Este protocolo descreve um método focado em extrair em paralelo as duas populações de células gliais mais abundantes, astrócitos e microglia, de camundongos pós-natais. Nosso método difere de outros protocolos previamente descritos para o isolamento de astrócitos e microglias, pois focamos na obtenção e isolamento de ambos os tipos celulares na mesma condição, otimizando assim o uso de animais experimentais e melhorando o estudo de papéis relativos para essas células em contextos imunológicos. Este protocolo pode ser útil para investigar melhor os papéis de microglia e astrócito em muitos contextos e doenças no sistema nervoso central, como Alzheimer, Parkinson e infecções, por exemplo, parasitas protozoários ou vírus.
A obtenção e isolamento de ambos os tipos celulares a partir da mesma extração é desejável avaliar o papel comparativo de cada subconjunto celular contextos imunológicos como infecção ou inflamação. As pessoas devem ter cuidado especialmente durante a remoção cerebral e lavagem de tecido nervoso, mas acredito que com este protocolo e a filmagem, as pessoas não vão lutar. Este protocolo pode ser longo dependendo do número de animais para extrair os cortices, então esteja preparado para passar cerca de quatro horas ou mais.
No primeiro dia, prepare o HBSS puro e o HBSS mais FBS inativados a calor de 10%. Prepare o DMEM F12 suplementado e filtre-o com um filtro de 0,22 mícrons. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em uma autoclave e use 70% de etanol durante o procedimento.
Coloque camundongos recém-nascidos em uma câmara selada contendo algodão encharcado com isoflurano por cinco minutos para anestesia profunda. Borrife o filhote de rato com 70% de etanol e decapite o animal com uma tesoura. Faça um corte sagital com uma tesoura ao longo do crânio para abri-lo e expor o cérebro.
Remova o cérebro usando uma micro espátula para manter a integridade cerebral. Coloque o cérebro em uma placa de Petri de seis centímetros de diâmetro seco. Usando uma micro espátula, remova a lâmpada olfativa e o cerebelo.
Mova o córtex para outra placa de Petri contendo dois mililitros de HBSS mais 10% FBS. Corte o tecido cerebral em pequenos pedaços com uma tesoura estéril e usando uma micropipette P1000, transfira cada tecido cerebral com HBSS mais 10% FBS para diferentes tubos cônicos de 15 mililitros. Se necessário, use o HBSS mais 10% FBS para preencher o volume final a dois mililitros.
Lave o tecido cerebral cortado com três mililitros de HBSS mais 10% FBS para cada tubo. Após a decantação, remova cuidadosamente o supernante. Repita a lavagem com HBSS mais 10%FBS três vezes adicionais.
Em seguida, lave com três mililitros de HBSS puro três vezes. Após a decantação, remova cuidadosamente o supernante. Em seguida, adicione três mililitros de trippsina e coloque o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius por 30 minutos agitando suavemente os tubos a cada cinco minutos.
Isso digere o tecido coletado. Evite bolhas. Para inativar a trippsina, lave o tecido com três mililitros de HBSS mais 10% FBS e após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o supernatante.
Repita esta lavagem três vezes. Em seguida, lave o tecido com três mililitros de HBSS puro e repita duas vezes adicionais. Após a decantação do tecido, remova cuidadosamente o sobrenante.
Adicione sete mililitros de HBSS puro e homogeneize o tecido através de passagens sucessivas em pipetas, primeiro com uma pipeta sorológica de 10 mililitros, seguida de uma pipeta de cinco mililitros, e finalmente com uma micropipette P1000. Após a homogeneização, centrifugar os tubos a 450 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota com quatro mililitros de HBSS mais 10% FBS para cada tubo.
Transfira as células para um frasco T75 pré-tratado comercialmente para uma ótima adesão à cultura celular. Coloque o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos para adesão. Em seguida, adicione 10 mililitros de DMEM F12 suplementados ao frasco e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas noites.
No terceiro dia, remova sete mililitros de cultura do frasco T75 e adicione sete mililitros de DMEM F12 complementados frescos. Devolva o frasco para a incubadora. No quinto dia, para remover detritos e células não aadeentes, troque todo o meio do frasco T75 com 14 mililitros de DMEM F12 complementados frescos.
Em seguida, a cada 48 horas, remova seis mililitros do supernatante e adicione sete mililitros de meio DMEM F12 fresco até o dia 14 da cultura. No dia 14, depois de remover seis mililitros de supernadante e adicionar sete mililitros de médio DMEM F12 complementado fresco, feche os frascos T75 firmemente com embalagem plástica. Coloque-os no agitador orbital do chão a 200 RPM e 37 graus Celsius durante a noite para dissociar mecanicamente microglia de astrócitos.
No dia 15, pegue os frascos do agitador e lave-os vigorosamente com seu próprio meio, a fim de otimizar a dissociação celular e colher o número máximo de microglia. Em seguida, recolher o supernasal e transferi-lo para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione quatro mililitros de trippsina em cada frasco e incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius, a fim de desprender os astrócitos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM F12 suplementado para inativar a trippsina. Lave os frascos com seu próprio meio e transfira o conteúdo para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar todos os tubos contendo microglia dissociada ou astrócitos a 450 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernaspeso. Resuspend a pelota de microglia em um mililitro de DMEM F12 suplementado e os astrócitos em 10 mililitros de DMEM F12 suplementado. Prossiga para a contagem de células em uma câmara de Neubauer ou em um contador automático de células.
Aplaque as células com DMEM F12 suplementado na densidade desejada em uma placa de cultura de célula inferior plana pré-tratada. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que elas se conectem. No 14º dia, a cultura celular glial sofreu dissociação mecânica.
Observou-se pureza de 89,5% para a população de astrócitos e 96,6% para a população de microglias. Astrócitos e microglia de camundongos C57BL6 foram infectados com T.cruzi Y.Após duas horas, 48 horas e 96 horas, as câmaras foram fixadas com metanol e manchadas com o marcador de nuclease celular DAPI e anti-GFAP. O uso de parasitas geneticamente modificados expressando repórteres fluorescentes ou parasitas rotulados com anticorpos fluorescentes específicos melhorou a microscopia de imunofluorescência, uma vez que são melhor distinguidos do núcleo celular.
Dois exemplos são apresentados aqui. T.gondii RH cepa constitutivamente expressando YFP e T.cruzi Y cepa manchada com anticorpo monoclonal não comercial 2C2 proteína anti-SSP4. É importante lavar cuidadosamente as células para não perder nenhum agregado celular.
Após a infecção por células gliais, outros parâmetros podem ser avaliados, como ELISA para produção de citocinas presentes no supernanato, mancha ocidental para expressão proteica e PCR quantitativo em tempo real para avaliação de transcrição de RNA. Muitas questões relacionadas à função das células gliais, por exemplo, seu metabolismo, resposta imune e biologia celular em si podem ser abordadas e beneficiadas por essa técnica. Todos os parasitas protozoários são capazes de infectar células humanas, bem como células de camundongos culturais, por isso é importante ter cuidado ao lidar com esse parasita.
