Die Autoren bedanken sich für die Finanzierung dieser Forschung Dank und Anerkennung des Medical Research Council - MRC-FAP Zuschuss Code G1000788-98812.

1.Scaffold Herstellung und Sterilisation <ol><li> Löse PCL in 1,1,1,3,3,3-Hexafluorisopropanol, um eine 10% w / v-Konzentration zu ergeben. Dar. Wie in Bosworth et al, 9 elektrospinnen Polymerlösung (Parameter: 20 kV, 1 ml / h, 20 cm) beschrieben und sammeln ausgerichteten Fasern auf dem Rand einer rotierenden Dorn (600 rpm). Mit einem Skalpell entfernen Sie das Farbband der gesammelten Fasern und dann schneiden Sie in kürzeren Längen - 3 cm (für Mulden und Rundgefäße) und 4 cm (für die Zellkultur-Einsätze) Längen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette tauchen einzelnen Streifen in destilliertem Wasser, und entfernen. </li><li> Halten Sie beide Enden zwischen Daumen und Zeigefinger; manuell drehen Sie den Streifen bis es ähnelt Faden. </li><li> Kurz tauchen diese fadenförmigen Gerüst in destilliertem Wasser und setzen auf saubere, nicht-faserförmigen Karte, um zu trocknen. </li><li> Nach dem Trocknen statt einzeln in saubere Mikrozentrifugenröhrchen und 1 ml 50% v / v Ethanol in destilliertem Wasser. Schließen Sie den Deckel und lassen für 24 Std. Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter Laminar Flow: </li><li> Zeigen Mikrozentrifugenröhrchen in einer Sterilbank und saugen Sie den 50% v / v Lösung. Ersetzen mit 1 ml 70% v / v Ethanol in destilliertem Wasser, in der Nähe Deckel und lassen für 24 Stunden. </li><li> Wiederholung für 90% und 100% v / v Ethanol in destilliertem Wasser (1 ml Volumen). </li><li> Waschwarten zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 24 Stunden pro Waschung (2 × 1 ml). </li><li> PBS entfernen und ersetzen mit 1 ml Zellkulturmedien. Hinweis: Gerüste sind gebrauchsfertig nach dem 24-Stunden. </li></ol> 2. Bestimmen Gerüst Fläche und Anzahl der Zellen <ol><li> Verwendung eines Lichtmikroskops und Bildbearbeitungssoftware, den Durchmesser der elektrogesponnenen Garns entlang seiner Länge, um einen Mittelwert zu bestimmen. </li><li> Nehmen wir den Faden, um eine zylindrische Stange und den Oberflächen-Bereich mit: </li><li> A = Fläche, r = Radius und h = Länge Anmerkung: Die Oberfläche wurde berechnet, um 18.902 sein, 800 &amp; mgr; m 2. Ferner sei darauf hingewiesen, dass die tatsächliche Oberfläche größer sein wird als dieser Berechnung, wenn das Garn von Hunderten von feinen Fasern, die den Oberflächenbereich zu vergrößern wird zusammengesetzt sein. Folglich ist eine größere Anzahl von Zellen in der Lage, um das Gerüst zu befestigen. Allerdings bedeutet dies keine Auswirkungen auf einen direkten Vergleich zwischen den Testgruppen gemacht. </li><li> Bestimmung der maximalen Anzahl von Zellen, die an der freiliegenden Gerüstoberfläche anbringen könnte: Hinweis: Die Verwendung eines Lichtmikroskops und Bildbearbeitungssoftware, wurde der Durchmesser der humanen mesenchymalen Stammzellen bestimmt zu sein, 20 um (vorausgesetzt Zellen rund sind), also in diesem Fall, die Anzahl der Zellen = 60.200. </li></ol> 3. Gerüst Set-up - Zellkultureinsätze (1A) <ol><li> Unter laminaren Strömung, öffnen Sie die sterile 6-Well-Zellkultur-Einsätzen und trennen Sie die kürzeren Ringe mit Zähnen aus den breiteren beringten Körper. </li><li> Nehmen Sie den Ring mit den Zähnen nach oben. Hängen Sie einder 4 cm Gerüste über die Mitte des Rings sicherstellen, dass es Überschneidungen auf beiden Seiten. Nehmen Sie den beringten Körper und Position über dem Zahnkranz und Gerüst und nach unten drücken um sicherzustellen, das Gerüst bleibt in Position und liegt in der Mitte des Zellkultureinsatzes. </li><li> Setzen Sie den Zellkultureinsatz mit Gerüst in die Vertiefung einer 6-Well, niedrige Bindungsplatte. </li><li> 10 ml Kulturmedien zum Schafott. </li></ol> 4. Gerüst Aufbau - Trough (1B) <ol><li> Unter laminaren Strömung statt Poly (Tetrafluorethylen) (PTFE) Tröge in einzelne Petrischalen und 10 ml Kulturmedien, um den Trog. </li><li> Mit einer Pinzette drapieren eine der 3 cm Gerüsten in den Trog, um sicherzustellen, ihre Länge liegt parallel zur längeren Kante der Mulde ist. </li></ol> 5. Gerüst Aufbau - Bioreaktor Fahrzeug (1C) <ol><li> Unter laminaren Strömung, verzichten 10 ml sterilem PBS durch den Bioreaktor SchiffesHaupthafen und lassen für 10 Minuten. </li><li> Entfernen Sie die PBS und ersetzen mit 8 ml Kulturmedien. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie eine der 3 cm Gerüste in den Behälter über den wichtigsten Hafen. </li><li> Schließen Sie den Haupthafen. </li></ol> 6. Zellzählung <ol><li> Kultur menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSC) aus dem Knochenmark nach Herstellerprotokoll bis zu Durchgang 4 vor der Ernte ab. </li><li> Saugen Sie das Medium aus einer 75 cm 2 Kolben mit hMSCs aus dem Knochenmark (Durchgang 4, 80% Konfluenz) abgeleitet. </li><li> Mit 10 ml sterilem PBS und saugen Waschen Sie die Zellen. </li><li> 3 ml Trypsin und der Kolben wird bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen aus dem Kolben Oberfläche verdrängt. </li><li> 7 ml Kulturmedium, um das Enzym zu inaktivieren, und übertragen diese Gesamtvolumen (10 ml) in ein Zentrifugenröhrchen. </li><li> Resuspendieren diese Zellsuspension durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, um homogen zu dispergieren Zellen innerhalb derMedien und Grenze Zellagglomerate (10 ml Pipette). </li><li> Entfernen 20 ul der Zellsuspension und in ein Hämozytometer. </li><li> Stellen Sie das Hämocytometer unter einem Lichtmikroskop und Bild an x10 Ziel. </li><li> Konzentrieren Sie sich die Rasterlinien und die Anzahl der Zellen in den 4 x 4 Plätze in jeder Ecke des Rasters und die innerhalb des Platzes fallen und die, die den rechten oder unteren Grenzlinie überqueren. Count für jeden Satz von 4 x 4 Plätze (4 Zählungen pro Netz). </li><li> Wiederholen Sie die Aufwirbelung und Zellzahl dreimal (Schritte von 6,6 bis 6,9). </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Zellzahl und bestimmen die Lautstärke für die Zell Aufwirbelung (Zellkonzentration 60.200 in 200 ul) erforderlichen Medien. Beispielsweise bestimmen die durchschnittliche Zellenanzahl aus dem Hämocytometer und dann bestimmen die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen aus den drei getrennten Zählungen. Multipliziert mit 1 x 10 4 bis Anzahl der Zellen pro ml und dann multiplizieren mit dem Gesamtvolumen der Zellsuspension zu geben, geben,tal Anzahl der Zellen. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um Volumen für Aufwirbelung erforderlichen Medien zu bestimmen: </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 241 xg für 5 min. </li></ol> 7. Zellaussaat <ol><li> Saugen Sie das Medium aus dem zentrifugierten Rohr Verlassen des Zellpellet und ersetzen mit dem berechneten Mediavolumen. </li><li> Die Zellen und Medien für eine ausgeglichene Mischung. </li><li> Mit einem P200 Gilson Pipette langsam verzichten 200 ul der Zellsuspension auf jedem Gerüst, indem Sie die Spitze der Pipette entlang der Gerüstfeldlänge und unterhalb des Medienflüssigkeitsoberfläche. Lassen Sie ungestört für 20 Minuten. </li><li> Für Bioreaktorgefäße, verzichten 200 ul der Zellsuspension durch den Haupthafen. Top-up die restlichen 2 ml Kulturmedium über die Spritze Ports, um ein Gesamtvolumen von 10 ml zu ergeben. </li></ol> 8. Experimentelle starten <ol><li> Übertragen Sie die Bioreaktorgefäße zum RCCS-4DQ Bioreaktor und soll bei 9 min drehen. </li><li> TranSFER die Well-Platten mit Zellkultur-Einsätzen und Mulden auf die Rüttelplatte und soll bei 30 Umdrehungen pro Minute drehen. </li><li> Übertragen Sie die Well-Platten mit Zellkultur-Einsätzen und Mulden auf dem Regal eines Zellbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 (statische Kultur) eingestellt. </li></ol> 9. DNA Assay <ol><li> Bereiten Lösungen - Lyse-Puffer, 1x TE-Puffer, DNA-Standards und Zell-DNA Arbeitslösung - nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nach 4 Stunden, entfernen Sie die Proben aus dem Inkubator und legen unter Laminar Flow. </li><li> Entfernen Sie die Medien-Fraktionen aus allen Proben und legen in getrennt bezeichneten Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 241 x g. Entfernen Sie den Überstand und 3 ml Lyse-Puffer. Resuspendieren die Lösung für das Aufbrechen des Zellpellets. </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die Gerüste und in Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Lyse-Puffer (für die Gerüste in den Bioreaktor Gefäße, entfernen Sie das Gerüst vor dem Ansaugen der michdia). Für Gerüste im Zellkultureinsätze statt, zunächst das Gerüst frei, indem das Gerüst in der Nähe des Einsatzes Rand mit einem Skalpell. </li><li> 3 ml Lyse-Puffer zu jedem Gerüstbehälter und kratzen die Oberfläche (heftig bewegen für die Bioreaktorgefäße). Entfernen Sie den Lysepuffer und legen in gesondert gekennzeichnet Zentrifugenröhrchen. </li><li> Vortex jedem Zentrifugenröhrchen ca. 1 min auf eine ausreichende Bewegung der Zellen sicherzustellen und den Puffer und zur Lyse der Zellmembran zu fördern. </li><li> In einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen, fügen Sie 100 ul Lysepuffer für jede Probe Bruch - Gerüst, Medien und auch (duplizieren). </li><li> In der Dunkelheit, fügen Sie 100 ul der Zell-DNA-Lösung in jede Vertiefung Lysepuffer und vorsichtig mischen. </li><li> Umfassen Vertiefungen mit Lysepuffer, keine DNA und Zell-DNA-Lösung, um eine negative und positive Kontrolle für die Well-Platte bereitzustellen. </li><li> Mit Hilfe eines Fluoreszenzplattenleser, die Absorption des guts mit 485 nm Anregungs- und 520 nm Emissions. </li><li> Vergleichen Sie die Daten mit der Standardkurve aus den DNA-Standards nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. </li></ol> 10. Rasterelektronenmikroskop (SEM) Fixation <ol><li> Führen Sie folgende Schritte unter Laminar Flow: Nach 4 Stunden, entfernen Sie alle Gerüste aus ihren Aufnahmen und innerhalb eines neuen 6-Well-Platte (getrennte Wells). </li><li> Zweimal mit PBS waschen Gerüste. </li><li> Führen Sie folgende Schritte auf dem offenen Bank: Zu jeder Vertiefung 2 ml 1,5% v / v Glutaraldehyd in PBS, um eine vollständige Abdeckung des Gerüstes zu gewährleisten. </li><li> Lassen Sie die Platte für mindestens 30 Minuten bei 4 ° C für die Zellfixierung. </li><li> Entfernen Sie die Fixierungslösung und waschen Sie die Gerüste zweimal mit PBS. </li><li> Dehydratisieren die Gerüste mit steigenden Konzentrationen von Ethanol in destilliertem Wasser mit 50% v / v, gefolgt von 70% v / v und 90% v / v. Für jede Konzentration, die Gerüste in solutio voll eintauchenn (2 ml) und lassen Sie für 3 min. Entsorgen Sie die Lösung und wiederholen. </li><li> Entwässern in 100% Ethanol durch die vollständige Eintauchen in die Gerüste Lösung (2 ml) und lassen für 5 Minuten. Entsorgen Sie die Lösung und wiederholen. </li><li> Chemisch trocknen die Gerüste mit Hexamethyldisilazan (HMDS) in einem Abzug. Tauchen Sie die Gerüste in HMDS (2 ml) und lassen Sie für 5 min. Entfernen Sie die HMDS und wiederholen. </li><li> Entfernen Sie die HMDS und lassen Sie die Gerüste zum Trocknen. Montieren Sie die Gerüste auf handelsüblichen SEM Stubs (in diesem Fall Edelstahlstutzen mit Klebstoff Kohlenstoff Tabs). </li><li> Zur Erleichterung der Anzeige innerhalb des SEM, Mantel werden die Proben mit einem Gold Sputteranlage für 2 Minuten, um eine dünne und gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten. </li><li> Prüfmuster im SEM und visualisieren die Zellaussaat Gerüste mit einem 5 keV Elektronenstrahl. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Elektro Fasermatrizen aus Biopolymeren hergestellt werden regelmäßig verwendet, um die Zellhaftung und Proliferation zu Biomaterial und / oder Tissue-Engineering-Anwendungen 11,12 unterstützt. In diesen Fällen sind die Matrizen oft dünne Blätter aus Fasern, die leicht bedecken die gesamte Basis einer Zellkultur-Well-Platte und sind somit in vollständigen Kontakt mit ausgesäten Zellen, welche die Zellhaftung verbessert. Wenn jedoch die von Biomaterialien, nicht vollständig die Basis der Platte mit Vertiefungen zu bedecken, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ein Großteil der angesiedelten Zellen werden nicht in Kontakt mit dem Gerüst zu bleiben und letztendlich nicht in der Lage zu befestigen. Diese Studie untersuchte verschiedene Vorgehens Impfen von Zellen auf Gerüsten, die nicht decken die Basis der Platte mit Vertiefungen, um ein optimiertes Verfahren, das für zukünftige zellbasierten Experimenten empfohlen werden könnte bestimmen. Fünf verschiedene Set-ups untersucht (Abbildung 1): scaffolds (elektro Garn) statt mit Zellkultur-Einsätzen in geringen Bindungs ​​Well-Platten und entweder unter statischen Bedingungen gehalten oder bei 30 Upm geschüttelt; Gerüste in engen PTFE Wannen und hielt statisch oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt; und Gerüsten innerhalb Bioreaktorgefäße 9 UpM untergebracht. Bestimmen der Anzahl von Zellen, die an die elektro Garne durch DNA Assay halten hatten gezeigt, ein geringer Prozentsatz der Befestigung für alle Impfen Aufbauten (Abbildung 2); und dies wurde weiter aus rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen (SEM) (Abbildung 3) bestätigt. Greatest Zellhaftung - 30% bzw. ~ 18.060 Zellen -wurde für Garne, die in Zellkultur-Einsätzen gehalten und zu einer kontinuierlichen Bewegung unterzogen wurden nicht beobachtet. Interessanterweise wurde niedrigsten Zellanheftung (15%) für Garne von Zellkultureinsätzen gehalten, sondern unter statischen Bedingungen gehalten wird, die darauf schließen ließen, dass die Aufnahme von Radialbewegung hat einen positiven Effekt auf halten Zellen in Kontakt mit dem Gerüst erreicht. Jedochist darauf hinzuweisen, dass eine kontinuierliche kreisFluss der Medien kann für die aus den REM-Aufnahmen beobachtet Zellagglomerate verantwortlich sein werden. Die Rüttelplatte auf die niedrigste Einstellung gesetzt - 30 Umdrehungen pro Minute - das ist eine Einschränkung zu diesem Set-up sein könnte. Mit einem langsameren radiale Bewegung kann helfen, zu verhindern oder zu reduzieren Zell Agglomeration und könnte auch zu verbessern Zellhaftung als Zellen weniger Kraft zu erleben. Zukünftige Experimente sollten sich auf die Optimierung der ideal-Geschwindigkeit für eine verbesserte Zellhaftung zu konzentrieren. Die Einbeziehung Bewegung für Garne innerhalb der Rinnen gehalten nicht in einem ähnlichen Trend ergeben, wobei beide Szenarien ergeben 18% Befestigung (~ 10.836 Zellen); wenn dies aufgrund der teilweisen Flotation der Gerüste innerhalb der Rinnen sein, da sie nicht an der Basis verankert ist (bei Mulden auf der Rüttelplatte platziert beobachtet). Teil Floating des Gerüsts werden alle Zellen, die zu dem Boden des Troges aus in Kontakt mit dem Material und anhaftende versenkt verhindern. Für tseinen besonderen Aufbau, der Trog in eine Petrischale untergebracht ist und insgesamt 10 ml Mediumvolumen aufgenommen. Die kleinen Abmessungen der Mulde so dass die Mehrzahl der Medien innerhalb der Petrischale vorhanden ist, und wenn es irgendeine Bewegung, können Zellen von der Rinne in die Petrischale Drift und bleiben vollständig unzugänglich des Gerüsts. Um diese Einschränkungen zu überwinden, sollten weitere Experimente einen zusätzlichen Schritt in dem Protokoll ist, wobei die Enden der Gerüste sind an der Basis der Mulden mit sterilen feinen Nadeln fixierten umfassen, da dies ihre Flotation und Bewegung (insbesondere bei Gerüsten ausgesetzt wird Radialbewegung), die letztlich zu einer erhöhten Anzahl von Zellen, die Befestigung am Gerüst führen. 16% der Zellen, die innerhalb der Drehgefäßen vorhanden Garne beigefügt hatte. Obwohl es eine gut etablierte Technik für 3D-Kultur, hat Probleme mit dem Abbau von Gerüsten vom Haupthafen der Schiffe, die in lose attac geführt hat ergebenhed Zellen verloren gehen. Die Schiffe, die vollständig geöffnet werden würde, dieses Problem zu beseitigen; diese sind erhältlich, sind jedoch erheblich teurer als die Einweggefäße in dieser Studie verwendet. Diese Studie zeigt die aktuellen Probleme mit der Aussaat Gerüste, die nicht die gesamte Basis von Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. Impfen eines bekannten Zellzahl ergab weniger als ein Drittel Befestigung an dem Gerüst, trotz der Gerüstoberfläche, die auf allen Zellen anhaften. Dies kann nachteilige Auswirkungen auf andere zellbasierten Assays, die die Biokompatibilität und Zellmaterial / Zell-Zell-Verhalten und Wechselwirkungen mit dem Gerüst als mögliche zukünftige medizinische Vorrichtung beurteilen kann. Weitere Einschränkungen der Studie kann die 4 Stunden Zeitpunkt sind - obwohl sie lange genug, um anfängliche Zellaussaat zu gewährleisten (Zellen wurde gezeigt, fest an Substraten anzubringen innerhalb 30 Minuten 13,14,15), kann es sinnvoll sein, investigate späteren Zeitpunkten Bereitstellung von Zellen nicht über einen längeren Zeitrahmen vermehren, da dies sonst neigen die Anfangszellzahl. Reduzieren des Volumens der Medien, in diesem Fall 10 ml, könnte auch der Kontakt zwischen den Zellen und Gerüst zu verbessern und letztlich zu erhöhen Zellanheftung. Zukünftige Studien sollten auch die Lebensfähigkeit der Zellen betrachten, da der Prozess der Zellaussaat können Zellschäden und / oder Zelltod 16 verursachen. Zell-DNA-Assays nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Zellen zu differenzieren, die als solche eine lebend / tot-Assay, beispielsweise das Niveau der Lebensfähigkeit markieren würde. Diese Untersuchung schärft das Bewusstsein der tatsächlichen Anzahl von Zellen, die zum Schafott legen trotz der Aussaat eine bekannte Menge. Für Studien, die in der Start Anzahl der Zellen zu verlassen, ist es sehr wichtig, dass die Forscher genau, wie viele dieser Figur in der Tat auf dem Substrat haften von Interesse zu tun.

Gerüste werden regelmäßig weiterentwickelt und für Biomaterialien und Tissue-Engineering-Anwendungen untersucht. Als solche sind sie allgemein mit Zellen und ihre in vitro-Verhalten über Tests, die Zellproliferation und Zellzahl zu bestimmen, beispielsweise dadurch ausgesät. Für Experimente, wie diese, ist es zwingend erforderlich, dass die anfängliche Zellzahl bekannt ist und Forscher Staat häufig die Seeding-Konzentration in Bezug auf die Anzahl der Zellen pro ml oder cm 2. Dies ist zwar eine gute Praxis, insbesondere für Scale-up-Zwecke, ist es nicht für die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an die Gerüstoberfläche (die auch abhängig von den Klebeeigenschaften der Biomaterialoberfläche 1) haften ausmachen. Dies gilt insbesondere für Gerüste, die nicht die gesamte Basis der Zellkultur-Well-Platte abdecken als Zellen vom Konstrukt fallen könnten und aufgrund der oft statische Natur des Experiments kann nie in Kontakt mit dem Material der inte zurückkommenRuhe. Elektrofasergarne sind ein gutes Beispiel für ein Gerüst, das nicht den Boden der Vertiefung (1A) umfasst. In diesem Fall sollte eine niedrige Bindungs ​​Well-Platten, die nicht oberflächenbehandelt wurden verwendet, um Zellen von der Befestigung an der Plattenoberfläche und somit die Ergebnisse verzerrt jedes gut basierten Assay zu verhindern. Well-Platten sind leicht zur Zellbesiedelung verwendet, auf Gerüsten, aber sie sind nicht die einzige Methode zur Verfügung. Rotary Zellkultursysteme, eine Art Bioreaktor durch den Lebenswissenschaften bei der NASA in den späten 1980er Jahren entwickelt wurde, können auf ähnliche Weise verwendet werden, um Gerüste in einem dreidimensionalen (3D) Umgebung mit simulierten Mikrogravitation zu impfen. Diese Art der Bioreaktor bleibt eine beliebte Wahl mit Forschern weltweit und wurde in Studien zur Zellsignal 2,3 aufgenommen, Stammzellen und Tissue Engineering 4,5 6,7. Was macht den Dreh Bioreaktor vorzuziehen, Well-Platten ist die Aufrechterhaltungeiner 3D-Umgebung, was dazu beiträgt, differenzierten Zellen Entdifferenzierung vermeiden, wie es oft der Fall, wenn in herkömmlichen 2D-Bedingungen 8 kultiviert. Dieser Aufsatz untersucht verschiedene Techniken zur Aussaat humanen mesenchymalen Stammzellen auf elektro Poly (ε-caprolacton) Fasergarne wie in Bosworth et al., 9, um die anfängliche Anzahl von Zellen Befestigung an dieser Gerüste innerhalb von 4 Stunden-Zeitraum zu maximieren hergestellt. Für 2D-Kultur wurden Fäden sicher in Well-Platten oder maßgeschneiderte Poly (Tetrafluorethylen) (PTFE) Mulden gehalten und unter statischen Bedingungen gehalten, oder bei 30 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Für 3D-Kultur wurden Garne und Zellen im Bioreaktor Gefäße 9 UpM gehalten.

<table><tbody><tr><td>Distilled water</td><td>in-house supply</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1117271000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline solution</td><td>Life Technologies</td><td>70013016</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-12974</td><td></td></tr><tr><td>MSC culture media</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-28010B</td><td>Warmed to 37 oC before use</td></tr><tr><td>Supplement mix</td><td>PromoCell GmbH</td><td>C-39810</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Antibiotic/antimyotic mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>Add to culture media</td></tr><tr><td>Trypsin (0.05%) EDTA (0.02%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59417C</td><td>Warmed to 37 &amp;#176;C before use</td></tr><tr><td>Cell culture flasks (T75)</td><td>Becton Dickinson Ltd</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Low binding 6-well plates</td><td>Costar Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>6-well CellCrowns</td><td>Scaffdex</td><td>C00003S</td><td></td></tr><tr><td>Petri-dish 50 ml deep</td><td>Sterilin</td><td>124</td><td></td></tr><tr><td>PTFE troughs</td><td>in-house production</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td></td></tr><tr><td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4DQ</td><td></td></tr><tr><td>Shaker plate</td><td>Stuart</td><td>SSM1</td><td>Mini Orbital Shaker</td></tr><tr><td>Haemocytometer</td><td>Digital Bio</td><td>DHC-F01</td><td>Disposable C-Chip</td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Deltalab</td><td>352096, 429901</td><td>15 ml and 50 ml</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich</td><td>Rotafix 32 A</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 3 ml</td><td>Shield Medicare Ltd</td><td>3039820</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Sterilin</td><td>40305, 47310, 40125</td><td>5, 10 and 25 ml</td></tr><tr><td>Gilson pipettes</td><td>SLS</td><td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td><td>P2 - P1000</td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>SLS</td><td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td><td></td></tr><tr><td>Micro test tube 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30125.15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen Assay</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>Assay set-up in the dark</td></tr><tr><td>Black 96-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent plate-reader</td><td>BGM Labtech</td><td>FLUOstar Optima</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>TAAB Laboratories</td><td>G002</td><td>Made to a concentration of 1.5% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td><td>Sigma</td><td>999-97-3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium stubs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G301</td><td></td></tr><tr><td>Carbon tabs (SEM)</td><td>Agar Scientific</td><td>G3347N</td><td></td></tr><tr><td>Gold sputter coater</td><td>Edwards</td><td>S150B</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td><td>Phenom World</td><td>Phenom Pro</td><td></td></tr></tbody></table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

Erforschung von Biomaterialien und Tissue Engineering umfasst oft zellbasierten In-vitro-Untersuchungen, die ersten Kenntnisse der Ausgangszellzahl erfordern. Während die Forscher üblicherweise Referenz ihrer Einsaatdichte dies nicht notwendigerweise die tatsächliche Anzahl der Zellen, die an das betreffende Material anhaften. Dies ist insbesondere für Materialien oder Gerüste, die nicht die Basis des Standard-Zellkulturplatten gut abdecken. In dieser Studie wird die anfängliche Befestigung der menschlichen mesenchymalen Stammzellen in einer bekannten Anzahl an elektrogesponnen Poly (ε-caprolacton) Garn nach 4 h in Kultur angeimpft. Elektrogesponnene Garne wurden in verschiedenen Aufbauten gehalten, einschließlich Bioreaktor Gefäße auf 9 Upm Zellkultureinsätze in geringen Bindungs ​​Well-Platten und Polytetrafluorethylen (PTFE) Gräben von Petrischalen platziert positioniert dreht. Die beiden letzteren wurden entweder statischen Bedingungen auf einer Rüttelplatte ausgesetzt oder aufgestellt (30 bei 37 ° C, 5% CO 2 wurde die Position der ausgesäten Zellen durch Zell-DNA-Assay bestimmt. Gerüste wurden aus ihren Behältern entfernt und in Lysepuffer gelegt. Die Medien-Fraktion wurde entfernt und in ähnlicher Weise zentrifugiert - der Überstand verworfen und Pellet mit Lysispuffer gebrochen. Lyse-Puffer wurden zu jedem Gefäß oder hinzugefügt, so, und abgeschabt, um alle Zellen, die vorhanden sein können, zu befreien. Das Zell-DNA-Test bestimmt den Prozentsatz an Zellen innerhalb des Stützgerüsts vorliegen, Medien und auch Fraktionen. Zellhaftung gering war für alle Versuchsanordnungen, mit größter Anlage (30%) für Garne in Zellkultur-Einsätzen gehalten und Schüttelbewegung unterzogen. Diese Studie sensibilisiert auf die tatsächliche Anzahl von Zellen verbundenen, unabhängig von der genannten Zellansiedlungsdichte Warten.

Die Ergebnisse unterstreichen die Position der Zellen nach 4 Stunden nach der Aussaat für die einzelnen Versuchsaufbau untersucht. 2A zeigt den Prozentsatz an Zellen, die in dieser Zeit zum Schafott Oberfläche angebracht haben. Ein Umwandlungsfaktor von 8,5 pg / Zelle wurde verwendet, um die gemessene DNA-Gehalt in der Zellzahl umzuwandeln und somit den Prozentsatz der Zellen 10. Für alle Aussaat Aufbauten untersucht, ist der Prozentsatz der Zellhaftung relativ gering, mit größten Zellhaftung (30%) für Gerüste in Zellkultur-Einsätzen gehalten und bei 30 Umdrehungen pro Minute (Insert Shaker) erschüttert. Niedrigster Halten (15%) war für Gerüste in den Zellkultur-Einsätzen gehalten und unter statischen Bedingungen (Statischer Insert) gehalten. Eine große Anzahl von Zellen innerhalb des Medienfraktion (2B) vorhanden waren, vor allem für die Zellkultur-Einsätzen innerhalb niedrige Bindungsplatten (Static Insert) und rotierenden Gefäßen gehalten wobei 50% bis 51%jeweils. Gerüste innerhalb der Rinnen gehalten zeigten eine erhöhte Anzahl von Zellen in dem Halter selbst vorhanden - 48% der Zellen, die für Trough Shaker und 50% für Trough Static. Rasterelektronenmikroskopie erlaubt eine visuelle Beurteilung der Zellaussaat Gerüste (Abbildung 3). Repräsentative Bilder markiert eine begrenzte Anwesenheit von Zellen auf der Faseroberfläche, unabhängig von der Aussaat Set-up. Jedoch eine größere Anzahl von Zellen und Zell Agglomerate auf den Gerüsten in den Zellkultur-Einsätzen gehalten und mit 30 UpM (Shaker Insert) geschüttelt vorhanden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> Abbildung 1. Versuchsanordnungen, in denen Elektrogesponnene Garne innerhalb Besitz; (A) Zellkultur-Einsätze und niedrige Bindungs ​​Well-Platte, (B) Poly (tetrafluorethylen) (PTFE) Trog und Petrischale; und (C) Bioreaktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> Abbildung 2. Position der Zellen 4 Stunden nach der Aussaat auf PCL Elektrogesponnene Garne mit verschiedenen Seeding Set-ups. (A) Zeigt den Prozentsatz an Zellen, die mit dem PCL-Gerüst angebracht haben (Mittelwert ± Standardabweichung), (B) verdeutlicht die prozentuale Verbreitung des Zellenposition innerhalb der drei Fraktionen - Medien, gut und Gerüst (n = 4, Daten vorgestellt Mittelwerte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Repräsentative Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen für PCL Elektrogesponnene Garne mit humanen mesenchymalen Stammzellen, 4 Stunden nach der Initial Seeding mit unterschiedlichen Versuchsanordnungen. (Alle Bilder auf 1,000x Vergrößerung, Balken = 130 &amp; mgr; m.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.</a>

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Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K Aufrufe.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Serie: Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(ε-caprolactone) Electrospun Yarns

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-geschichteten Elektrospinnen zu Native Arterielle Architektur mit Polycaprolacton, Elastin und Collagen Mimic: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Forschung

Biotechnik

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Elektrospinnen Grundlagen: Optimierung Solution und Geräteparameter

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Biologie

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to prevent and treat sexually transmitted infections (STIs). Moreover, many EF technologies focus on encapsulating the active agent, relative to utilizing the surface to impart biofunctionality. Here we describe a method to fabricate and surface-modify poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) electrospun fibers, with the potent antiviral lectin Griffithsin (GRFT). PLGA is an FDA-approved polymer that has been widely used in drug delivery due to its outstanding chemical and biocompatible properties. GRFT is a natural, potent, and safe lectin that possesses broad activity against numerous viruses including human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). When combined, GRFT-modified fibers have demonstrated potent inactivation of HIV-1 in vitro. This manuscript describes the methods to fabricate and characterize GRFT-modified EFs. First, PLGA is electrospun to create a fiber scaffold. Fibers are subsequently surface-modified with GRFT using 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS)chemistry. Scanning electron microscopy (SEM) was used to assess the size and morphology of surface-modified formulations. Additionally, a gp120 or hemagglutinin (HA)-based ELISA may be used to quantify the amount of GRFT conjugated to, as well as GRFT desorption from the fiber surface. This protocol can be more widely applied to fabricate fibers that are surface-modified with a variety of different proteins.

This manuscript describes the procedure to fabricate and characterize Griffithsin-modified poly(lactic-co-glycolic acid) electrospun fibers that demonstrate potent adhesive and antiviral activity against human immunodeficiency virus type 1 infection in vitro. Methods used to synthesize, surface-modify, and characterize the resulting morphology, conjugation, and desorption of Griffithsin from surface-modified fibers are described.

Herstellung und Charakterisierung von Griffithsin-modifizierte Faser Gerüste für die Prävention von sexuell übertragbare Infektionen

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

Controlling Electrospun Polymer Morphology for Tissue Engineering Demonstrated Using hepG2 Cell Line

Electrospinning affords researchers the opportunity to fabricate reproducible micro to nanoscale polymer fibers. The 3D fibrous architecture of electrospun polymers is regarded as a structural imitation of the extracellular matrix (ECM). Hence, electrospun fibers fabricated from biocompatible polymers have been widely investigated by tissue engineering researchers for their potential role as an artificial ECM for guiding tissue growth both in vitro and in vivo. All cells are acutely sensitive to their mechanical environment. This has been demonstrated by the discovery of multiple mechanotransduction pathways intrinsically linked to the cytoskeletal actin filaments. The cytoskeleton acts as a mechanical sensor that can direct the functionality and differentiation of the host cell depending on the stiffness and morphology of its substrate. Electrospun fibers can be tuned both in terms of fiber size and morphology to easily modulate the mechanical environment within a fibrous polymer scaffold. Here, methods for electrospinning polycaprolactone (PCL) for three distinct morphologies at two different fiber diameters are described. The morphological fiber categories consist of randomly oriented fibers, aligned fibers, and porous cryogenically spun fibers, with 1 &#181;m and 5 &#181;m diameters. The methods detailed within this study are proposed as a platform for investigating the effect of electrospun fiber architecture on tissue generation. Understanding these effects will allow researchers to optimize the mechanical properties of electrospun fibers and demonstrate the potential of this technology more thoroughly.

This method provides the means to test different polycaprolactone fiber morphologies and topographies for the purpose of tissue engineering. Small and large fibers are fabricated with random orientations, aligned orientations, and also porous cryogenically electrospun structures and used as platforms for cell culture.