Agradecemos todo o laboratório Koshy para discussões úteis. Agradecemos Patty Jansma e da Universidade do Arizona Departamento de Neurociência para aconselhamento e ajuda com as imagens. Agradecemos também o laboratório Porreca para o uso de sua Vibratome. Esta pesquisa foi apoiada pela National Institutes os EUA de Saúde (NIH NS065116, AAK).

NOTA: Os ratos foram criados e mantidos em uma sala com temperatura controlada e umidade com 12 hr inverteu ciclos claro / escuro com comida e água disponível ad libitum na Universidade de Arizona. Os experimentos foram conduzidos sob as diretrizes e aprovação do Cuidado e Uso Comitê da Universidade do Arizona animal Institucional. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Os ratinhos Cre-repórter são em murganhos C57BL / 6 de fundo 11 e estão disponíveis comercialmente. 1. Rato Infection NOTA: O método de infecção com Toxoplasma gondii rato descrito abaixo foi usado em estudos anteriormente publicados 10-12. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Crescer estirpes Toxoplasma em fibroblastos de prepúcio humano (HFFS) cultivadas em Dulbecco Modificado Alto Teor de Glucose Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% de FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, e 2 mM de L-glutamina (cDMEM) em um balão T-25 no interior de um 5% de CO2 até parasitas formaram grandes vacúolos parasitóforos. </li><li> Parasitas de libertação seringa por raspagem células a partir do fundo do balão e passar a solução resultante através de uma agulha de calibre 25 ligada a uma seringa de 3 ml de 2 vezes no interior do frasco, em seguida, transferir toda a solução a uma seringa de 5 ml caso ligado a uma agulha de calibre 27 que foi colocado de cabeça para baixo dentro de um tubo cônico de 15 ml. Conecte o êmbolo para a seringa e passar a solução parasita dentro do tubo cônico. </li><li> Centrifugar o tubo durante 10 minutos a 300 x g. Aspirar o sobrenadante em seguida, voltar a suspender o sedimento em 4-6 ml estéril de grau USP 1x salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (solução mãe). </li><li> Coloque um hemocitômetro com 10 ml de solução de estoque, aguarde 5-10 min para os parasitas de se contentar em seguida, contar o número de parasitas nos quatro cantos e centro de praças da quadrado do meio grande. </li><li> Diluir Parásites para tamanho do inóculo apropriado de 100K / 200 mL 1x PBS, em seguida, injetar camundongos por via intraperitoneal (ip) com um volume total de 200 mL. NOTA: Para este procedimento, os ratos foram inoculados com 100K Tipo III (CEP) 13 taquizoítos em 200 mL 1x PBS. Ao infectar ratinhos com outras linhagens de Toxoplasma, a concentração do inoculo pode necessitar de ser ajustado para ter em conta nível de virulência. </li></ol> 2. Perfusão e colheita Cérebro NOTA: Este protocolo foi realizado aos 21 dias pós infecção (dpi), pois isso representa o ponto de tempo em que os números de cistos de pico são encontradas no cérebro de rato, mas outros pontos de tempo pode ser utilizado. Tamanho, número, localização e presença ou ausência de cistos depende de muitos fatores, incluindo a estirpe do mouse, tipo cepa do parasita, bem como tamanho do inóculo 7,14 - 17. Os investigadores deverão determinar individualmente o inóculo apropriado para o mouse e Toxoplasma estirpe ele / ela usa. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Configuração todas as ferramentas de coleta cirúrgica (Figura 1). </li><li> Para cada rato, preparar e manter em gelo: seringa de 20 ml cheia com 0,9% de cloreto de sódio (NaCl) + 10 U / ml Heparina em 1x grau USP estéril PBS (Heparina / Saline); Seringa de 20 ml cheia com 4% de paraformaldeído (PFA); Frasco de cintilação com 15 ml de 4% de PFA. Para vários mouses, prepare um copo cheio com o valor total de cada solução necessária para todos os ratos, em seguida, elaborar uma seringa fresco cheio de solução para cada perfusão. </li><li> Anestesiar o ratinho ip com 200 ul / 25 g de peso corporal de ketamina / xilazina cocktail (24 mg / ml e 4,8 mg / ml, respectivamente) no dia de interesse. Monitorar o mouse para o nível de anestesia, verificando toe pitada reflexo. Continue com o protocolo apenas uma vez o mouse mostra nenhuma resposta a uma pitada dedo do pé firme. NOTA: Outros métodos de anestesia pode ser usado, desde que o nível adequado de anestesia for atingido antesprosseguir com o protocolo. </li><li> Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre a plataforma de espuma coberta. Pin todos os quatro membros para fora aos pés, em seguida, pulverizar o tórax e abdome, com 70% de etanol (EtOH) (Figura 2A). A adição de várias toalhas de papel estéreis sob o rato pode ser utilizado para ajudar a absorver o excesso de fluidos de perfusão. </li><li> Levante a pele logo abaixo do esterno com uma pinça, em seguida, usar a tesoura para fazer uma incisão. Puxe a pele de volta para expor o tórax (Figura 2B). </li><li> Elevador processo xifóide e fazer uma incisão abdominal logo abaixo do diafragma, expor o fígado, que está francamente dissecada para longe do diafragma. Adicione duas incisões, uma do lado esquerdo e uma do lado direito através do diafragma e a parte inferior das costelas. Estender as incisões direita e esquerda a cerca de 1 / 2-2 / 3 forma-se a caixa torácica, o qual é então reflectida para trás para abrir a cavidade torácica (Figura 2C). NOTA: Tenha cuidado para não cortar quaisquer órgãos ou vasos sanguíneos principais dutocar esse procedimento pois isso irá comprometer a qualidade da perfusão. </li><li> Perfundir transcardíaca com 10-20 ml de heparina / solução salina seguido por 10-20 ml PFA a 4%. NOTA: Se a perfusão for feito corretamente, o fígado vai mudar de vermelho para bronzear (Figura 2D). Se não for feito corretamente, os vasos sanguíneos será visível (Figura 2E). </li><li> Vire o mouse sobre seu abdômen, pés re-pin em seguida, pulverizar cabeça e pescoço com etanol 70%. Elevador de pele a partir da base do pescoço e fazer uma incisão. Remova a pele para expor o crânio (Figura 2F). Decapitar cabeça ao nível dos ombros. Remover o crânio, remover suavemente o cérebro, e colocá-lo dentro de um frasco de cintilação preenchido com PFA a 4% (Figura 2G-H). NOTA: Se bem perfundidos, o cérebro vai aparecer branco, sem vasos sanguíneos visíveis (Figura 2?). Se o cérebro não está bem perfundido, vasos sanguíneos será visível (Figura 2J). </li><li> Coloque a centelhação frasco com cérebro em PFA a 4% a 4 ° C durante a noite, coberto de luz. Lavar o cérebro em USP não grau 1x PBS e transferir para um frasco de cintilação de novo preenchido com refrigeradas 1x PBS. Armazenar o cérebro em 1x PBS a 4 ° C, cobertas de luz. NOTA: clearing de sucesso e de imagem foi realizado com seções armazenados em 1x PBS por até um mês, mas o melhor é a seção do cérebro dentro de alguns dias como o armazenamento prolongado em PBS irá inverter a fixação PFA e poderia levar a menos do que as imagens mais favoráveis . A autofluorescência e aumentou borrão foram observados em algumas secções fotografadas após armazenamento em 1x PBS, durante um mês ou mais. </li></ol> 3. Cérebro Seccionamento <ol style="margin-left: 40px;"><li> Remover o cérebro de 1x PBS e colocá-lo numa matriz cerebral (Figura 3A) para permitir mais preciso e uniforme corta através do cérebro. Aparar o cerebelo e olfativos lâmpadas, se presente, e depois cortar o cérebro coronally em 2 ou 3 seções. <br /&gt; NOTA: aparar e de corte do cérebro pode ser feita sem o auxílio de uma matriz cerebral. Número de secções cortadas coronalmente dependerá da distância do corte do Vibratome sendo usado. O cérebro pode ser seccionado em qualquer orientação, embora secções coronais e sagitais são mais comumente utilizado para a identificação neuroanatômico. </li><li> Cole cada seção do cérebro em um bloco de montagem espécime com cianoacrilato. Apor um pequeno bloco de gel de agarose a 5% por trás da secção de cérebro de apoio (Figura 3B). Nota: Os outros mecanismos de apoio podem ser utilizados, mas sem apoio, o Vibratome pode empurrar o cérebro causando corte irregular. </li><li> Corte o tecido em 160 mm (distância de trabalho do objectivo usado para imagens) de espessura com a Vibratome definido para uma velocidade de 4 e amplitude de 9. NOTA: As definições para velocidade e amplitude pode ser ajustada dependendo da máquina específica a ser utilizada, a fim de obter mesmo, as secções lisas. Se as configurações estiveremnão estiver correto, o resultado pode ser seções irregulares, esgarçamento do tecido ou vibração marcas. </li><li> Recolha cortes de tecido em um frasco de cintilação preenchido com frescas, refrigeradas 1x PBS se eles estão indo para ser apagada dentro de uma semana. Se seções não vão ser apuradas dentro de uma semana, as seções lugar em 1,5 ml microtubos cheios de solução de criopreservação e armazenamento a -20 ° C. </li></ol> 4. Compensação óptico de tecido cerebral Secções NOTA: Este protocolo foi modificado de um método previamente publicado 8. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar 25%, 50%, 75% e 90% vol / vol de glicerol em 1x PBS + 2% de Tween-20 (Gl / PBST). </li><li> Remover secções de 1x PBS ou, se em crioconservante, enxaguar em 1x PBS e transferir para um frasco de cintilação contendo 10 ml de 25% Gl / PBST. Coloque o frasco num agitador a 4 ° C, cobertas pela exposição à luz, durante 12 h. </li><li> Confirme se todas as seções ter afundado ao bottom do frasco. Aspirar a 25% Gl / PBST, deixando apenas o suficiente para cobrir as seções, em seguida, encher o frasco com 10 ml 50% Gl / PBST e coloque em um shaker a 4 ° C, coberto de exposição à luz, durante 12 horas. Repita esse processo para os 75% Gl / PBST então a 90% Gl / PBST. Deixar seções no 90% Gl / PBST, durante 24 horas para chegar a compensação máxima. Ao longo do processo de limpeza, observar compensação óptica progressiva (Figura 4). NOTA: Este processo pode ser acelerado se as soluções forem alterados imediatamente após secções ter afundado até o fundo do frasco. Em 75% e 90% de soluções, secções não irá afundar todo o caminho para o fundo do frasco, mas irá flutuar no meio. </li></ol> 5. Montagem tecido cerebral Secções <ol style="margin-left: 40px;"><li> Corte um No. 1.5 lamela em 5 peças para criar um espaçador. Use um lápis régua e com ponta de diamante para marcar e quebrar a lamela ao longo das linhas tracejadas mostrado na Figura 5A. Descartar tele o centro peça, organizar as 4 peças exteriores sobre uma lâmina de vidro simples para criar uma janela, e em seguida, escove claro unha polonês sobre as costuras para aderir as peças do espaçador para o slide na configuração correta (Figura 5B). NOTA: O espaçador será utilizado para criar o espaço necessário entre a lâmina e a lamela de montagem para as secções compensados. A lamela pode ser cortada em diferentes formas de criar qualquer janela tamanho necessário. Espaçadores de espuma pré-cortadas estão também disponíveis comercialmente. Para permitir que unha polonês para secar completamente, o melhor é fazer slides com espaçadores de pelo menos um dia antes de seções de montagem. </li><li> Seções de transferência para um slide usando uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada. Certifique-se de preencher arredores com 90% de Gl / PBST. Cuidadosamente abaixe uma lamela sobre as seções tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas. O excesso de Gl / PBST pode ser mau para longe com um livre de fiapos wipe. </li><li> GFP Imagem + neurônios que contêm RFP + <em&gt; Cistos Toxoplasma gondii com um microscópio confocal imediatamente (Figura 7A-B), em seguida, armazenar lâminas planas e coberto de luz, a 4 ° C. NOTA: Como alternativa, selo desliza completamente em torno de todas as bordas para armazenar e fotografada em um momento posterior. Uso de unha polonês claro para selar slide é opcional e pode torná-lo mais difícil de remover lamela se fosse para remover seções do slide em uma data posterior para posterior processamento. </li></ol> 6. Criação de Imagens Nota: Qualquer microscópio pode ser usado que tem a capacidade de obtenção de alta resolução z-stacks. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Depois de inicialmente encontrar o plano focal em 10X, mudar para um objetivo 20X e digitalizar através da seção para identificar um cisto localizado dentro de um GFP + celular. Centralize a região de interesse (ROI) no campo de visão. </li><li> Mude para uma objetiva de 40X. Concentre cima e para baixo ao longo de todo o ROI para certificar-se que a célula inteira e cyr são visíveis. Nota: As imagens foram obtidas utilizando um microscópio confocal com um Oil DIC M27 objetiva de 40X / 1.30. </li><li> Usando o software de imagem instalado, obter uma pilha de z, que inclui toda a célula com cisto. Média de configurações utilizadas para obter imagens são mostradas na Figura 6. NOTA: As definições podem ter de ser ajustada dependendo de cada cortes de tecido investigadores e capacidades de microscópio. </li><li> Obter uma imagem máxima projeção do z-stack, definindo o número de projeções para 1. Obtenha uma visão de rotação completa, definindo o número de projeções para 64. NOTA: Outros pacotes de software estão disponíveis e podem ser usadas para obter máxima projecção, de rotação, bem como outros pontos de vista de imagens z da pilha. </li><li> Analisar a imagem com software de análise de imagem. </li></ol>

<ol>
	<li>Luft, B., Remington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmic+encephalitis+in+AIDS.">Toxoplasmic encephalitis in AIDS.</a> Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).</li><li>Hill, D., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+transmission,+diagnosis+and+prevention.">Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention.</a> Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).</li><li>Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+infected+with+low-virulence+strains+of+Toxoplasma+gondii+lose+their+innate+aversion+to+cat+urine,+even+after+extensive+parasite+clearance.">Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance.</a> PloS one. 8 (9), 75246 (2013).</li><li>Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+Toxoplasma+gondii+cyst+distribution+in+the+forebrain+associate+with+individual+variation+in+predator+odor+avoidance+and+anxiety-related+behavior+in+male+Long-Evans+rats.">Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats.</a> Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-parasite+relationship+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+chronically+infected+mice.">The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).</li><li>Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+the+brains+of+mice+infected+with+Toxoplasma+gondii:+a+histological,+immunocytochemical+and+ultrastructural+study.">Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study.</a> Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).</li><li>Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Cell+Preference+of+Toxoplasma+gondii+Cysts+in+Murine+Brain:+A+Confocal+Study.">Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study.</a> J Neuroparasitology. , (2010).</li><li>Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+approach+to+high-resolution+fluorescence+imaging+in+semi-thick+brain+slices.">A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+secreting+Cre+recombinase+for+analysis+of+host-parasite+interactions.">Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions.</a> Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).</li><li>Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+co-opts+host+cells+it+does+not+invade.">Toxoplasma co-opts host cells it does not invade.</a> PLoS pathog. 8 (7), (2012).</li><li>Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain.">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).</li><li>Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleotide+sugar+transporter+involved+in+glycosylation+of+the+Toxoplasma+tissue+cyst+wall+is+required+for+efficient+persistence+of+bradyzoites.">A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites.</a> PLoS pathog. 9 (5), (2013).</li><li>Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+among+the+three+major+strains+of+Toxoplasma+gondii+and+their+specific+interactions+with+the+infected+host.">Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host.</a> Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).</li><li>Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Structures+of+Toxoplasma+gondii+tachyzoites,+bradyzoites,+and+sporozoites+and+biology+and+development+of+tissue+cysts.">a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts.</a> Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .</li><li>Prandota, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Link+Between+Toxoplasma+Gondii+and+the+Anosmia+Associated+With+Neurodegenerative+Diseases.">Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases.</a> Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).</li><li>Berenreiterov&#225;, M., Flegr, J., Kub&#283;na, A., N&#283;mec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+Toxoplasma+gondii+cysts+in+the+brain+of+a+mouse+with+latent+toxoplasmosis:+implications+for+the+behavioral+manipulation+hypothesis.">The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis.</a> PloS one. 6 (12), 28925 (2011).</li><li>Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+the+early+development+and+tissue+cyst+formation+of+Toxoplasma+gondii+in+the+brains+of+mice.">An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice.</a> Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).</li><li>De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+agents+and+neurodegeneration.">Infectious agents and neurodegeneration.</a> Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).</li><li>Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+abnormalities+in+neurons+are+sufficient+to+explain+the+clinical+disease+and+fatal+outcome+of+experimental+rabies+in+yellow+fluorescent+protein-expressing+transgenic+mice.">Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice.</a> J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).</li><li>Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Tendo em conta que as alterações celulares em células hospedeiras infectadas têm sido associados a resultados da doença em infecções com outros organismos intracelulares, tais como HIV, raiva, e Chlamydia 18,19, desenvolvemos uma técnica que nos permite estudar as interações íntimas que ocorrem entre o CNS célula hospedeira e Toxoplasma. O método descrito aqui realiza este objetivo, permitindo imaging eficiente de neurônios cronicamente infectadas. Antes do desenvolvimento deste método...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>. The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/52237">"3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii"</a>.

Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

O objetivo geral deste método é a obtenção de alta resolução, imagens tridimensionais de neurônios individuais que são infectadas pelo parasita intracelular obrigatório Toxoplasma gondii. Toxoplasma é muitas vezes considerada um dos parasitas mais bem sucedidas porque a sua gama de hospedeiro intermediário grande, que inclui os seres humanos e roedores. Em ambos os seres humanos e roedores, após a infecção aguda por meio da ingestão de alimentos ou água contaminados, Toxoplasma é capaz de causar uma infecção persistente do SNC através da conversão a partir da sua forma de replicação rápido (a taquizoíto) para a sua replicantes lento e encistamento forma (o bradyzoite ). Em indivíduos imunocompetentes, esta infecção latente CNS é pensado para ser relativamente assintomática, mas em indivíduos imunocomprometidos, tais como pacientes com Aids ou transplantados, recrudescência do parasita pode levar a toxoplasmose cerebral fatal 1,2. Além disso, estudos recentes have demonstrado que a infecção com Toxoplasma latente pode conduzir a alterações comportamentais em roedores 3,4, embora o mecanismo permanece desconhecido. Surpreendentemente, apesar destes dados que destacam a importância da interação CNS- Toxoplasma, relativamente pouco se sabe sobre esta relação, especialmente no nível celular e molecular. A capacidade de estudar os aspectos, mesmo simples da interação cérebro-parasita tem sido prejudicado em parte por limitações tecnológicas. Por exemplo, a maior parte do trabalho que mostra que os neurónios são as células em que os cistos persistem tem sido feito com microscopia electrónica (EM) de 5,6. Embora EM dá alta resolução, é demorado, trabalhoso e caro. Imunofluorescência (IF) ensaios foram recentemente utilizados em conjunto com microscopia confocal para confirmar o trabalho feito por EM 7. Se os ensaios são tecnicamente fácil de executar e relativamente baratos, mas utilizando estas técnicas para understand a relação espacial entre o cisto eo neurônio infectados requer reconstrução de série, que é demorado, tecnicamente difícil, e pode levar à perda de informações valiosas. Assim, temos desenvolvido um método que pode ser usado com o modelo de ratinho de toxoplasmose cerebral e nos permite imagem da totalidade de neurónios infectados sem EM ou imuno-histoquímica (IHQ). Ao desenvolver essa técnica, podemos começar a explorar a relação entre celular da célula infectada e do cisto de uma forma relativamente rápida e barata. O método foi desenvolvido combina técnicas mais recentes para compensação óptica e seções do cérebro de imagem grossas por microscopia confocal 8 com um sistema que marca em células in vivo que foram injectados com proteínas do parasita 9,10. Neste sistema, que infectar ratinhos Cre-repórter que expressam uma proteína fluorescente verde (GFP) apenas após 11 recombinação mediada por Cre com Toxoplasma </em&gt; Estirpes que expressam uma proteína fluorescente vermelha (RFP) e injectam recombinase Cre em células hospedeiras 9. Esta combinação nos permite colher o cérebro de camundongo infectado após a infecção do SNC é estabelecida, cortar seções do cérebro de espessura, e rapidamente identificar áreas pertinentes para a imagem, encontrando o RFP + cistos. É importante notar que, como expressão numa célula hospedeira de GFP depende unicamente da injecção de Cre por parasitas, e não sobre a infecção, um número de células GFP + não contêm parasitas 10. Como o objetivo deste protocolo é o de ser capaz de neurônios infectados imagem inteira, o foco é apenas na GFP + neurônios que contêm também uma RFP + cisto, mas o protocolo também pode ser usado para a imagem da GFP + / RFP - neurônios. Uma vez que o cérebro infectado é colhida e seccionados, as seções são tornadas transparentes por clearing glicerol. Regiões apropriadas de seções são então fotografada com microscopia confocal, almugido visualização inédita de células hospedeiras infectadas e os parasitas encistadas na sua totalidade. Aqui nós fornecemos um protocolo completo para a identificação, limpeza opticamente, e de imagem infectado neurônios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1877">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:265px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1008px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Series 1000 Sectioning System</td>
			<td>Technical Products International, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Other vibratomes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#1.5 Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393 251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond Scriber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52865-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketaject&#174; Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml</td>
			<td>Western Medical Supply, Inc.</td>
			<td>4165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed&#174; Injection Xylazine 20mg/ml</td>
			<td>Lloyd Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ZsGreen Mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>7906</td>
			<td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>These are primary cells from human foreskins.&#160; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30081.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">200mM L-alanyl-L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">25cm2 Canted neck flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1012639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade</td>
			<td>amresco</td>
			<td>K813-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:265px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Bright-Line Hemocytometer</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSMAS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:265px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:135px;">H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">20ml Disposable Scintillation Vials</td>
			<td style="width:265px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:135px;">FS74500-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td>
			<td style="width:265px;">In-house</td>
			<td>17212945</td>
			<td>This product is purchased from an in-house stockroom.&#160; Other companies are compatible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Imaris Software</td>
			<td style="width:265px;">Bitplane</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Clear nail polish</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">10ml Syringe with Luer-Lok</td>
			<td style="width:265px;">VWR</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>Other syringes are compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Three-way Stopcock</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>Any brand is compatible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25G x 12&#34; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td>
			<td style="width:265px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:135px;">450099</td>
			<td>Other brands are compatible</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii é um parasita obrigatório, intracelular com uma ampla gama de hospedeiros, incluindo humanos e roedores. Em ambos os seres humanos e roedores, Toxoplasma estabelece uma infecção persistente ao longo da vida no cérebro. Enquanto esta infecção cerebral é assintomática na maioria das pessoas imunocompetentes, no desenvolvimento do feto ou indivíduos imunocomprometidos, como a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) pacientes, essa predileção por e persistência no cérebro pode levar a doença neurológica devastadora. Assim, é claro que a interacção Toxoplasma cerebral é crítico para a doença sintomática produzido pelo Toxoplasma, ainda que têm pouca compreensão da interacção celular ou molecular entre as células do sistema nervoso central (SNC) e do parasita. No modelo do rato do CNS toxoplasmose tem sido conhecida há mais de 30 anos, que os neurônios são as células em que o parasita persiste, mas há pouca informação disponível sobre o qualparte do neurônio é geralmente infectados (soma, dendritos, axônio) e se esta relação celular muda entre as linhagens. Em parte, esta falta é secundária à dificuldade de imagem e visualização de neurônios infectados inteiros a partir de um animal. Tais imagens tipicamente exigiria cortes seriados e costura de tecido fotografada por microscopia eletrônica, microscopia confocal após immunostaining. Através da combinação de várias técnicas, o método aqui descrito permite a utilização de secções espessas (160 um) para identificar e imagem inteira de células que contêm cistos, permitindo a visualização e análise de neurónios individuais, cronicamente infectadas tridimensional sem a necessidade de imunomarcação, microscopia electrónica ou cortes seriados e costura. Usando esta técnica, podemos começar a compreender a relação celular entre o parasita eo neurônio infectado.

A Figura 7 inclui imagens representativas de dois neurónios GFP + 160 a partir de dois mm de espessura diferentes, bem como uma medida representativa da distância de cisto-a-célula no corpo para a Figura 7B. Figuras contendo cisto 7 A e B mostram que esta nova protocolo permite a visualização do neurónio infectada na sua totalidade. A Figura 7C mostra que com esta técnica de imagiologia, é agora possível para quantif...

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Usando este protocolo, fomos capazes de imagem 160 um seções do cérebro de espessura de camundongos infectados com o parasita Toxoplasma gondii, que permite a visualização e análise da relação espacial entre o parasita encistamento eo neurônio infectado.

Imagem 3-D e Análise de Neurônios Infected<em&gt; In Vivo</em&gt; Com<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K visualizações.  University of Arizona.  Usando este protocolo, fomos capazes de imagem 160 um seções do cérebro de espessura de camundongos infectados com o parasita Toxoplasma gondii, que permite a visualização e análise da relação espacial entre o parasita encistamento eo neurônio infectado. 

Vídeo: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Neurociência

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imagem óptica de neurônios no gânglio de Caranguejo Stomatogastric com Tensão sensível Corantes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

A modificação de um Colliculo-tálamo-cortical do cérebro do rato Fatia, Incorporando a impressão 3-D da Câmara Components and Imaging Optical Multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.