This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Preparação do péptido Matrizes <ol><li> Programação do Peptide Sequências <ol><li> Conceber sequências de péptidos para a síntese utilizando o software MultiPep observador. Entre as sequências peptídicas em códigos de letras individuais. Péptido 1: TARKSTGGKA </li><li> Gerar alanina ou arginina pé bibliotecas com um comando específico (.replace, A) para rastrear os aminoácidos importantes necessários para o reconhecimento de um substrato definido. Por exemplo, no exemplo que se segue a primeira linha é a sequência de tipo selvagem e a partir da segunda linha de cada aminoácido num péptido é alterado para alanina sequencialmente. substituir, Um TARKSTG A -ARKSTG T- A -RKSTG TA A -KSTG TARGET A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G A TARKST- </li><li> Use comandos semelhantes (.replace R,.N substituir etc.), tal como descrito em 1.1.2 com todos os resíduos de aminoácido naturalmente disponíveis (eventualmente omitindo cisteína, metionina e triptofano, porque estes resíduos são propensos a oxidação e, por vezes, menor rendimento de síntese) para sintetizar um péptido de matriz para a determinação do consenso motivo da sequência substrato para uma enzima. NOTA: Como mostrado na Figura 4A, o eixo horizontal representa a sequência do péptido dada e o eixo vertical representa os aminoácidos que são seleccionadas para o comando. Semelhante à sequência mostrada em 1.1.2, uma no eixo vertical significa que uma sequencialmente Ala substitui cada posição da sequência dada na primeira fila na FIG. 4A. Do mesmo modo sequencialmente arginina substitui cada aminoácido na segunda fila e assim por diante com outros aminoácidos. Bibliotecas de matriz péptido completas são sintetizados por substituição sistemática de cada resíduo na sequência de péptido substrato fornecida com cada uma das the outros resíduos de aminoácidos naturalmente disponíveis, o que ajuda a entender a influência de cada resíduo em cada posição da sequência dada. </li><li> Como alternativa, a metilação de substratos peptídicos conhecida ou prevista pode ser facilmente verificada sintetizar bibliotecas de péptidos com os péptidos alvo do PKMT juntamente com controles de metilação positivo e negativo (ou seja, peptídeos conhecidos desnaturado ou conhecidos não ser metilado). Sintetizar peptídeos através da troca de lisina alvo putativo para alanina para confirmar a metilação da lisina-alvo, como mostrado abaixo pela programação manual. Tipo selvagem peptídeo: STGG K PRQFL Peptídeo Mutant: STGG A PRQFL NOTA: O software também tem os scripts inerentes para criar diversas bibliotecas, como mapeamento de epitopo com uma mudança de enquadramento desejada da sequência de aminoácidos para mapear importantes necessários para uma interacção. </li></ol></li><li> Preparação de Membrana, Aminoácidos umd Reagentes <ol><li> Pré-inchar a membrana SPOT em DMF (N, N-dimetilformamida) durante 10 minutos e em seguida, coloque a membrana molhado na armação SPOT sintetizador sem bolhas de ar ou rugas. </li><li> Lava-se a membrana três vezes com etanol a 100%. Secam-se as membranas completamente durante pelo menos 10 min antes de iniciar o programa de síntese. </li><li> Em paralelo, preparar de fresco 0,5 M concentrações úteis de aminoácidos protegidos com Fmoc comercialmente disponíveis através da dissolução em NMP e também preparar o activador e de base como descrito na Tabela 1. </li><li> Certifique-se de que todos os recipientes de solução resíduos do sintetizador SPOT foram esvaziados e reabastecer os reservatórios de solvente com o DMF, etanol e piperidina. NOTA: A máquina está pronta para a síntese. </li></ol></li><li> A mancha de primeiro aminoácido <ol><li> Para gerar a ligação amida com o grupo amino livre sobre a membrana, activar o grupo carboxilo do amino ácido de entrada por adding o activador (N, N &#39;-diisopropilcarbodiimida) e solução de base (hidroxiimino Cianoacetato de etilo) para o derivado de aminoácido. </li><li> Spot the volumes desejados de aminoácidos ativados na membrana funcionalizado Amino-PEG usando o robô programável. NOTA: Deste modo, o C-terminal do aminoácido é acoplado ao grupo amino da membrana. </li><li> Repetir esta etapa, três vezes para garantir um melhor acoplamento do primeiro aminoácido activado. Incubar a membrana durante 20 minutos e, em seguida, lava-se com DMF, para remover os aminoácidos desacoplados. </li></ol></li><li> Bloqueio de espaços livres em áreas não-local NOTA: Após o acoplamento do primeiro aminoácido C-terminal de todos os péptidos para o grupo amino da membrana, os grupos amino entre as manchas e também alguns dos grupos amino no local dentro das áreas não formar ligações com os aminoácidos. <ol><li> Bloquear os grupos amino livres através da incubação com a solução de nivelamento (20% de anidrido acético em DMF)durante 5 min. NOTA: Este evita o acoplamento de aminoácidos nos ciclos posteriores, com a membrana em vez da cadeia peptídica em crescimento. </li></ol></li><li> A remoção do grupo Fmoc <ol><li> Após o bloqueio, lavar a membrana com DMF 4 vezes e depois incubar com 20% de piperidina em DMF durante 20 min para remover o grupo de protecção Fmoc. NOTA: Este passo leva à remoção dos grupos Fmoc protectores de amino e é chamado de desprotecção. </li><li> Em seguida, lava-se a membrana duas vezes com DMF e duas vezes com etanol e deixar secar. NOTA: Agora, a membrana está pronto para o acoplamento dos próximos amino ácidos. </li></ol></li><li> O alongamento da cadeia NOTA: A adição de cada aminoácido é chamada um ciclo. Para além do acoplamento do primeiro aminoácido, o ciclo inicia-se com a desprotecção do grupo Fmoc do aminoácido acoplado e é seguido pelo acoplamento do grupo carboxilo activado de um amino ácido de entrada para o grupo amino do pep crescentecadeia maré. <ol><li> Repita os passos 1.3 e 1.5 até que o comprimento de péptido desejado é alcançado. </li></ol></li><li> Coloração NOTA: Após o ciclo final, as matrizes de peptídeos são corados com azul de bromofenol para confirmar a síntese bem-sucedida de peptídeos. Azul de bromofenol se liga com os grupos amino livres dos péptidos. Manchas de péptidos mostrar luz cor azul após a coloração, mas a intensidade das manchas varia dependendo da sequência peptídica. Esta coloração permite a confirmação da remoção completa de piperidina, porque na presença de azul de bromofenol a piperidina não mancha os péptidos. Além disso, isto também ajuda a marcar as matrizes de péptidos para posterior utilização. <ol><li> Após desprotecção do grupo Fmoc no último ciclo de síntese, lava-se a membrana com DMF e etanol a 100%. Em seguida, tratar a membrana com azul de bromofenol (0,02% de azul de bromofenol em DMF) durante um mínimo de 5 minutos até que se torne azul completamente. </li><li> Em seguida, lava-se a membrana com DMF e ethanol seguido por secagem durante 10 min. Agora tire a membrana do sintetizador e realizar a desprotecção da cadeia lateral (seção 1.8) manualmente. Se necessário, a fotografia da membrana para registar os resultados da síntese de péptidos (Fig. 2). </li></ol></li><li> Cadeia Lateral desprotecção <ol><li> Tratar as membranas com 20 a 25 ml de mistura de desprotecção da cadeia lateral que consiste em 95% de ácido trifluoroacético (TFA) para clivar os grupos de protecção de cadeia lateral e reagentes eliminadores de água (2,5% e 2,5% de triisopropilsilano) para proteger as cadeias laterais de aminoácidos a partir de modificação durante este passo. Tomar um volume suficiente da mistura de desprotecção para assegurar que abrange a membrana completamente numa caixa resistente a produtos químicos e hermeticamente fechado e que incubar durante 1 a 2 horas enquanto se agita suavemente. </li><li> Lava-se a membrana seis vezes com 20-25 mL de DCM (diclorometano), durante 2 minutos cada e, finalmente, duas vezes com etanol a 100% e seca-se num exsicador durante a noite. NOTA: Agoraa membrana pode ser utilizado para experiências. Um esquema de síntese da matriz péptido é fornecida na Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Expressão de Proteína de PKMTs como GST Fusions <ol><li> Usando técnicas padrão, clonar o gene que codifica o PKMT comprimento completo ou o seu domínio catalítico num vector de expressão bacteriana (como pGEX-6p2) para expressar a proteína de fusão-GST. </li><li> Transferir o vector com o PKMT desejado inserir em BL21 BL21 codão ou mais E. células de E. coli pelo método de choque de calor ou qualquer outro método. </li><li> Prepara-se uma pré-cultura com 30 ml de meio de Luria-Bertani (LB), o dia de expressão e incubar a 37 ° C durante 7 a 8 horas com agitação contínua. </li><li> Em seguida, transferir 10 ml da pré-cultura em 2 L de frascos de grandes confundidos contendo 1 L de meio LB e incubar a 37 ° C no incubador com agitação contínua até que o alcance culturaes uma densidade óptica a 600 nm definido. NOTA: Enquanto isto pode ser optimizado para cada proteína, que normalmente induzem a um OD 600 nm de cerca de 0,8. A temperatura de indução tem de ser optimizados para cada proteína individual, algumas proteínas mostram boa expressão em 22 ° C e a temperaturas um pouco mais elevadas. </li><li> Deslocar as células à temperatura de indução, durante 15 min, em seguida, induzir com 1 mM de isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido e permitir a cultura a crescer durante 10-12 horas à temperatura de indução. </li><li> Em seguida a colheita das células por centrifugação a 5000 xg durante 15 min e, finalmente, lavar o sedimento com 30 ml de tampão de STE (10 mM de Tris, pH 8,0, NaCl 100 mM e EDTA 0,1 mM) e armazenar a -20 ° C para posterior utilização. </li></ol></li><li> Protein Purification <ol><li> Descongelar o pellet celular e re-suspensão em 30 ml de tampão de sonicação (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) e perturbar por sonicação. NOTA: Este tampão needs de ser optimizados para cada proteína, eventualmente. </li><li> Centrifuga-se o lisado celular a 22000 x g durante 1 hora e, depois, recolher o sobrenadante e passar através de uma coluna contendo 600 mL de resina glutationa Sepharose 4B. </li><li> Lava-se a coluna com 50 ml de tampão de sonicação e em seguida com 100 ml de tampão de alto teor salino (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM e glicerol a 5%) para remover as proteínas não especificamente ligadas. Elui-se a proteína ligada com 5 ml de tampão de alto teor salino contendo glutationa 40 mM. </li><li> Dializar a proteína eluída em 2 L de tampão de diálise com baixo glicerol (20 mM de Tris, pH 7,4, KCl 100 mM, DTT 0,5 mM e glicerol a 10%) durante 2 horas e depois em tampão Tris 20 mM pH 7,4, KCl 100 mM, 0,5 mM DTT e glicerol a 70% durante 8 horas ou durante a noite. Certifique-se de todos os buffers de purificação são a 4 ° C e realizar a purificação de proteínas na câmara fria para evitar a desnaturação das proteínas. </li></ol></li></ol> 3. Peptide Matriz Methylation <ol><li> Pré-incubation of Peptide Arrays <ol><li> Realizar péptido matriz de metilação, quer dentro de uma caixa de tamanho apropriado ou em um saco de plástico para evitar o desperdício de enzima e caro marcado radioactivamente AdoMet. Pré-incubar o péptido matriz da membrana no saco de plástico selado contendo o respectivo tampão de metilação sem enzima e rotulado [metil-3H] -AdoMet durante 10 min. O volume de tampão depende do tamanho da matriz, por exemplo, usar 8 ml de tampão de metilação de uma especificidade completa matriz perfil peptídico. Optimizar a quantidade e a concentração da AdoMet para cada enzima. </li></ol></li><li> A metilação do péptido Matrizes <ol><li> Descartar o tampão de pré-incubação e incubação da membrana em 8 ml de tampão de metilação contendo a respectiva PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet por 1 a 2 horas. NOTA: A quantidade de enzima necessária para uma reacção de metilação depende da actividade de PKMT específico, iniciamos nossas experiências de rastreio, tipicamente com 50 nM de enzima aletaconcentração al. </li></ol></li><li> Lavagem das matrizes Peptide <ol><li> Depois descartar o tampão de metilação de um recipiente de resíduos radioactivos e lavar as matrizes de péptidos por 5 vezes com 20 ml de tampão contendo 100 mM de bicarbonato de amónio e 1% de SDS durante 5 minutos para remover a proteína ligada. Descarte o tampão de lavagem em um recipiente de lixo radioativo. </li></ol></li><li> A detecção do sinal radioativo <ol><li> Após as lavagens da membrana incubar durante 5 min em 10 ml de solução amplificar (NAMP100V). </li><li> Em seguida, descartar a solução amplificar no contentor de resíduos radioactivos para solventes orgânicos, selar a matriz peptídeo em um saco plástico e coloque-o em uma cassete de auto-radiografia. </li><li> Coloque a película auto-radiografia da matriz sobre o péptido em quarto escuro. Fechar a cassete cuidadosamente e expô-lo a -80 ° C durante o tempo necessário. Em seguida, o desenvolvimento do filme para analisar os resultados. Capturar a imagem do casal vezes com expositio diferenten vezes para evitar a saturação de substratos peptídicos fortemente metilado. </li></ol></li></ol> 4. Processamento de Dados e Análise <ol><li> Densitomï¿½rica Análise da mancha Intensities <ol><li> Digitalizar o filme em um scanner convencional e analisar as intensidades local por densitometria. Faça isso usando ImageJ (que é gratuito) ou um programa comercial. NOTA: Nós usamos o software Phoretix para esta tarefa. </li></ol></li><li> Normalização e Média dos resultados de diferentes membranas <ol><li> Conduzir as experiências de metilação péptido de matriz, pelo menos em triplicado. Normalizar as intensidades digitalizados para cada experimento por subtração de fundo e definindo a atividade em um substrato de referência como 1.0. Calcular a média dos dados para os pontos individuais e relatá-los como valores médios e desvios-padrão. </li></ol></li><li> Análise e visualização de dados <ol><li> Traçar os dados em 2D, utilizando um esquema de escala de cinza ou de cor para indicar a atividade relativa. Faça isso with Excel ou SigmaPlot imediata. Além disso, preparar um gráfico da distribuição dos desvios padrão das experiências repetidas para analisar a qualidade dos dados. </li><li> Para comparar e visualizar a exactidão do reconhecimento de cada resíduo no péptido substrato quantitativamente, calcular a preferência relativa do PKMT para cada aminoácido na posição x i por um factor de discriminação 16,17 D: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Onde v i é a taxa de metilação do péptido portador de variante de aminoácido na posição x i e &lt;v j ≠ i&gt; é a taxa média de metilação de todos os 19 péptidos que transportam um aminoácido diferente j ≠ i na posição x (incluindo o sequência de tipo selvagem). NOTA: O factor de discriminação definido por este depende do nível de fundo. Se apenas um resíduo é aceito em uma determinada posição com um fundo de 3%, a discriminaçãofator de 32,3 é obtido. Sem preferência numa posição resulta num factor de discriminação de 0. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhosphoSite:+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation.">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li><li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology.">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li><li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Síntese SPOT como descrito aqui é um método poderoso para mapear sítios de interação proteína-proteína e investigar o reconhecimento do substrato de enzimas peptídicas modificando. No entanto, a síntese SPOT ainda apresenta certas desvantagens, porque apesar de os péptidos sintetizados pelo método SPOT são relatadas como tendo mais do que 90% de pureza 21 esta é difícil de confirmar, em cada caso. Portanto, os resultados têm de ser reproduzidas por outros métodos, por exemplo, o uso de domín...

Nas duas últimas décadas, vários relatórios demonstraram a importância de modificações pós-traducionais (PTM) de desenvolvimento celular e diversas doenças como o cancro, mas recentemente proteína lisina metilação tem emergido como um outro PTM vital. Embora inicialmente histona metilação lisina foi encontrado para ser um sinal essencial da cromatina, o trabalho mais tarde também mostraram lisina metilação de várias proteínas não histona 1-4. A transferência sequencial dos grupos metilo da S-adenosil-L-metionina para o grupo ε-amino de resíduos de lisina é catalisada por uma família de enzimas denominadas proteína Lisina metiltransferases (PKMTs) que contém mais de 60 proteínas no genoma humano. PKMTs foram inicialmente descoberto como histonas modificando enzimas que metilar resíduo de lisina específica, mas relatos posteriores demonstraram que eles também poderiam metilar proteínas não-histonas 5. Até agora, cerca de 5,000 locais de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas 6 </saté&gt;, mas as enzimas responsáveis ​​por estas modificações não são frequentemente identificados. Uma razão para isto é que a especificidade da maior parte das PKMTs não tem sido extensivamente estudada. Portanto, ocorre que recorrentemente novos substratos de PKMTs são descobertos. A falta de um conhecimento detalhado da especificidade de substrato de PKMTs dificulta a compreensão de sua função biológica e papel. Para estudar a especificidade de um PKMT em detalhe, as taxas de metilação de muitos substractos de péptidos que diferem em um ou poucos aminoácidos devem ser medidos e comparados, o que deve ser feito preferencialmente utilizando arrays de péptidos. Com base nos perfis de especificidade resultantes, os potenciais substratos de PKMTs pode ser identificado que pode ser mais estudada. Matrizes de péptidos são amplamente utilizadas ferramentas para a análise bioquímica de anticorpos, enzimas modificadoras de péptidos e o mapeamento dos locais de interacção proteína-proteína (antigénio-anticorpo, receptor-ligando) 7-9. Várias centenas de péptidos são necessários para such aplicações. Existem diferentes métodos para a síntese de péptidos, entre os quais o péptido na resina de síntese é muito usado, mas tem limitações no rendimento e é relativamente dispendioso. Esses problemas foram resolvidos com a introdução do método de síntese SPOT por Frank e seus colegas 10. O método de síntese permite a síntese de SPOT várias centenas de péptidos em paralelo e em média é barata em comparação com a síntese de resina. Os péptidos sintetizados em membrana de celulose pode ser usado, quer directamente para várias aplicações ou péptidos pode ser clivado a partir da membrana e usado como péptidos livres nos ensaios em solução ou para preparar micromatrizes de péptido 10-13. Síntese SPOT é uma variante da síntese de péptidos em fase sólida, o qual utiliza uma membrana de celulose como um suporte sólido e emprega a química padrão Fmoc-10-13. Assim, a síntese das cadeias de péptidos começa na extremidade C-terminal e prossegue em direcçãoa extremidade N-terminal, em contraste com a síntese biológica em ribossomas. Membranas de celulose são funcionalizados para a ligação do primeiro amino ácidos activados (Fig. 1). O método SPOT baseia-se na entrega sequencial de aminoácidos activados em uma gota de solvente para pontos definidos na membrana usando um sistema automático de pipetagem. A gota de líquido é distribuído sobre a membrana porosa, onde forma uma zona molhada circulares, que mais tarde actua como um reactor aberto para as reacções químicas na síntese de péptidos. O tamanho do ponto é determinado pelo volume dispensado e a capacidade de absorção da membrana, múltiplos de tais pontos estão dispostos como matrizes. A escala de síntese está correlacionada com o tamanho do local e a capacidade de carga da membrana. A distância entre os pontos e a densidade das matrizes são geridas através da variação dos tamanhos de ponto. Membrana de celulose tem várias vantagens como fase sólida em síntese de péptidos, que é barato, tolerante ao químicoals utilizados na síntese de peptídeos, estável em soluções aquosas e fácil de manusear. Além disso, a sua natureza hidrofilica a torna adequada para vários sistemas de ensaio biológicos. SPOT síntese pode ser realizada manualmente ou automatizada (para 1000 de peptídeos), dependendo do número necessário de péptidos. Um sintetizador SPOT totalmente automatizado de Intavis (Köln, Alemanha) é usado para as nossas aplicações. Ele permite a síntese de péptidos em quantidades diferentes e de comprimento diferente. Os péptidos lineares são regularmente sintetizado com um comprimento de ácido de 15 a 20 aminoácidos, em adição de péptidos até 42 aminoácidos podem também ser preparados por síntese passo a passo 14,15. No entanto, o aumento do número de aminoácidos leva a reduções nos rendimentos de acoplamento gerais, o que afecta a qualidade dos péptidos. Devido à baixa quantidade de péptidos por local, os produtos são frequentemente difíceis de purificar e a qualidade dos péptidos individuais não podem ser facilmente avaliadas. Portanto, os resultados obtidos a partir de SPOT Peptide matrizes devem ser confirmados quer com péptidos sintetizados através de métodos padrão em maior escala, que podem ser purificados e analisados ​​de acordo com as normas em síntese de péptidos ou por síntese de proteínas que contêm as sequências de péptidos desejados. Ainda assim, encontramos a síntese SPOT para ser altamente confiável e resulta geralmente ser reprodutível. SPOT síntese não é restrita a proteinogenic vários aminoácidos, aminoácidos modificados comercialmente disponíveis também podem ser utilizados para a síntese, permitindo que os péptidos a ser modificado antes e após a clivagem final do grupo de protecção da cadeia lateral e, além disso, também permite a incorporação de aminoácidos fosforilados, acetilados ou metilados 11. Bibliotecas peptídicas imobilizadas sintetizados pelo método seco pode ser utilizado directamente para muitos ensaios biológicos e bioquímicos. Nós empregamos matrizes péptido compreendendo 300-400 peptídeos para investigar a especificidade de substrato de PKMTs. Para modifi enzimáticacatião, os arrays de péptidos são incubadas com o respectivo PKMT e rotulado [metil-3H] -AdoMet num tampão adequado. A metilação do respectivo substrato é analisada por após a transferência enzimática dos grupos metilo marcados radioactivamente de AdoMet para o substrato péptido através de auto-radiograf ia (Fig. 3). Por este procedimento, as matrizes peptídicos permite o estudo da metilação de diferentes substratos peptídicos, ao mesmo tempo. Uma vantagem importante deste método é que todos os péptidos são metilados em competição, de modo a que durante a fase linear da cinética de metilação, a metilação relativa de cada péptido é proporcional à constante de velocidade catalítica dividida pela constante de dissociação (k cat / K D) da enzima para o respectivo substrato péptido. Portanto, a quantidade de radioactividade incorporada dentro de cada local está directamente correlacionada com a actividade enzimática relativamente a péptido particular. Usando oresultados de uma experiência de metilação matriz péptido, o perfil de especificidade do PKMT pode ser definida e com base neste novos substratos podem ser baseiam. Matrizes de péptidos permite a validação rápida e eficiente custo da metilação de novos substratos para o nível de péptidos. Por isso, as matrizes são preparadas que contêm os novos substratos previstos em conjunto com os péptidos modificados contendo um Ala em vez de Lys nos locais-alvo, assim como péptidos de controlo positivos e negativos. Finalmente, os novos substratos podem ser preparados como proteínas, juntamente com os mutantes, em que o alvo é alterada Lys para Ala e a metilação pode ser confirmada ao nível da proteína. Dependendo dos resultados, este é então seguido por estudos biológicos referentes ao potencial papel da metilação dos substratos de proteínas recentemente descrita.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10299901</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td style="width:119px;">4193302</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidine &#8805; 99 % for Peptide Synthesis</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A122.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>8510860100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">N,N&#8217;-Diisopropylcarbodiimide purum &#8805; 98% GC</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>38370</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP28.1</td>
			<td>Flammable, Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilane 99%,</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>233781</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethane &#8805;99,9%</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P089.1</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-2-Pyrrolidone</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4306.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Derivatized cellulose Membrane</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">32.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P088.2</td>
			<td>Toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromphenolblue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T871.2</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td>Toxic, Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">MultiPep Synthesizer</td>
			<td style="width:112px;">Intavis AG K&#246;ln</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">HyperfilmTM high performance film</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28906837</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Phoretix software</td>
			<td style="width:112px;">TotalLab</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lisina metilação é uma modificação pós-tradução que emerge e tem sido identificado em várias proteínas de histonas e não-histonas, onde ele desempenha um papel crucial no desenvolvimento das células e muitas doenças. Cerca de 5.000 sítios de metilação de lisina foram identificados em diferentes proteínas, que são definidas por poucas dezenas de methyltransferases lisina proteína. Isto sugere que cada PKMT metila múltiplas proteínas, no entanto, até agora apenas um ou dois substratos foram identificados para várias destas enzimas. Analisa matriz peptídeo Para abordar este problema, nós introduzimos a especificidade do substrato base de PKMTs. Matrizes de péptidos são ferramentas poderosas para caracterizar a especificidade de PKMTs porque metilação de vários substratos com sequências diferentes podem ser analisadas numa matriz. Nós sintetizado matrizes peptídicas em membrana de celulose usando um sintetizador Intavis SPOT e analisou a especificidade de vários PKMTs. Com base nos resultados, para vários destes enzimas, romance substrates puderam ser identificados. Por exemplo, para NSD1 empregando matrizes de péptidos, que mostrou que metila K44 de H4 em vez do H4K20 relatados e em adição H1.5K168 é altamente preferido o substrato sobre o H3K36 anteriormente conhecido. Por isso, as matrizes de peptídeos são ferramentas poderosas para caracterizar bioquimicamente os PKMTs.

Matrizes de péptidos foram utilizados com sucesso para caracterizar bioquimicamente a especificidade de PKMTs, e foram identificados vários novel histonas e não-histonas substratos de PKMT por esta abordagem 5,16-19. Definindo o espectro substrato correta de um PKMT (ou qualquer enzima) é um passo essencial para a compreensão do seu mecanismo molecular e funções celulares. Como um exemplo da aplicação do método da matriz de metilação péptido SPOT, descrevem-se os resu...

Watch this Scientific Journal Video about Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays at JoVE.com

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K visualizações.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Vídeo: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Aplicação de Medidas para MassSQUIRM quantitativa da actividade demetilase Lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...