Gli autori desiderano ringraziare e riconoscere il Medical Research Council per il finanziamento di questa ricerca - MRC-FAP codice concessione G1000788-98812.

Fabrication 1.Scaffold e sterilizzazione <ol><li> Sciogliere PCL in 1,1,1,3,3,3-esafluoroisopropanolo per dare un 10% w / v concentrazione. Come descritto in Bosworth et al, 9 electrospin soluzione polimerica (parametri: 20 kV, 1 ml / hr, 20 cm). Raccogli fibre allineate sul bordo di un mandrino rotante (600 rpm). Con un bisturi rimuovere il nastro di fibra raccolte e poi tagliate in lunghezze più corte - 3 cm (per le depressioni e le navi rotanti) e 4 cm (per colture cellulari inserti) lunghezze. </li><li> Utilizzando una pinza sottile immergersi strisce individuali in acqua distillata e rimuovere. </li><li> Tenendo entrambe le estremità tra il pollice e l&#39;indice; ruotare manualmente il nastro fino a quando non assomiglia thread. </li><li> Brevemente immergere questo scaffold filiforme in acqua distillata e immissione sul pulito, carta non fibrose asciugare. </li><li> Una volta asciutto, posto singolarmente in tubi microcentrifuga pulito e aggiungere 1 ml di 50% v / v di etanolo in acqua distillata. Chiudere i coperchi e lasciare per 24 ore. Nota: Effettuare le seguenti operazioni sotto flusso laminare: </li><li> Inserire provette da microcentrifuga in una cappa a flusso laminare e aspirare il 50% v / v soluzione. Sostituire con 1 ml 70% v / v di etanolo in acqua distillata, chiudere i coperchi e lasciare per 24 ore. </li><li> Ripetere per 90% e il 100% v / v di etanolo in acqua distillata (1 ml volumi). </li><li> Lavare ponteggi due volte con tampone fosfato soluzione salina (PBS), 24 hr per lavaggio (2 x 1 ml). </li><li> Rimuovere PBS e sostituirlo con 1 ml di coltura cellulare multimediale. Nota: Ponteggi sono pronti per l&#39;uso post-24 ore. </li></ol> 2. Determinazione Area Scaffold superficie e numero di celle <ol><li> Utilizzando un microscopio e di imaging software luce, misurare il diametro del filo elettrofilate lungo la sua lunghezza per determinare un valore medio. </li><li> Si supponga che il filo ad una barra cilindrica e approssimare la superficie utilizzando: </li><li> Dove A = Superficie, r = raggio e h = lunghezza Nota: La superficie è stata calcolata essere 18.902, 800 micron 2. Inoltre, va notato che l&#39;area superficiale effettiva sarà maggiore di questo calcolo, il filo è costituito da centinaia di fibre fini, che aumentano la superficie. Di conseguenza un maggior numero di celle deve essere in grado di applicare al ponteggio. Tuttavia, questo non pregiudica un confronto diretto tra i gruppi di prova in corso. </li><li> Determinare il numero massimo di celle che possono attaccare alla superficie esposta scaffold da: Nota: Utilizzando un microscopio e di imaging software luce, il diametro di cellule staminali mesenchimali umane è stato determinato in 20 micron (cellule presumendo sono rotondi), quindi in questo caso, il numero di cellule = 60.200. </li></ol> 3. Scaffold Set-up - Colture Cellulari inserti (Figura 1A) <ol><li> Sotto flusso laminare, aprire i 6 e gli inserti di coltura cellulare sterili e separare gli anelli più brevi con i denti dai corpi più ampio inanellati. </li><li> Prendete l&#39;anello con i denti verso l&#39;alto. Telo unodei quattro centimetri scaffold sul centro del ring assicurandosi che sovrappone su entrambi i lati. Prendere il corpo e la posizione inanellati sopra l&#39;anello dentato e scaffold e spingere verso il basso assicurandosi che il ponteggio rimane in posizione e passa attraverso il centro dell&#39;inserto di coltura cellulare. </li><li> Collocare l&#39;inserto coltura cellulare con scaffold nel pozzo di una ben 6, basso piatto vincolante. </li><li> Aggiungere 10 ml di coltura al patibolo. </li></ol> 4. Scaffold Set-up - Trough (Figura 1B) <ol><li> Sotto flusso laminare, posto poli (tetrafluoroetilene) (PTFE) abbeveratoi in singole piastre di Petri e aggiungere 10 ml di terreni di coltura per la depressione. </li><li> Utilizzando pinze coprono una delle tre centimetri scaffold nel trogolo, assicurandosi che la sua lunghezza è parallelo al bordo più lungo del trogolo. </li></ol> 5. Scaffold Set-up - bioreattore Vessel (Figura 1C) <ol><li> Sotto flusso laminare, a meno di 10 ml di PBS sterile attraverso il bioreattore nave delporto principale e lasciare per 10 min. </li><li> Rimuovere la PBS e sostituirlo con 8 ml di coltura. </li><li> Utilizzando pinze, inserire uno dei ponteggi tre centimetri nel vaso attraverso la porta principale. </li><li> Chiudete la porta principale. </li></ol> 6. Conteggio delle cellule <ol><li> Le cellule staminali mesenchimali umane Cultura (hMSC) derivate dal midollo osseo in base al protocollo fabbricante, fino al passaggio 4 prima della raccolta. </li><li> Aspirare il supporto da 75 cm 2 pallone contenente hMSCs derivate dal midollo osseo (passaggio 4, 80% confluenza). </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS sterile e aspirare. </li><li> Aggiungere 3 ml di tripsina e incubare il matraccio a 37 ° C, 5% CO 2 finché le cellule hanno staccato dalla superficie matraccio. </li><li> Aggiungere 7 ml terreni di coltura per inattivare l&#39;enzima e trasferire questo volume totale (10 ml) in una provetta per centrifuga. </li><li> Risospendere la sospensione cellulare pipettando su e giù parecchie volte per disperdere in modo omogeneo le cellule all&#39;interno dellamedia e agglomerati di cellule limite (10 ml pipetta). </li><li> Rimuovere 20 ml di sospensione cellulare e trasferimento in un emocitometro. </li><li> Posizionare il emocitometro sotto un microscopio ottico e immagine a scopo x10. </li><li> Concentrarsi le griglie e contare il numero di cellule nei 4 x 4 quadrati in ogni angolo della rete e che rientra nell&#39;ambito di piazza e quelli che attraversano la mano destra o la linea di confine di fondo. Contare per ogni set di 4 x 4 quadrati (4 conteggi per griglia). </li><li> Ripetere il numero di risospensione e la cella per tre volte (passi 6,6-6,9). </li><li> Calcolare il numero medio di cellule e determinare il volume dei mezzi necessari per la risospensione delle cellule (concentrazione cellulare 60.200 in 200 ml). Ad esempio, determinare il numero di celle media dal emocitometro e quindi determinare il numero medio complessivo di cellule dai tre conteggi separati. Moltiplicare questo 1 x 10 4 invia il numero di cellule per ml e poi moltiplicare per il volume totale della sospensione cellulare per darenumero Tal di cellule. Utilizzare la seguente equazione per determinare il volume dei mezzi necessari per la risospensione: </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 241 xg per 5 min. </li></ol> Seeding 7. cellulare <ol><li> Aspirare il supporto dal tubo centrifugato lasciando il pellet e sostituire con il volume del supporto calcolato. </li><li> Risospendere le cellule e dei media per una miscela omogenea. </li><li> Usando una pipetta P200 Gilson, lentamente erogare 200 ml di sospensione cellulare su ogni scaffold eseguendo la punta della pipetta lungo la lunghezza scaffold e sotto la superficie del supporto liquido. Lasciare riposare per 20 minuti. </li><li> Per le navi bioreattori, erogare 200 ml di sospensione cellulare attraverso la porta principale. Top-up il rimanente mezzo di coltura 2 ml tramite le porte siringa per dare un volume totale di 10 ml. </li></ol> 8. Avvio sperimentale <ol><li> Trasferire i vasi bioreattore al bioreattore RCC-4DQ e impostare la rotazione a 9 giri. </li><li> TranSFER le piastre e con inserti di coltura cellulare e bassi alla piastra shaker e impostare la rotazione a 30 giri al minuto. </li><li> Trasferire le piastre e con inserti di coltura cellulare e bassi per il ripiano di un incubatore di cellule a 37 ° C, 5% CO 2 (cultura statica). </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Preparare le soluzioni tampone - lisi, tampone 1x TE, standard di DNA e di soluzioni di lavoro del DNA delle cellule - come da istruzioni del produttore. </li><li> Dopo 4 ore, togliere i campioni dal termostato e mettere sotto flusso laminare. </li><li> Rimuovere le frazioni multimediali da tutti i campioni e metterli in provette etichettati separatamente. Centrifugare le provette 241 xg. Rimuovere il surnatante e aggiungere tampone di lisi 3 ml. Risospendere la soluzione a rottura, il pellet di cellule. </li><li> Utilizzando pinze rimuovere i ponteggi e posto in provette contenenti 3 ml di tampone di lisi (per i ponteggi all&#39;interno dei vasi bioreattori, rimuovere l&#39;impalcatura prima aspirazione del media). Per ponteggi condotte nell&#39;ambito inserti di coltura cellulare, prima liberare l&#39;impalcatura tagliando il ponteggio vicino al bordo dell&#39;inserto con un bisturi. </li><li> Aggiungere 3 ml di tampone di lisi per ogni recipiente scaffold e raschiare la superficie (agitare energicamente per i vasi bioreattori). Rimuovere il tampone di lisi e mettere in provette etichettati separatamente. </li><li> Vortex ogni provetta da centrifuga per circa 1 min per garantire sufficiente agitazione delle cellule e bufferizzare e incoraggiare lisi della membrana cellulare. </li><li> In un nero 96 pozzetti, aggiungere 100 ml di tampone di lisi per ogni frazione del campione - impalcatura, media e ben (duplicare). </li><li> Nel buio, aggiungere 100 ml di soluzione di DNA delle cellule di tutti i pozzetti contenenti tampone di lisi e mescolare delicatamente. </li><li> Include pozzetti con tampone di lisi contenente nessun DNA e DNA cellulare soluzione per fornire un controllo negativo e positivo per la piastra bene. </li><li> Utilizzando una fluorescenza piatto-reader, l&#39;estinzione del pozzos utilizzando 485 nm di eccitazione e 520 nm di emissione. </li><li> Confrontare i dati con la curva standard generata dagli standard del DNA come da istruzioni del produttore. </li></ol> 10. Microscopio elettronico a scansione (SEM) Fixation <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di flusso laminare: Dopo 4 ore, rimuovere tutti i ponteggi dai loro recipienti e posto all&#39;interno di un nuovo 6-pozzetti (pozzetti separati). </li><li> Lavare i ponteggi due volte con PBS. </li><li> Effettuare le seguenti operazioni sul banco aperto: per ogni bene, aggiungere 2 ml di 1,5% v / v glutaraldeide in PBS per garantire una copertura completa del patibolo. </li><li> Lasciare la piastra per almeno 30 minuti a 4 ° C per il fissaggio delle cellule. </li><li> Rimuovere la soluzione fissativo e lavare i ponteggi due volte con PBS. </li><li> Disidratare i ponteggi con concentrazioni crescenti di etanolo in acqua distillata partendo da 50% v / v, seguito dal 70% v / v e 90% v / v. Per ogni concentrazione, immergere completamente i ponteggi in solution (2 ml) e lasciare per 3 min. Scartare la soluzione e ripetere. </li><li> Disidratare in 100% etanolo submersing pienamente scaffold in soluzione (2 ml) e lasciando per 5 min. Scartare la soluzione e ripetere. </li><li> Chimicamente asciugare i ponteggi con esametildisilazano (HMDS) all&#39;interno di una cappa. Immergere i ponteggi in HMDS (2 ml) e lasciare per 5 min. Rimuovere le HMDS e ripetere. </li><li> Rimuovere le HMDS e permettere ai ponteggi asciugare. Montare i ponteggi su disponibili in commercio stub SEM (in questo caso mozziconi in acciaio inox con alette in carbonio adesive). </li><li> Per facilitare la visualizzazione all&#39;interno del SEM, cappotto i campioni utilizzando una verniciatura gold-polverizzazione per 2 minuti per assicurare una copertura sottile e uniforme. </li><li> I campioni all&#39;interno del SEM e visualizzare i ponteggi cellulari testa di serie con un fascio di elettroni 5 keV. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Matrici fibra elettrofilate fabbricati da biopolimeri vengono regolarmente utilizzati per sostenere l&#39;adesione delle cellule e la proliferazione di biomateriali e / o ingegneria dei tessuti applicazioni 11,12. In questi casi, le matrici sono spesso sottili fogli di fibre che coprono facilmente l&#39;intera base di una piastra di coltura cellulare bene e quindi sono in completo contatto con cellule seminate che migliora l&#39;adesione cellulare. Tuttavia, se il ponteggio biomateriale non copre completamente la base della piastra ben, c&#39;è un&#39;alta probabilità che una gran parte delle cellule seminate non rimanere in contatto con l&#39;impalcatura e alla fine non sarà in grado di collegare. Questo studio ha esaminato diversi metodi per la semina cellule su scaffold che non coprono la base del piatto bene, al fine di determinare una tecnica ottimizzata che potrebbe essere raccomandato per gli esperimenti a base di cellule futuri. Cinque diversi set-up sono stati studiati (Figura 1): ScaffoLDS (filati elettrofilate) ha tenuto con inserti di coltura di cellule all&#39;interno di pozzetti vincolante bassi e sia mantenuto in condizioni statiche o agitato al 30 rpm; ponteggi collocati all&#39;interno depressioni PTFE strette e detenuti statica o scosso al 30 rpm; e ponteggi alloggiati all&#39;interno dei vasi bioreattori che ruotano a 9 giri. Determinazione del numero di cellule che avevano aderito ai filati elettrofilate tramite test del DNA ha dimostrato una bassa percentuale di attacco per tutti semina set-up (Figura 2); e questo è stata ulteriormente confermata dalla scansione microscopio elettronico (SEM) (Figura 3). Adesione cellulare Greatest - 30% o ~ 18.060 cellule -è stato osservato per filati che si sono svolte all&#39;interno di inserti di coltura cellulare e sottoposti a movimento continuo. È interessante notare che l&#39;adesione cellulare più basso (15%) è stato raggiunto per i filati detenuti da inserti di colture cellulari, ma tenuti in condizioni statiche, che suggerirebbero che l&#39;inclusione del movimento radiale ha un effetto positivo sul mantenimento delle cellule a contatto con il patibolo. Tuttavia,va notato che circuitazione del flusso continuo dei media potrebbe essere responsabile per gli agglomerati cellulari osservati dalle immagini SEM. La piastra shaker è stato fissato sulla sua minima - 30 giri - che potrebbe essere una limitazione di questo set-up. Con un movimento radiale più bassa può aiutare a prevenire o ridurre l&#39;agglomerazione delle cellule e può anche migliorare l&#39;adesione delle cellule, come le cellule sperimenteranno meno forza. Esperimenti futuri dovrebbero concentrarsi sull&#39;ottimizzazione della velocità shaker ideale per il fissaggio delle cellule migliorata. Incorporando proposta di filati ricoperte all&#39;interno delle mangiatoie non ha comportato un andamento simile, con entrambi gli scenari cedendo il 18% di attacco (~ 10.836 cellule); se questo può essere dovuto al galleggiamento parziale dei ponteggi all&#39;interno delle depressioni (osservata per mangiatoie immessi sul piatto agitatore) in quanto non sono stati ancorati alla base. Parziale galleggiamento del ponteggio impedirà qualsiasi cellule che hanno toccato il fondo della vasca di venire a contatto con il materiale e aderente. Per tla sua particolare configurazione, la vasca è alloggiato all&#39;interno di una capsula di Petri e un volume totale di 10 ml di supporti aggiunto. Le ridotte dimensioni del trogolo significa che la maggioranza dei media è presente all&#39;interno della capsula di Petri e se c&#39;è alcun movimento, cellule può allontanarsi dal trogolo nella capsula di Petri e rimanere completamente fuori dalla portata del ponteggio. Per superare queste limitazioni, ulteriori esperimenti dovrebbero includere un ulteriore passo nel protocollo, per cui le estremità dei ponteggi sono riposte alla base delle depressioni mediante fine-aghi sterili, come questo dovrebbe impedire il loro galleggiamento e movimento (in particolare per ponteggi esposti a movimento radiale), che alla fine dovrebbe portare ad un aumento del numero di cellule inerenti al patibolo. 16% delle cellule era attaccato ai fili presenti all&#39;interno dei vasi rotanti. Pur essendo una tecnica ben consolidata per la cultura in 3D, i problemi si presentano con la rimozione dei ponteggi dal porto principale di vasi &#39;, che possa aver provocato attac vagamentecellule HED sta perdendo. Le navi che possono essere completamente aperte eliminerebbe questo problema; questi sono disponibili per l&#39;acquisto, ma sono molto più costosi di quelli delle navi e getta utilizzati in questo studio. Questo studio dimostra i problemi attuali con la semina ponteggi che non coprono l&#39;intera base di piatti e standard di coltura cellulare. Semina un numero di cellule noto portato in meno di un terzo fissaggio al ponteggio, nonostante superficie del ponteggio consentendo tutte le cellule di aderire. Ciò potrebbe avere conseguenze negative in altri saggi cellulari che possono valutare il comportamento biocompatibilità e cellula-materiale / cellula-cellula e le interazioni con il patibolo come futuro dispositivo medico potenziale. Ulteriori limitazioni dello studio possono includere il 4 hr time-point - nonostante sia abbastanza lungo per garantire semina cellula iniziale (cellule hanno dimostrato di fissare saldamente ai substrati in trenta minuti 13,14,15), può essere ragionevole investigate successivi punti temporali fornire cellule non proliferano durante un periodo di tempo più lungo in quanto ciò altrimenti inclinare il numero di cellule di partenza. Ridurre il volume del supporto, in questo caso 10 ml, potrebbe anche migliorare il contatto tra le cellule e scaffold ed infine aumentare l&#39;adesione cellulare. Studi futuri dovrebbero anche considerare la vitalità delle cellule, come il processo di semina cellulare può causare danni alle cellule e / o morte cellulare 16. Test del DNA cellulare non distinguono tra le cellule vitali e non vitali, come un live test del genere / morto, per esempio, potrebbe evidenziare il livello di redditività. Questa indagine sensibilizza al numero effettivo di cellule che si attaccano al ponteggio nonostante seminare una quantità nota. Per gli studi che si basano sul numero iniziale di cellule, è molto importante che i ricercatori sapere esattamente quanti di quella figura fanno infatti aderire al substrato di interesse.

Ponteggi sono regolarmente sviluppati e studiati per le applicazioni di biomateriali e di ingegneria tissutale. Come tali, essi sono comunemente seminati con cellule e il loro comportamento in vitro caratterizzati tramite saggi che determinano la proliferazione cellulare e il numero di cellule, per esempio. Per gli esperimenti di questo tipo, è imperativo che il numero cellula iniziale sia noto ricercatori spesso indicare la concentrazione semina in termini di numero di cellule per ml o cm 2. Mentre questo è buona pratica, specialmente per scopi di scale-up, non tiene conto del numero effettivo di cellule che aderiscono alla superficie ponteggio (che dipende anche le proprietà adesive della superficie biomateriale 1). Ciò è particolarmente vero per ponteggi che non coprono l&#39;intera base della piastra di coltura cellulare e le cellule potrebbero cadere dal costrutto e, a causa della natura spesso statica dell&#39;esperimento, non possono mai tornare a contatto con il materiale di interiposo. Filati di fibre elettrofilate sono un buon esempio di un ponteggio che non copre la base del pozzetto (Figura 1A). In questo caso, piastre basse e vincolanti che non sono stati trattati in superficie dovrebbero essere usati per impedire alle cellule di attaccarsi alla superficie del piatto e quindi falsare i risultati di qualsiasi test basato su bene. Pozzetti sono facilmente utilizzati per la semina delle cellule su impalcature, ma non sono l&#39;unico metodo disponibile. Sistemi di coltura di cellule del Rotary, un tipo di bioreattore sviluppato dalla divisione Life Sciences della NASA alla fine del 1980, possono essere usati in modo simile alle sementi ponteggi all&#39;interno di un (3D) ambiente tridimensionale con microgravità simulata. Questo tipo di bioreattore rimane una scelta popolare con i ricercatori di tutto il mondo ed è stata incorporata in studi per la segnalazione delle cellule 2,3, cellule staminali e ingegneria dei tessuti 4,5 6,7. Ciò che rende il bioreattore rotante preferibile pozzetti è il mantenimentodi un ambiente 3D, che aiuta a prevenire le cellule differenziate da dedifferentiating, come spesso accade quando coltivate all&#39;interno di condizioni 2D tradizionali 8. Questo documento esamina diverse tecniche per la semina di cellule staminali mesenchimali umane su poli elettrofilate (ε-caprolattone) fili di fibre come fabbricato in Bosworth et al., 9 al fine di massimizzare il numero iniziale di cellule inerenti a tali impalcature entro un periodo di 4 ore. Per la cultura 2D, filati si sono svolte in modo sicuro all&#39;interno di pozzetti o poli su misura (tetrafluoroetilene) (PTFE) abbeveratoi e tenuti in condizioni statiche, o agitati a 30 giri al minuto. Per la cultura 3D, filati e le cellule si sono svolte all&#39;interno dei vasi bioreattori che ruotano a 9 giri.

<table><tbody><tr><td>Distilled water</td><td>in-house supply</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline solution</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC culture media</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Warmed to 37 oC before use</td></tr><tr><td>Supplement mix</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Antibiotic/antimyotic mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Warmed to 37 &amp;#176;C before use</td></tr><tr><td>Cell culture flasks (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Low binding 6-well plates</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-well CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petri-dish 50 ml deep</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>PTFE troughs</td><td>in-house production</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Shaker plate</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini Orbital Shaker</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Disposable C-Chip</td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>15 ml and 50 ml</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 and 25 ml</td></tr><tr><td>Gilson pipettes</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Micro test tube 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Assay set-up in the dark</td></tr><tr><td>Black 96-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent plate-reader</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium stubs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tabs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Gold sputter coater</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

La ricerca di biomateriali e ingegneria dei tessuti include spesso indagini basate sulle cellule in vitro, che richiedono la conoscenza iniziale del numero di cellule di partenza. Mentre i ricercatori comunemente riferimento loro densità di semina questo non indica necessariamente il numero effettivo di cellule che hanno aderito al materiale in questione. Ciò vale in particolare per i materiali, o ponteggi, che non coprono la base di piatti e standard di coltura cellulare. Questo studio indaga l&#39;attacco iniziale di cellule staminali mesenchimali umane seminate in un numero conosciuto su poli elettrofilate (ε-caprolattone) filato dopo 4 ore di cultura. Filati elettrofilate sono svolte all&#39;interno di diversi diversi set-up, comprese le navi bioreattore rotante a 9 giri, inserti di coltura cellulare posizionati in piastre e vincolanti bassi e politetrafluoroetilene (PTFE) abbeveratoi posti all&#39;interno piastre di Petri. Gli ultimi due sono stati sottoposti a condizioni sia statiche o posizionato su una tavola oscillante (30 37 ° C, 5% CO 2, la posizione di cellule seminate era determinato mediante saggio DNA cellulare. Scaffolds sono stati rimossi dai loro contenitori e collocate in tampone di lisi. La frazione di supporto è stato rimosso e centrifugato simile - il supernatante scartato e pellet rotto con tampone di lisi. Tampone di lisi è stato aggiunto a ciascun recipiente, o ben, e raschiato per liberare eventuali cellule che possono essere presenti. Il test del DNA delle cellule determinato la percentuale di cellule presenti nel patibolo, i media e le frazioni pure. Attaccamento cellulare era bassa per tutti nelle configurazioni, con la più grande attacco (30%) per i filati ricoperti nell&#39;ambito inserti di coltura cellulare e sottoposti a scuotimento movimento. Questo studio solleva la consapevolezza per il numero effettivo di cellule inerenti alle impalcature a prescindere dal dichiarato densità di semina delle cellule.

I risultati evidenziano la posizione delle celle seguenti 4 ore post-semina per ciascun set-up sperimentale indagato. Figura 2A mostra la percentuale di cellule che sono attaccati alla superficie ponteggio durante questo periodo. Un fattore di conversione di 8,5 pg / cella è stata utilizzata per convertire il contenuto di DNA misurata in numero di cellule e determinare la percentuale di cellule 10 così. Per tutti semina set-up studiato, la percentuale di adesione cellulare è relativamente bassa, con grande adesione cellulare (30%) per i ponteggi condotte nell&#39;ambito inserti colture cellulari e scosso al 30 rpm (Insert Shaker). Aderenza più basso (15%) è stato per ponteggi detenuti all&#39;interno degli inserti di coltura cellulare e tenuto in condizioni statiche (Insert statiche). Un gran numero di cellule erano presenti all&#39;interno della frazione supporto (Figura 2B), in particolare per gli inserti di coltura cellulare condotte nell&#39;ambito piastre basse vincolanti (Insert statiche) e imbarcazioni rotanti essendo il 50% e il 51%rispettivamente. Ponteggi ricoperte all&#39;interno delle depressioni hanno dimostrato un numero elevato di cellule presenti all&#39;interno del supporto stesso - 48% delle cellule per Trough Shaker e il 50% per Trough statico. Microscopia elettronica a scansione ha permesso una valutazione visiva degli scaffold di cellule-teste di serie (Figura 3). Immagini rappresentative evidenziato una limitata presenza di cellule sulla superficie fibrosa, indipendentemente semina set-up. Tuttavia, un numero maggiore di cellule e agglomerati cellulari erano presenti sui ponteggi condotte nell&#39;ambito degli inserti di coltura cellulare e scosso al 30 rpm (Insert Shaker). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> Figura 1. sperimentali Set-up, dove elettrofilate filato si svolge all&#39;interno; (A) inserti colture cellulari e piatto basso e vincolante; (B) poli (tetrafluoroetilene) (PTFE) attraverso e Petri; e (C) nave bioreattore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> Figura 2. Posizione di celle a 4 ore post-semina su PCL elettrofilate Filati utilizzando diversi Seminatrice Set-up. (A) dimostra la percentuale di cellule che si sono collegati al patibolo PCL (media ± deviazione standard); (B) evidenzia la diffusione percentuale di posizione della cella all&#39;interno delle tre frazioni - dei media, bene e scaffold (n = 4, i dati presentati come I valori medi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Rappresentante elettronici a scansione Micrografie per PCL elettrofilate Filati con cellule staminali mesenchimali umane, 4 ore dopo la semina iniziale utilizzando diversi set-up. (Tutte le immagini a 1,000X ingrandimento, barra della scala = 130 micron.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un grande versione di questa figura.</a>

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Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K Views.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-strato Electrospinning di Mimic nativa Architettura arteriosa utilizzando Policaprolactone, elastina e collagene: uno studio preliminare

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Ricerca

Bioingegneria

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Fondamenti electrospinning: Soluzione Ottimizzazione e parametri Apparatus

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Elaborazione Postproduzione di fibre elettrofilate per l&#39;ingegneria tissutale

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Elettrofilate Fibrosa Ponteggi di Poli (glicerolo-dodecanedioate) per l&#39;ingegneria neurale tessuti da cellule staminali embrionali di topo

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Realizzazione superidrofobiche Materiali Polimerici per applicazioni biomediche

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Electrospinning Ponteggi polimeri fibrosi per l&#39;ingegneria tissutale e colture cellulari

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Biologia

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Controlling Electrospun Polymer Morphology for Tissue Engineering Demonstrated Using hepG2 Cell Line

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of electrospun polymers is regarded as a structural imitation of the extracellular matrix (ECM). Hence, electrospun fibers fabricated from biocompatible polymers have been widely investigated by tissue engineering researchers for their potential role as an artificial ECM for guiding tissue growth both in vitro and in vivo. All cells are acutely sensitive to their mechanical environment. This has been demonstrated by the discovery of multiple mechanotransduction pathways intrinsically linked to the cytoskeletal actin filaments. The cytoskeleton acts as a mechanical sensor that can direct the functionality and differentiation of the host cell depending on the stiffness and morphology of its substrate. Electrospun fibers can be tuned both in terms of fiber size and morphology to easily modulate the mechanical environment within a fibrous polymer scaffold. Here, methods for electrospinning polycaprolactone (PCL) for three distinct morphologies at two different fiber diameters are described. The morphological fiber categories consist of randomly oriented fibers, aligned fibers, and porous cryogenically spun fibers, with 1 &#181;m and 5 &#181;m diameters. The methods detailed within this study are proposed as a platform for investigating the effect of electrospun fiber architecture on tissue generation. Understanding these effects will allow researchers to optimize the mechanical properties of electrospun fibers and demonstrate the potential of this technology more thoroughly.

This method provides the means to test different polycaprolactone fiber morphologies and topographies for the purpose of tissue engineering. Small and large fibers are fabricated with random orientations, aligned orientations, and also porous cryogenically electrospun structures and used as platforms for cell culture.

Ottimizzare Allegato di cellule staminali mesenchimali umane su Poli (ε-caprolattone) elettrofilate Filati

Riepilogo

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