A análise FISH de células ovarianas de fêmeas com aberrações cromossômicas X é uma técnica única para obter informações sobre o conteúdo cromossômico X das células ovarianas neste grupo específico. Essas técnicas podem ser úteis para aprender mais sobre o potencial reprodutivo em fêmeas com aberrações cromossômicas X. É importante mencionar que ambos os métodos têm a intenção de facilitar pesquisas futuras, e não são projetados para serem usados como ferramenta diagnóstica na prática clínica.
Quem demonstrará o procedimento serão Ronald Peek, pesquisador sênior do nosso laboratório de fertilidade, e Milad Intezar, analista do nosso departamento de patologia. Para começar, corte o tecido do córtex ovariano criopreservado ou descongelado em pequenos pedaços de um por um milímetro usando um bisturi. Digerir enzimaticamente os fragmentos de tecido em quatro litros de L15 pré-aquecido por 75 minutos a 37 graus Celsius.
Pipetar a mistura de digestão para cima e para baixo a cada 15 minutos. Pare a digestão enzimática adicionando quatro mililitros de L15 frio suplementado com 10%Fetal Bovine Serum, ou FBS. Lavar o tecido dissociado uma vez com oito mililitros de meio L15 frio por centrifugação a 500 g antes de ressuspender em 500 microlitros de meio L15.
Transfira a suspensão celular contendo em grande parte células estromais individuais e pequenos folículos para uma placa de Petri de plástico e examine a suspensão sob um microscópio estéreo. Pegue os folículos com menos de 50 micrômetros de tamanho manualmente usando uma pipeta plástica de 75 micrômetros e transfira-os para a gota do meio L15 suplementado com 10% FBS a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira os folículos purificados para uma solução de 0,06% de tripsina, um miligrama por mililitro de EDTA e um miligrama por mililitro de glicose, e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius.
Após a incubação, obter células do estroma ovariano a partir da suspensão de células do córtex usando uma pipeta plástica de 75 micrômetros. Para a Hibridização In Situ por Fluorescência, ou análise FISH de células ovarianas individuais, transfira os folículos ovarianos tratados com tripsina/EDTA/glicose, ou células estromais para gotículas de cinco microlitros de cloreto de potássio 0,15 milimolar e 15 microlitros de DPBS em uma lâmina, e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius. Secar e pré-fixar a lâmina em 300 microlitros de cloreto de potássio 0,05 milimolar, ácido acético a 7,5% e metanol a 22,5% por dois minutos.
Cubra a lâmina com ácido acético metanol três a um por dois minutos para finalizar a fixação. Após a fixação, lavar a amostra duas vezes em CCS recém-preparada a 73 graus Celsius. Cubra com 100 microlitros de 2% de Proteinase K e sele com uma lamínula.
Incubar a lâmina por 10 minutos a 37 graus Celsius na estação de hibridização. Após a incubação, remova a tampa e lave a lâmina por cinco minutos em DPBS à temperatura ambiente sob agitação. Fixar a amostra por cinco minutos com formol a 1%.
Em seguida, lave a lâmina em DPBS e desidrate-a em série em concentrações crescentes de etanol por dois minutos cada. Seque a amostra ao ar antes de hibridizá-la com sondas fluorescentemente marcadas. Em seguida, adicione um microlitro de CEPX, um microlitro de CEP18 e 18 microlitros do tampão de hibridização à amostra e sele com uma tampa que é colada na lâmina.
Transfira a lâmina para a estação de hibridização para desnaturação a 73 graus Celsius por três minutos, seguida de hibridização durante uma incubação noturna a 37 graus Celsius. Após a hibridização, remova a tampa e qualquer cola restante da lâmina. Lavar a lâmina em 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 a 72 graus Celsius por dois minutos, seguido de incubação por um minuto em 2X SSC e 0,1% Tween-20.
Desidrate a lâmina como demonstrado e seque-a ao ar no escuro antes de cobri-la com um meio de montagem contendo DAPI. Coloque a lâmina a menos 20 graus Celsius por 10 minutos antes da análise por microscopia de fluorescência. Para hibridizar seções de parafina, selecione novas seções antes ou depois da seção que contém folículos da fita de parafina.
Monte uma seção em uma lâmina de vidro e seque-a por 45 minutos em um fogão a 56 graus Celsius. Desparafinizar a seção em xileno por 10 minutos, depois imergir a lâmina em etanol 99,5% e enxaguar por cinco minutos em água da torneira. Pré-trate a lâmina com a solução de recuperação do alvo por 10 minutos a 96 graus Celsius.
Após esfriar, enxágue a lâmina em água destilada. Trate a lâmina por cinco minutos com ácido clorídrico 0,01 molar, seguido de digestão de pepsina por 15 minutos a 37 graus Celsius. Enxaguar novamente a lâmina em ácido clorídrico e, posteriormente, em PBS.
Fixe a lâmina em PBS de formol a 1% durante cinco minutos. Em seguida, enxágue brevemente a lâmina em PBS e novamente em água desmineralizada antes de desidratá-la em etanol 99,5%. Aplicar cinco microlitros de sonda CEP18 e CEPX sobre a lâmina pré-tratada.
Em seguida, aplique uma tampa e sele a área com cola fotográfica. Coloque a lâmina em um hibridizador para desnaturação a 80 graus Celsius por 10 minutos e hibridização durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue a lâmina duas vezes por cinco minutos cada em SSC a 42 graus Celsius, seguido por um enxágue de dois minutos e um minuto em 0,3% Nonidet P-40 a 73 graus Celsius.
Novamente, enxaguar a lâmina em SSC 2X seguido de enxágue em água destilada antes de desidratá-la com etanol 99,5%. Seque a corrediça ao ar e monte-a em meio de montagem contendo DAPI. O tecido cortical ovariano criopreservado na Paciente A apresentava 50% dos linfócitos, tinha cariótipo X 45 e 50% 46, XX.In Paciente B, 38% dos linfócitos 45, X, 28% 46, XX e 34% 47, XXX.
As células estromais adjacentes também foram analisadas para o conteúdo cromossômico X. A digestão enzimática do tecido do córtex ovariano resultou em uma suspensão de células amplamente dissociadas, mas deixando os folículos primordiais, consistindo de um ovócito intacto cercado por uma única camada de células de granulose. Folículos pequenos apresentaram dificuldades na interpretação dos sinais após FISH, devido à aglomeração das células da granulose.
A digestão adicional dos folículos com tripsina antes da FISH resultou em células individuais de granulose contraindo em uma morfologia esférica na superfície dos folículos. A coloração pela hematoxilina-eosina mostrou folículos secundários e antrais morfologicamente normais no tecido do córtex ovariano após cinco meses de xenoenxertia. O conteúdo cromossômico X das células de granulose desses folículos foi determinado por análise de FISH.
A fixação de tecido do córtex ovariano enxertado em solução de Bouin resultou em sinais fluorescentes borrados e amplamente obscurecidos nas células foliculares devido a uma névoa verde. Em contraste, o tecido do córtex ovariano fixado em formaldeído forneceu excelentes sinais fluorescentes. O principal desafio deste protocolo está no isolamento das células ovarianas e na digestão enzimática do tecido.
O desvio desse protocolo pode causar uma perda substancial de células ovarianas durante o processo, e isso deve ser evitado especialmente em mulheres que já têm uma baixa reserva ovariana. Um perfil adicional de expressão gênica pode ser útil para aprender mais sobre o impacto das células ovarianas aneuploides na foliculogênese e, portanto, no processo de falência ovariana prematura em mulheres com aberrações cromossômicas X.
