequência euchromatic de interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Esta abordagem é particularmente eficaz em mapeamento de sequências altamente repetitivas para regiões heterocromáticas, onde abordagens computacionais enfrentam desafios proibitivos. Aqui nós descrevemos um protocolo simplificado para DNA ISH que contorna lavagens formamida que são etapas padrão em outros protocolos de DNA ISH. Nosso protocolo é otimizado para a hibridação com sondas de DNA vertente individuais curtas que levam corantes fluorescentes, o que efetivamente marcam sequências de DNA repetitivas dentro de regiões cromossômicas heterocromáticos através de um número de diferentes tipos de tecidos do inseto. No entanto, os pedidos podem ser estendido para usar com sondas maiores e visualização de sequências de DNA única cópia (não repetitivo). Demonstramos esse método mapeando várias sequências repetitivas diferentes de cromossomos esmagados de Drosophila melanogaster células neurais e Nasoniavitripennis espermatócitos. Mostramos padrões de hibridização, quer para pequenas sondas, sintetizados comercialmente e para uma sonda maior para comparação. Este procedimento utiliza material de laboratório simples e reagentes, e é ideal para os investigadores que têm pouca experiência com a realização de DNA ISH.

Para demonstrar este método, que hibridou um conjunto de pequenos oligonucleótidos sintetizados comercialmente que foram quimicamente modificados com conjugados fluorescentes (Figura 2) e uma sonda mais longa biotinilado (feita através de tradução por cortes de um produto de PCR; Figura 2B), a partir de vários tecidos cromossomas diferente tipos (ver Tabela 1). As sequências alvo incluídas repete satélite localizadas em regiões (pericentroméricas heterocromá...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

17.9K visualizações.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Biologia

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

A Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...