O protocolo estuda neurônios de grânulos cerebelares em diferentes estágios de desenvolvimento, a fim de visualizar o crescimento morfológico chave. As vantagens da técnica incluem segmentação específica da célula, expressão rápida de construções transfectadas e marcação esparsa de células, o que permite o estudo dos efeitos autônomos celulares. Comece cortando um segmento de 11,2 milímetros de uma ponta de pipeta de carregamento e coloque a parte cortada sobre a ponta da seringa Hamilton como um espaçador para limitar a profundidade de injeção a 1,5 milímetros.
Prenda o espaçador na ponta da seringa com adesivo ou parafilme. Para estudar a morfologia de CGNs eletroporados únicos de seções cerebrais sagitais do filhote experimental, faça imagens de Pilha Z a 0,5 micrômetros por pilha em um microscópio confocal. Imagem de uma célula por janela de imagem para permitir uma fácil análise de imagem e reconstrução 3D.
Analise o comprimento da neurite e a formação de garras dendríticas de maneira cega usando traçador de neurita simples. Carregue imagens Z-stack de canal único de CGNs eletroporados em Fiji e clique em Plugins"Segmentation"and Simple Neurite Tracer"Select Create New 3D Viewer"no menu suspenso. Role até a base de um dendrito que se conecta ao soma da célula e inicie um caminho clicando na junção.
Trace manualmente o caminho clicando nas seções em que o sinal de preenchimento da célula é mais brilhante e pressionando Y para manter o rastreamento. Trace até o final do dendrito e confirme o caminho pressionando F.Alternativamente, trace até a base da garra. Em seguida, trace a garra desde a base da estrutura até o final da neurita mais longa.
Rastreie ramificações secundárias e terciárias mantendo pressionada a tecla Control no Windows ou ALT em um macOS e clicando no caminho. Confirme o caminho pressionando F.Observe que as medições para os traços são visíveis em uma janela separada. Some todos os tamanhos dos ramos das garras para obter o comprimento total de cada garra.
Na análise representativa, as imagens de projeção de CGNs eletroporados, de 3 a 14 dias após a injeção, mostraram uma diminuição progressiva no número de dendritos. Os CGNs passaram por uma fase de crescimento dendrítico seguida de refinamento de 3 DPI para 7 DPI que resultou na poda de mais de 50% do excesso de dendritos. Este evento coincide com o alongamento gradual dos mandris restantes na formação de estruturas semelhantes a garras no final de cada dendrito, indicando que esses processos de desenvolvimento estão acontecendo simultaneamente.
Por 7 DPI, garras foram encontradas em cerca de 75% dos dendritos. Cada CGN marcado foi reconstruído em RMNM para quantificar a área de superfície somato-dendrítica total e o volume. Nenhuma diferença significativa no tamanho do CGN foi observada ao longo do desenvolvimento.
Embora em 7 DPI, os CGNs exibiram uma diminuição significativa de 20% no volume em comparação com 3, 5 e 10 DPI. A coisa mais importante no procedimento é localizar com precisão o cerebelo antes da injeção. O método pode ser adaptado para manipular geneticamente genes in vivo para estudar seu papel no desenvolvimento de neurônios de grânulos por transfecção de shRNAs, siRNAs ou Cre Recombinase.
