Os autores gostariam de agradecer e reconhecer o Conselho de Pesquisa Médica para o financiamento desta pesquisa - MRC-FAP código concessão G1000788-98812.

Fabrication 1.Scaffold e Esterilização <ol><li> Dissolve-PCL em 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol para dar um 10% w concentração / v. Tal como descrito em Bosworth et al, 9 electrospin solução polimérica (parâmetros: 20 kV, 1 ml / h, 20 cm). E recolher fibras alinhadas na extremidade de um mandril rotativo (600 rpm). Com um bisturi remover a fita de fibra recolhido e, em seguida, cortado em comprimentos mais curtos - 3 cm (para calhas e vasos rotativos) e 4 cm (para inserções de cultura de células) comprimentos. </li><li> Usando fórceps finos submergir tiras individuais em água destilada e remover. </li><li> Segurando as duas extremidades entre o polegar eo indicador; torcer manualmente a banda até que se assemelha a discussão. </li><li> Resumidamente submergir este andaime do tipo fio em água destilada e colocar no cartão limpo, não fibrosas para secar. </li><li> Depois de seco, realiza individualmente em tubos de microcentrífuga limpo e adicionar 1 ml de 50% v / v de etanol em água destilada. Fechar as tampas e deixe por 24 hr. Nota: Execute as seguintes etapas em fluxo laminar: </li><li> Colocar em tubos de microcentrífuga de uma câmara de fluxo laminar e aspirar a solução de v / v de 50%. Substituir com 1 ml de 70% v / v de etanol em água destilada, tampas de fechar e deixar durante 24 horas. </li><li> Repetir para 90% e 100% v / v de etanol em água destilada (1 ml de volume). </li><li> Lavar andaimes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), 24 h por lavagem (2 x 1 ml). </li><li> Remover PBS e substitua com 1 ml de meio de cultura de células. Nota: Os andaimes estão prontos para uso pós-24 hr. </li></ol> 2. Determinar Area Andaime superfície e número de células <ol><li> Usando um microscópio de luz e o software de imagem, medir o diâmetro do fio electrospun ao longo do seu comprimento para determinar um valor significativo. </li><li> Assuma que o fio de ser uma haste cilíndrica e aproximar a área de superfície utilizando: </li><li> Onde A = área de superfície, r = raio e h = comprimento Nota: A área de superfície foi calculada como sendo de 18.902, 800 mm 2. Além disso, deve notar-se que a área de superfície real será superior a este cálculo, o fio é composto por centenas de fibras finas, o que irá aumentar a área de superfície. Consequentemente, um número maior de células deve ser capaz de anexar ao cadafalso. No entanto, isto não afecta a uma comparação directa entre os grupos de teste a ser feito. </li><li> Determine o número máximo de células que poderia anexar à superfície andaime expostos por: Nota: Usando um microscópio de luz e o software de imagem, o diâmetro de células estaminais mesenquimais humanas foi determinada como sendo de 20 um (assumindo que as células são redondas), portanto, neste caso, o número de células = 60.200. </li></ol> 3. Andaime Set-up - Cultura Celular inserções (Figura 1A) <ol><li> Sob fluxo laminar, aberto estéreis as inserções de 6 poços de cultura de células e separar os anéis com dentes mais curtos a partir dos corpos em anel mais largo. </li><li> Pegue o anel com dentes apontando para cima. Armar umados quatro centímetros andaimes sobre o centro do anel de ter certeza que ele se sobrepõe em ambos os lados. Tirar o corpo e a posição dos anéis sobre o anel dentado e andaime e empurrar para baixo para garantir que o andaime fica em posição e encontra-se através do centro da inserção de cultura de célula. </li><li> Coloque a inserção de cultura de células com o andaime no poço de um de 6 poços, baixo placa de ligação. </li><li> Adicionar 10 ml de meio de cultura para o andaime. </li></ol> 4. Andaime Set-up - Trough (Figura 1B) <ol><li> Sob fluxo laminar, local de poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) calhas individuais em placas de petri e adicionam-se 10 ml de meio de cultura para a calha. </li><li> Usando fórceps armar um dos três centímetros andaimes para a calha, assegurando-se o seu comprimento situa-se paralelamente ao longo da calha de borda. </li></ol> 5. Andaime Set-up - Bioreactor Vessel (Figura 1C) <ol><li> Sob fluxo laminar, dispensar 10 ml de PBS estéril através do bioreactor de navioprincipal porto e deixe por 10 min. </li><li> Retire a PBS e substituir com 8 ml meios de cultura. </li><li> Usando pinças, inserir um dos suportes 3 centímetros para dentro do recipiente através da porta principal. </li><li> Fechar a porta principal. </li></ol> Contando 6. celular <ol><li> As células estaminais mesenquimais humanas de cultura (hMSC) derivadas de medula óssea de acordo com o protocolo do fabricante até 4 passagens, antes da colheita. </li><li> Aspirar a mídia a partir de um 75 centímetros 2 frasco contendo hMSCs derivadas da medula óssea (passagem 4, 80% de confluência). </li><li> Lavam-se as células com 10 ml de PBS estéril e aspirado. </li><li> Adicionar 3 ml de tripsina e incubar o balão a 37 ° C, 5% de CO2 até as células terem desalojado da superfície do frasco. </li><li> Adicionar 7 ml de meio de cultura para inactivar a enzima e transferir esse volume total (10 ml) para um tubo de centrífuga. </li><li> Ressuspender desta suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes para dispersar de forma homogénea no interior da célulasmeios de comunicação e aglomerados celulares limite (10 ml de pipeta). </li><li> Remover 20 pi de suspensão de células e transferir para um hemocitómetro. </li><li> Coloque o hemocitï¿½etro sob um microscópio e imagem luz no objetivo x10. </li><li> Concentre-se as linhas de grade e contar o número de células nos 4 x 4 quadrados em cada canto da rede e que se inserem no quadrado e aqueles que atravessam a mão direita ou linha de limite inferior. Contagem para cada conjunto de 4 x 4 quadrados (quatro contagens por grade). </li><li> Repita a ressuspensão e celular contagem três vezes (passos 6,6-6,9). </li><li> Calcula-se a média da contagem de células e determinação do volume de material necessário para a ressuspensão de células (concentração de células 60.200 em 200 ul). Por exemplo, determinar a contagem média de células do hemacitómetro e depois determinar o número médio total de células a partir dos três contagens separadas. Multiplicar este por 1 x 10 4 para indicar o número de células por ml e, em seguida, multiplica-se por o volume total de suspensão de células para dar anúmero tal de células. Utilize a seguinte equação para determinar o volume de mídia necessária para a ressuspensão: </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células a 241 xg durante 5 min. </li></ol> Sementeira 7. celular <ol><li> Aspirar a mídia do tubo centrifugado deixando o pellet celular e substituir com o volume de mídia calculado. </li><li> Ressuspender as células e os media para uma misturar mesmo. </li><li> Usando uma pipeta Gilson P200, dispensar lentamente 200 ul de suspensão celular em cada andaime rodando a ponta da pipeta ao longo do comprimento do andaime e abaixo da superfície do líquido de suporte. Deixe em repouso por 20 min. </li><li> Para as embarcações de biorreatores, dispensar 200 mL de suspensão de células através da porta principal. Parte-se do meio de cultura de 2 ml remanescente através das portas de seringa para dar um volume total de 10 ml. </li></ol> 8. Experimental Iniciar <ol><li> Transfira os vasos de biorreatores para o biorreator RCCS-4DQ e definir a rodar a 9 rpm. </li><li> TransFer as placas bem com inserções de cultura de células e os cavados para o agitador de placas, e por rodar a 30 rpm. </li><li> Transferem-se as placas bem com inserções de cultura de células e as calhas para a prateleira de uma célula incubadora fixada em 37 ° C, 5% de CO 2 (cultura estática). </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Preparar soluções - tampão de lise, 1x tampão TE, padrões de ADN e de solução de trabalho DNA celular - conforme as instruções do fabricante. </li><li> Após 4 horas, remover as amostras da incubadora e colocar sob fluxo laminar. </li><li> Retire as frações de mídia de todas as amostras e coloque em tubos de centrífuga marcados separadamente. Centrifugar os tubos 241 xg. Remover o sobrenadante e adicionar 3 ml de tampão de lise. Ressuspender a solução para quebrar-se o sedimento de células. </li><li> Utilizando uma pinça remover os andaimes e coloque em tubos de centrífuga contendo 3 ml de tampão de lise (para os andaimes no interior dos vasos de biorreatores, remova o andaime antes de aspirar o media). Para andaimes realizadas na inserções de cultura de células, em primeiro lugar libertar o andaime cortando o andaime perto da borda da inserção usando um bisturi. </li><li> Adicionar 3 ml de tampão de lise a cada recipiente de andaime e raspe a superfície (vigorosamente para agitar os recipientes reactores biológicos). Remover o tampão de lise e colocar em tubos de centrífuga rotulado separadamente. </li><li> Vortex de cada tubo de centrifugação durante cerca de 1 min para assegurar a agitação suficiente das células e o tampão e para estimular a lise da membrana celular. </li><li> Em um preto placa de 96 poços, adicione 100 ml de tampão de lise para cada fração amostral - andaime, mídia e bem (duplicar). </li><li> No escuro, adicionar 100 uL de solução de ADN celular de todos os poços contendo tampão de lise, e misturar suavemente. </li><li> Incluem os poços com tampão de lise contendo nenhuma solução de ADN e ADN de células para proporcionar um controlo negativa e positiva para o poço de placa. </li><li> Utilizando um leitor de placas de fluorescência, mede-se a absorvância do poços usando excitação a 485 nm e 520 nm de emissão. </li><li> Comparar os dados com a curva padrão gerada a partir dos padrões de ADN conforme as instruções do fabricante. </li></ol> 10. Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) Fixação <ol><li> Execute as seguintes etapas sob fluxo laminar: Após 4 horas, remover todos os scaffolds de seus recipientes e lugar dentro de uma nova placa de 6 poços (poços separados). </li><li> Lavar os andaimes duas vezes com PBS. </li><li> Execute as seguintes etapas no banco aberto: Para cada poço, adicione 2 ml de 1,5% v / v em PBS para garantir a cobertura completa do andaime. </li><li> Deixar a placa para um mínimo de 30 min a 4 ° C durante a fixação das células. </li><li> Remover a solução fixadora e lavam os andaimes duas vezes com PBS. </li><li> Desidratar os andaimes com concentrações crescentes de etanol em água destilada começando com 50% v / v, seguido por 70% v / v e 90% v / v. Para cada concentração, mergulhe totalmente os andaimes em solution (2 ml) e deixar durante 3 min. Descartar a solução e repita. </li><li> Desidratar em etanol a 100% por submergir completamente os suportes na solução (2 ml) e deixando durante 5 min. Descartar a solução e repita. </li><li> Quimicamente secar os scaffolds usando hexametildisilazano (HMDS) dentro de um exaustor. Mergulhe os andaimes em HMDS (2 ml) e deixe por 5 min. Retire os HMDS e repita. </li><li> Remover os HMDS e permitir que os andaimes para secar. Monte os andaimes sobre tocos SEM comercialmente disponíveis (neste caso topos de aço inoxidável com abas adesivas de carbono). </li><li> Para facilitar a visualização dentro do SEM, revestem-se as amostras usando um aplicador de ouro por borrifamento de 2 min para garantir uma cobertura fina e uniforme. </li><li> Colocar as amostras dentro do SEM e visualizar os scaffolds de células-semeado usando um feixe de elétrons 5 KeV. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Matrizes de fibra electrospun fabricados a partir de biopolímeros são regularmente utilizados para apoiar a fixação das células e proliferação de biomateriais e / ou aplicações de engenharia de tecidos 11,12. Nestes casos, as matrizes são muitas vezes folhas finas de fibras que facilmente cobrir toda a base de uma placa de cultura de células e, assim, estão em contacto total com células semeadas que melhora a fixação das células. No entanto, se o cadafalso biomaterial não cobrir totalmente a base da placa bem, há uma grande chance de que uma grande proporção das células semeadas não vai ficar em contato com o cadafalso e, finalmente, não será capaz de anexar. Este estudo investigou vários métodos diferentes para a sementeira de células para andaimes que não cobrem a base da placa com cavidades, a fim de determinar uma técnica optimizada que pode ser recomendado para experiências futuras baseados em células. Cinco diferentes set-ups foram investigados (Figura 1): ScaffoLDS (fio electrospun), realizada utilizando inserções de cultura de células dentro de placas de baixo bem ligação e ou mantidos sob condições estáticas ou agitado em 30 rpm; andaimes colocados dentro calhas PTFE estreitas e detidos estática ou abaladas em 30 rpm; e andaimes alojado dentro de vasos de biorreatores rotativas às 9 rpm. Determinar o número de células que tinham aderido aos fios electrospun por ensaio DNA demonstrou um baixo percentual de fixação para todos os semeando set-ups (Figura 2); e isto foi confirmado a partir de micrografias de varredura por electrões (SEM) (Figura 3). Fixação das células maior - 30% ou ~ 18.060 células -foi observado para os fios que foram realizadas dentro de inserções de cultura de células e sujeitos a movimento contínuo. Curiosamente, menor a fixação das células (15%) foi obtida para os fios mantidos por inserções de cultura de células, mas mantidos sob condições estáticas, o que sugere que a inclusão de movimento radial tem um efeito positivo sobre a manter as células em contacto com o andaime. No entanto,deve notar-se que circulando contínua de fluxo dos meios de comunicação pode ser responsável por aglomerados de células observadas a partir das imagens de SEM. O agitador de placas foi definido em sua configuração mais baixa - 30 rpm - o que poderia ser uma limitação para este set-up. Usando um movimento radial mais lenta pode ajudar a prevenir ou reduzir a aglomeração de células e também pode melhorar a fixação das células como células experimentará menos força. Experimentos futuros devem se concentrar em otimizar a velocidade do agitador ideal para uma melhor fixação das células. Incorporando movimento para fios realizadas dentro das calhas não resultou em uma tendência semelhante, com ambos os cenários produzindo 18% de fixação (~ 10.836 células); embora isto possa ser devido à flutuação parcial dos andaimes no interior das calhas (observada durante calhas colocadas no agitador de placas) por não terem sido ancoradas à base. Flutuante parcial do andaime vai impedir quaisquer células que se afundaram para o fundo da calha a partir de terem entrado em contacto com o material e aderente. Para tseu especial set-up, o cocho foi alojado dentro de um prato de petri e um volume total de 10 ml de media acrescentou. As pequenas dimensões da calha significa que a maior parte dos meios de comunicação está presente no interior da placa de petri e se houver qualquer movimento, as células podem afastar-se a partir da calha para a placa de petri e permanecer completamente fora do alcance do andaime. Para superar estas limitações, as experiências devem incluir um passo extra no protocolo, através do qual as extremidades dos andaimes são fixadas à base das calhas utilizando agulhas estéreis-finas, como este deve evitar a sua flutuação e movimento (particularmente para andaimes expostos a movimento radial), o que, em última análise deve levar a um aumento do número de células inerentes ao cadafalso. 16% de células tinham ligado aos fios presentes no interior dos vasos rotativos. Apesar de ser uma técnica bem estabelecida para a cultura 3D, os problemas que surgem com a remoção de andaimes do porto principal dos vasos, o que pode ter resultado em ATTAC vagamentecélulas HED sendo perdida. Os navios que pode ser totalmente aberto eliminaria este problema; estes estão disponíveis para aquisição, mas são consideravelmente mais caros do que os recipientes descartáveis ​​utilizados neste estudo. Este estudo demonstra os problemas atuais com a semeadura andaimes que não cobrem toda a base de placas de cultura de células normais. Semeando um número de celular conhecido resultou em menos de um terço de fixação para o cadafalso, apesar de a área de superfície do andaime permitindo a todas as células para aderir. Isto pode ter consequências prejudiciais em outros ensaios baseados em células, que pode avaliar o comportamento biocompatibilidade e célula-célula-célula de material / e interacções com a escora, tal como um potencial futuro dispositivo médico. As limitações do estudo podem incluir o ponto de momento de 4 h - apesar de ser suficientemente longo para garantir a sementeira inicial de células (células foram mostrados para prender firmemente a substratos dentro de trinta minutos 13,14,15), pode ser razoável emterrogam posteriores pontos temporais fornecimento de células não proliferam durante um espaço de tempo mais longo como este, de outra forma distorcer o número de células de partida. A redução do volume do meio, neste caso, 10 ml, poderiam também melhorar o contacto entre as células e andaime e, finalmente, aumentar a aderência celular. Futuros estudos devem considerar também a viabilidade celular como o processo de semeadura de células pode causar danos às células e / ou morte celular 16. Ensaios de ADN celular não diferenciar entre células viáveis ​​e não viáveis, como a / ensaio mortos tal ao vivo, por exemplo, gostaria de destacar o nível de viabilidade. Esta investigação aumenta a consciência para o número real de células que se ligam ao cadafalso apesar semeando uma quantidade conhecida. Para os estudos que se baseiam no número inicial de células, é muito importante que os pesquisadores sabem exatamente quantas daquela figura de fato aderir ao substrato de interesse.

Os andaimes são rotineiramente sendo desenvolvidos e pesquisados ​​para aplicações de biomateriais e engenharia de tecidos. Como tal, eles são vulgarmente semeadas com células e o seu comportamento in vitro, caracterizadas através de ensaios que determinam a proliferação celular e o número de células, por exemplo. Para experiências como essas, é imperativo que o número de células inicial é conhecida e pesquisadores freqüentemente a máxima concentração de semeadura, em termos de número de células por ml ou cm 2. Enquanto isto é uma boa prática, especialmente para fins de aumento de escala, que não tem em conta o número real de células que aderem à superfície de andaime (que também é dependente das propriedades adesivas da superfície do biomaterial 1). Isto é especialmente verdadeiro para os andaimes que não cobrem toda a base da célula de cultura bem como placa de células poderiam cair fora da construção e, devido à natureza muitas vezes estática do experimento, pode nunca mais voltar em contacto com o material de interesto. Fios de fibra electrospun são um bom exemplo de um andaime que não cobre a base da cavidade (Figura 1A). Neste caso, os baixos placas de poços de ligação que não foram tratados à superfície deve ser usada para evitar que as células de se ligarem à superfície da placa e, consequentemente, distorcem os resultados de qualquer ensaio bem fundamentada. Poços são facilmente utilizados para semeadura de células para andaimes, mas eles não são o único método disponível. Sistemas de cultura de células do Rotary, um tipo de biorreator desenvolvido pela Divisão de Ciências da Vida da NASA no final de 1980, da mesma forma pode ser usado para semear andaimes dentro de um ambiente tridimensional (3D) com microgravidade simulada. Este tipo de biorreator continua a ser uma escolha popular entre os pesquisadores em todo o mundo e tem sido incorporada nos estudos para a sinalização celular 2,3, as células estaminais e engenharia de tecidos de 4,5 6,7. O que faz com que o bioreactor rotativo preferível placas de poços é a manutençãode um ambiente 3D, o que ajuda a evitar que as células diferenciadas de dedifferentiating, como é frequentemente o caso quando cultivadas dentro de condições 2D convencionais 8. Este artigo investiga técnicas diferentes para sementeira de células estaminais mesenquimais humanas em electrospun poli (ε-caprolactona) como fios de fibra fabricada em Bosworth et al., 9, a fim de maximizar o número inicial de células ligadas a estes esqueletos dentro de um período de 4 h. Para a cultura 2D, os fios foram solidamente mantidos dentro de poços ou feitos sob medida de poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) calhas e mantidos em condições estáticas, ou agitado em 30 rpm. Para a cultura 3D, fios e células foram realizadas dentro dos vasos de biorreatores rotativas às 9 rpm.

<table><tbody><tr><td>Distilled water</td><td>in-house supply</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline solution</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC culture media</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Warmed to 37 oC before use</td></tr><tr><td>Supplement mix</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Antibiotic/antimyotic mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Warmed to 37 &amp;#176;C before use</td></tr><tr><td>Cell culture flasks (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Low binding 6-well plates</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-well CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petri-dish 50 ml deep</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>PTFE troughs</td><td>in-house production</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Shaker plate</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini Orbital Shaker</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Disposable C-Chip</td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>15 ml and 50 ml</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 and 25 ml</td></tr><tr><td>Gilson pipettes</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Micro test tube 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Assay set-up in the dark</td></tr><tr><td>Black 96-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent plate-reader</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium stubs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tabs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Gold sputter coater</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

A investigação sobre biomateriais e engenharia de tecidos, muitas vezes inclui investigações in vitro baseados em células, que exigem conhecimento inicial do número de células de partida. Enquanto os pesquisadores comumente referenciar a sua densidade de semeadura isso não indica necessariamente o número real de células que aderiram ao material em questão. Este é particularmente o caso dos materiais, ou andaimes, que não cobrem a base de placas de cultura de células padrão. Este estudo investiga a ligação inicial de células-tronco mesenquimais humanas semeados em um número conhecido em poli electrospun (ε-caprolactona) de fios após 4 horas em cultura. Fios electrospun foram realizadas dentro de vários set-ups diferentes, incluindo os navios de biorreatores rotativas às 9 rpm, inserções de cultura de células posicionadas em baixas poços de ligação e de politetrafluoretileno (PTFE) calhas colocadas dentro de caixas de Petri. Os dois últimos foram submetidos a condições tanto estáticas ou posicionado num agitador de placas (30 ° C, 5% de CO 2, o local de células semeadas foram determinados pelo ensaio de ADN da célula. Os andaimes foram removidos dos respectivos recipientes e colocados em tampão de lise. A fracção meio foi removido e centrifugado de forma semelhante - o sobrenadante descartado e o sedimento dividida com tampão de lise. O tampão de lise foi adicionada a cada recipiente, ou bem, e raspadas para libertar quaisquer células que possam estar presentes. O ensaio de DNA de células determinada a percentagem de células presentes no andaime, mídia e frações bem. A adesão celular foi baixa para todos os arranjos experimentais, com maior apego (30%) para os fios realizadas na inserções de cultura de células e sujeitas a agitação movimento. Este estudo levanta a consciência para o número real de células inerentes aos andaimes, independentemente da densidade de semeadura de células indicada.

Estes resultados indicam a localização das células seguintes quatro horas após a sementeira para cada conjunto experimental investigado. A Figura 2A demonstra a percentagem de células que têm ligado à superfície do andaime durante este tempo. Um factor de conversão de 8,5 pg / célula foi usada para converter o teor de ADN medido em número de células e, assim, determinar a percentagem de células 10. Para todos os semeadura set-ups investigado, o percentual de fixação das células é relativamente baixa, com maior aderência celular (30%) para andaimes realizadas na inserções de cultura de células e agitando a 30 rpm (Insert Shaker). Mais baixa aderência (15%) foi realizada por andaimes dentro das inserções de cultura de células e mantidos sob condições estáticas (Inserir estáticas). Um grande número de células estavam presentes dentro da fracção de media (Figura 2B), mais notavelmente para inserções de cultura de células mantidas dentro de placas de ligação (baixos) Inserir estáticas e vasos rotativos sendo 50% e 51%respectivamente. Andaimes realizada nos cochos demonstraram um elevado número de células presentes no interior do próprio titular - 48% das células para Trough Shaker e 50% para Trough estático. Microscopia eletrônica de varredura permitiram uma avaliação visual dos scaffolds de células-semeado (Figura 3). Imagens representativas em destaque uma presença limitada de células na superfície fibroso, independentemente de semear set-up. No entanto, um maior número de células e aglomerados celulares estavam presentes nos andaimes mantidos dentro das inserções de cultura de células e agitados a 30 rpm (Inserir Shaker). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> Figura 1. arranjos experimentais, onde electrospun Yarn é realizada dentro; (A) inserções de cultura de células e baixo bem placa de ligação; (B) poli (tetrafluoroetileno) (PTFE) cocho e placa de Petri; e (C) navio biorreator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> Figura 2. localização das células 4 horas pós-semeadura Onto PCL electrospun Yarns utilizando diferentes Sementeira set-ups. (A) Demonstra a percentagem de células que se ligaram ao andaime PCL (média ± desvio padrão); (B) evidencia a percentagem de propagação de célula local nas três fracções - meios de comunicação, e assim andaime (n = 4, apresentado como dados Os valores médios). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. O representante Eletrônica de Varredura micrografias para PCL electrospun Yarns com mesenquimais humanas células-tronco, 4 horas após a semeadura inicial utilizando diferentes arranjos experimentais. (Todas as imagens na ampliação 1000X, barra de escala = 130 m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K visualizações.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-layered Electrospinning para Mimic Arquitetura Arterial nativos usando policaprolactona, elastina e colágeno: um estudo preliminar

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Bioengenharia

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fundamentos eletrofiação: Solução de Otimização e Parâmetros Aparelho

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun fibrosa Andaimes de Poli (glicerol-dodecanedioate) para Engenharia Neural tecidos de rato as células estaminais embrionárias

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Fabricação de super-hidrofóbicas Materiais Poliméricos para aplicações biomédicas

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Eletrofiação Andaimes Polymer fibrosos para Engenharia de Tecidos e Cultura de Células

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Biologia

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Controlling Electrospun Polymer Morphology for Tissue Engineering Demonstrated Using hepG2 Cell Line

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of electrospun polymers is regarded as a structural imitation of the extracellular matrix (ECM). Hence, electrospun fibers fabricated from biocompatible polymers have been widely investigated by tissue engineering researchers for their potential role as an artificial ECM for guiding tissue growth both in vitro and in vivo. All cells are acutely sensitive to their mechanical environment. This has been demonstrated by the discovery of multiple mechanotransduction pathways intrinsically linked to the cytoskeletal actin filaments. The cytoskeleton acts as a mechanical sensor that can direct the functionality and differentiation of the host cell depending on the stiffness and morphology of its substrate. Electrospun fibers can be tuned both in terms of fiber size and morphology to easily modulate the mechanical environment within a fibrous polymer scaffold. Here, methods for electrospinning polycaprolactone (PCL) for three distinct morphologies at two different fiber diameters are described. The morphological fiber categories consist of randomly oriented fibers, aligned fibers, and porous cryogenically spun fibers, with 1 &#181;m and 5 &#181;m diameters. The methods detailed within this study are proposed as a platform for investigating the effect of electrospun fiber architecture on tissue generation. Understanding these effects will allow researchers to optimize the mechanical properties of electrospun fibers and demonstrate the potential of this technology more thoroughly.

This method provides the means to test different polycaprolactone fiber morphologies and topographies for the purpose of tissue engineering. Small and large fibers are fabricated with random orientations, aligned orientations, and also porous cryogenically electrospun structures and used as platforms for cell culture.