Este trabalho foi financiado pelo BBSRC eo Wellcome Trust. Gostaríamos de agradecer Simon Walker para a assistência com imagem e Felix Krueger para obter ajuda com a análise bioinformática.

1. Gerando Sondas de DNA diretamente identificadas por Nick Translation Nota: sondas Diretamente rotulados feitas a partir de BACs (100-250 kb) consistentemente produzem sinais luminosos. Se forem necessárias sondas mais pequenas, usar fosmids (40-50 kb) ou mesmo os plasmídeos contendo inserções de 5-10 kb. Identificar BAC ou fosmid clones correspondentes a genes específicos usando Ensemble ou navegadores genoma UCSC. Prepare DNA BAC alta qualidade por precipitação repetido ou usar kits disponíveis no mercado. A menos que a preparação está contaminado com DNA genómico bacteriano, a sonda menos é necessário, por lâmina. Realize rotulagem em duas etapas: tradução nick introdução aminoallyl-dUTP e acoplamento químico de um corante reativo a amina. 1.1. Nick Translation Durante a tradução nick, DNase I é usado para criar quebras de-fita simples. DNA polimerase I alonga &#39;extremidades destes&#39; a 3 nicks &#39;, substituindo nucleotídeos existentes por novos, t<html> aqui &#39;traduzir&#39; o nick e proporcionando, assim, a oportunidade de incorporar nucleotídeos marcados. Aminoallyl-dUTP é escolhido por causa da incorporação eficiente pela polimerase I do DNA e do seu potencial para o acoplamento químico posterior para corantes reactivos com amina ou haptenos. É fundamental para alcançar o equilíbrio certo entre DNase I nicking e DNA polimerase I de tradução; muito DNase I resultará na digestão excessiva DNA dando baixa produtividade e tamanhos de fragmentos curtos, muito pouco não produzirá nicks suficientes para a polimerase para iniciar a tradução, dando grande tamanho do fragmento e má incorporação de aminoallyl-dUTP. O protocolo seguinte funciona bem, mas pode ser necessário para titular a ADNase I a partir de diferentes fabricantes ou de diferentes lotes. <ol><li> Defina-se etiquetagem de reacção em gelo e incubado durante 2 horas a 16 ° C. Isso deve produzir 0,5-1 mg DNA nick-traduzido e pode ser escalado para cima. Diluir 1:30 em ADNase I ADNase I tampão (isto é, 0,3 U / ul). </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentração de estoque </td><td> Volume ou quantidade </td></tr><tr><td> DNA BAC </td><td></td><td> 5-10 mg </td></tr><tr><td> Tampão NTB </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 0,1 M </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0,5 mM </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> Polimerase I de ADN </td><td> 10 U / ul </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> ADNase I </td><td> 10 U / ul </td><td> 1 ul (de uma diluição de 1:30) </td></tr><tr><td> H2O </td><td></td><td> a 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Correr 1 uL num gel de agarose a 2% para verificar o tamanho dos fragmentos etiquetados. Enquanto você corre o gel, manter a reação no gelo. Sucesso nick translatiem resultará em um esfregaço com a maior parte dos fragmentos que funcionam entre 150 pb e 700 pb, com alguns fragmentos maiores em ~ 1 kb (passo crítico: veja resultados representativos). Se necessário, são adicionados mais 1 ul de uma diluição fresco 01:30 ADNase I e incubar a 16 ° C durante 15-30 min. O tempo de incubação pode variar de acordo com a quantidade e qualidade do DNA BAC. </li><li> Inativar ADNase I por aquecimento a 75 ° C durante 10 min. </li><li> ADN modificado com amina de limpeza utilizando um kit de purificação de PCR. Eluir em 100 ul de H2O </li><li> Etanol precipitado de ADN por adição de 10 ul de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 275 ul de etanol. Adicione-se a -20 ° C durante pelo menos 1 hora ou durante a noite. Rotação à velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C. Lavar sedimento com 500 ul de etanol a 70% e deixar secar ao ar. Este passo remove os vestígios aminas que irão interferir com a reacção de marcação. Ressuspender o sedimento em 6 mL H 2 O por 1x reação inicial. </li><li> Use 1 ul para determinar a concentração do DNA amina modificadopor espectroscopia de UV microvolume. </li></ol> 1.2. O acoplamento do corante fluorescente A microscopia por fluorescência da sonda é conseguido através de acoplamento químico do corante. Alexa Fluor succinimidilo éster corantes reagir com as aminas de ADN modificado allyldUTP-amino para formar uma ligação covalente, produzindo, assim, as sondas marcadas directamente. Alexa Fluor 488, 555, 647 e os corantes tenham sido bem sucedida para este processo. <ol><li> Ajustar 4 ug de ADN modificado amino-alil até um volume de 5 ul, de calor a 95 ° C durante 5 min, encaixe fresco em gelo e adicionar 3 ml de 0,2 M NaHCO3. </li><li> Dissolve-se uma parte alíquota do corante reactivo de amina em 2 mL de DMSO anidro, à temperatura ambiente. Adicionar 8 mL de ADN modificado com NaHCO3, vortex, rotação do pulso e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 1 hora. </li></ol> Nota: Os corantes reactivos de amina pode ser utilizada para rotular mais do que uma sonda com base no seguinte esquema. Uma vez que oomente 10-20 ng de sonda é usada por rotulagem slide, 1 mg dá sonda suficiente para 50-100 slides. Também é possível armazenar o DNA amina modificado para futuras reacções de etiquetagem, a -20 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> Quantidade de DNA </td><td> Volume de DNA </td><td> 0,2 M NaHCO3 </td><td> Volume de corante </td><td> Total </td><td> Suficiente para </td></tr><tr><td> 4 x 1 ug </td><td> 1,25 mL cada </td><td> 0,75 mL cada </td><td> 0,5 mL cada </td><td> 2,5 ul (1/4) </td><td> 50-100 lâminas cada </td></tr><tr><td> 3 x 1,35 ug </td><td> 1,67 mL cada </td><td> 1 ul de cada </td><td> 0,67 mL cada </td><td> 3,34 ul (1/3) </td><td> 65-130 slides cada </td></tr><tr><td> 2 x 2 ug </td><td> 2,5 mL cada </td><td> 1,5 mL cada </td><td> 1 ul de cada </td><td> 5 ul (1/2) </td><td> 100-200desliza cada </td></tr><tr><td> 1 x 4 ug </td><td> 5 ul </td><td> 3 ul </td><td> 2 ul </td><td> 10 ul (total) </td><td> 200-400 lâminas </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Adicionar 90 ul de H2O e purificar a sonda marcada usando um kit de purificação de PCR. Eluir em 100 ul 10 mMTris-Cl (pH 8,5). </li><li> Determinar a concentração de sonda e eficiência de marcação por espectroscopia de espectro completo microvolume (ver Figura 2), utilizando equações de Beer-Lambert (As instruções são dadas na folha de dados que acompanha as Alexa Fluor corantes reativos ou podem ser encontrados online). Sondas que contenham corantes 3-6 por 100 bp funcionar bem. Sondas com menores graus de incorporação pode dar sinais de FISH fracos. Alternativamente, executado 5 uL num gel de agarose a 2%, sem mancha do ADN e verificar a incorporação do corante fluorescente usando uma Phosphoimager. Adicione-mancha do gel com brometo de etídio ou DNA alternativas de coloração e comparar ADN marcado para o ADN total. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. FISH DNA Através dos passos seguintes, as células de interesse são fixadas a lâminas e permeabilizadas. O ADN celular e as sondas são marcadas directamente, em seguida desnaturadas em conjunto sobre uma placa quente e hibridado durante a noite numa câmara humidificada à prova de luz. 2.1. Dia 1 <ol><li> Probe Precipitation Nota: sondas precipitado a algum momento durante o dia 1. Isto pode facilmente ser executada em paralelo com o tratamento das células e não tem de ser feita no início do dia. <ol><li> Misturar 10-20 ng de sonda marcada directamente, 6 ul 0 C t-1 DNA (6 mg), 1 ul de DNA de cadeia simples a partir de testículos de salmão (9,7 ug) e ajustar o volume para 100 ul com água. </li><li> Adicionar 10 ml 3 M NaOAc e 275 mL EtOH, e misturar em vortex. Precipitar durante pelo menos 1 hora a -20 ° C. </li><li> Girar em microcentrífuga a velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C. Lave pellet com etanol 70% e girar novamente. Dry pellete ressuspender em 5 mL de formamida desionizada. Ressuspender em 30 min a 37 ° C enquanto se agita a 1.000 rpm (protegido da luz lugar folha sobre o Thermomixer). </li><li> Adicionam-se 5 pi de mistura de sulfato de dextrano e agitar por mais 10 min a 37 ° C novamente protegidas da luz. Pipeta cima e para baixo antes de pipetagem para lamela. Nota: Para pintura cromossômica combinado com sondas BAC, inteiros cromossomo sondas de pintura que são fornecidos em pronto para uso mix de hibridização são uma opção conveniente. Ressuspender o precipitado BAC sonda (com C 0 t1 DNA e DNA de cadeia simples de testículos de salmão) em 10 mL mix pintura cromossomo pipetando cima e para baixo. Incubar a 37 ° C enquanto agitando a 300-500 rpm durante 10 min. Use 10 ml de tinta cromossomo / BAC sonda mistura por ponto. </li></ol></li><li> Colocar células para Slides Nota: As células propensão para aderir a lâminas varia grandemente com o tipo de célula. Para cada tipo de célula, determinar oóptima o tempo de estabilização e a densidade celular empiricamente. Para obter resultados consistentes, as células devem estar numa única suspensão de células. Para facilitar o uso do círculo da área das células será manchado com uma caneta hidrófobo, embora, para as células em suspensão em PBS, isto não é estritamente necessário. Uma barreira hidrofóbica evita que a suspensão de espalhar sobre a lâmina, mantém-se a três amostras por lâmina bem separadas e permite a utilização de volumes muito pequenos de solução de anticorpo em imuno-FISH. Além disso, a área de mancha pode ser mantido a um mínimo, se o número de células são reduzidas. </li><li> Células de fígado fetal de rato <ol><li> Colete cada E13.5 rato fígado fetal em cerca de 1,5 ml de PBS e ressuspender pipetando cima e para baixo. Girar em microcentrífuga a 3.000 rpm por 2 min. Repita lava três vezes. Nos últimos lavagem, as células de tensão através de um peneiro 70. Ressuspender as células a partir de um fígado em 160 ul de PBS e utilizar 50 μ por mancha. Deixe as células que se contentar com 2 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Mouse ES Células 1. Células-tronco embrionárias de rato não vai ficar fácil para o slide. Em um slide, círculo a área das células será manchado com uma caneta hidrofóbica. Prepara-se uma suspensão de 20.000-50.000 células por 80-100 uL em meio de cultura normal, pipeta em círculo e deixar a aderir durante cerca de 3 horas numa incubadora humidificada Nota:. Alternativamente, as células ES podem ser cultivadas em lâminas, mas em seguida, formarão colônias que podem dificultar a imagem automatizada. </li><li> As células fixas 1. Algumas experiências requerem a utilização de células fixas, que não se ligam às corrediças por si mesmos. Fiação suave a 300 rpm durante 3 min utilizando um citocentrífuga preserva a estrutura tridimensional das células e assegura que as células não cair. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de célula </td><td> Suspensão em </td><td> Tempo de estabilização </td><td> Comentar </td></tr><tr><td> Mousefígado fetal </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> No banco </td></tr><tr><td> Rato ES </td><td> DMEM com suplementos </td><td> 4 hr </td><td> 37 ° C em incubadora humidificada </td></tr><tr><td> Linfócitos mouse </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> No banco </td></tr><tr><td> Rato P20 células germinativas </td><td> Fix em solução </td><td> Cytospin </td><td> No banco </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Para consertar as células, deslize suavemente submergir em 4% PFA (ATENÇÃO: realizar em capela) por 10 min. Corrigir as células com o slide apartamento em uma bandeja para melhor retenção de células (por exemplo, 50 ml de 4% PFA na tampa de uma caixa de ponta) Nota:. Esta etapa não se aplica a células fixadas antes de apego aos slides. </li></ol> Para todas as etapas subseqüentes, use 50 ml ou 100 ml frascos Coplin. Tome cuidado para não raspar as células fora quando se deslocam lâminas entre frascos. <ol start="4"><li> Quench em 0,1 M de Tris-Cl, pH 7,4, durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Permeabilizar células em 0,1% saponin/0.1% de Triton X-100 em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar duas vezes em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Incubar durante pelo menos 20 min em 20% de glicerol / PBS a RT Nota:. Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas em glicerol a 50% / PBS a -20 ° C durante pelo menos várias semanas. Tem sido observado que o armazenamento de pelo menos um dia resulta em um aumento na força de sinal 9. Recalibrar em temperatura ambiente de 20% de glicerol / PBS antes de prosseguir Nota:. Este é um ponto conveniente para começar a precipitar as sondas (ver 2.1.1). </li><li> 3x congelamento / descongelamento em azoto líquido. Mergulhe uma lâmina de cada vez em nitrogênio líquido usando um pequeno Dewar. Retirar depois de alguns segundos e um som de estalo característico, e coloque sobre toalha de papel para degelo. Aguarde glicerol congelado opaco para desaparecer em seguida, congelar novamente. Até 15 lâminas pode ser feito comodamente em rotação por três ciclos de congelamento / descongelamento. </li><li> Wcinza duas vezes em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Incubar em HCI 0,1 M durante 30 min a RT. </li><li> Lavar com PBS durante 5 min à TA. </li><li> Permeabilizar em 0,5% de Triton X-100/PBS saponin/0.5% durante 30 min à TA. </li><li> Lavar duas vezes em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Equilibrar em 50% formamide/2x SSC durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Pipeta sonda em uma lamela. Retirar a lâmina do frasco e secar o excesso de líquido ao redor do local da célula (s) com uma toalha de papel. Como a seca formamida rapidamente, tome cuidado para não secar células. Para slides com dois ou três pontos de células, aplicar 10 ml de sonda por ponto para um 22 x 50 mm lamela correspondente a manchar local no slide. Inverter lamela para deslizar sobre ponto (s). Selar com cimento de borracha e permitir que esta seque completamente. Proteger da luz em todas as fases subseqüentes. </li><li> Lâminas de calor a 78 ° C por 2 min, precisamente em um prato quente (por exemplo, um bloco de aquecimento invertido, passo fundamental: ver Discussão). Coloque uma tampa (caixa de papelão ou sim<html> Ilar) sobre a chapa quente para proteger da luz durante a desnaturação. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C numa câmara humidificada à prova de luz. Para umedecer, coloque toalhas de papel em uma caixa à prova de luz e umedecer com água. </li></ol> 2.2 Dia 2 <ol><li> Prepare Coplin frascos com soluções na temperatura certa para as etapas de lavagem subsequentes. Proteger as lâminas da luz tanto quanto possível em todas as etapas subsequentes. Um café pode faz uma boa cobertura à prova de luz para Coplin frascos. </li><li> Peel off cimento de borracha e lugar de slides em 2x SSC até lamelas soltar e escorregar. </li><li> Lave com 50% formamide/2x SSC durante 15 min a 45 ° C. Coloque a tampa em banho-maria para proteger da luz. </li><li> Lavar em 0,2 x SSC durante 15 min a 63 ° C. </li><li> Lavar 2x em SSC durante 5 min a 45 ° C. </li><li> Lavar 2x em SSC durante 5 min à TA. </li><li> Lavar com PBS durante 5 min à TA. </li><li> Mancha com DAPI (5 ug / mL em 2x SSC) durante 2 minutos num frasco Coplin, à TA. </li></ol>conteúdo &quot;&gt; Nota: DAPI solução pode ser armazenada a 4 ° C no escuro, durante 2 meses. <ol start="9"><li> Destain em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Para montar a lamela, pipeta meio de montagem sobre uma lamela. Usar 10 ul por ponto de células, utilizando 22 milímetros x 22 milímetros lamelas para um local, e 22 mm x 50 mm para lamelas 2-3 manchas. Seque PBS ao redor do local da célula, tanto quanto possível, mas tome cuidado para não secar as células. Inverter lamela em slide, e selar com verniz. </li></ol>

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A produção deste artigo foi parcialmente financiado pela Carl Zeiss e MetaSystems.

FISH DNA 3D tornou-se uma ferramenta amplamente reconhecida para analisar arranjos espaciais no núcleo. Enquanto FISH fornece resultados visuais e direta, como acontece com todas as técnicas, é preciso estar ciente de suas limitações. PEIXES ADN enfrenta o problema inerente que os tratamentos relativamente duras são necessárias para tornar acessível a cromatina sondas FISH que finalmente interrompe-a própria estrutura nuclear coisa que está a ser analisada. Diversas estratégias têm sido perseguidos de conciliar a acessibilidade ea preservação estrutura. No protocolo aqui descrito, o ADN cromossómico é tornada acessível por congelamento-descongelamento a permeabilização das células e desnaturação pelo calor antes da hibridação da sonda. Solovei, et ai., (2002) analisaram as alterações estruturais após tratamento semelhante e verificou que a deslocação média de domínios de cromatina foi de 300 nm, o que limita a resolução da análise estrutural de cerca de 1 Mb regiões no genoma 8. Embora isso não seja alta resolução, eleé uma escala razoável para analisar a posição nuclear. Uma consideração mais prático para análise FISH é que a aquisição de imagem e as medições de distâncias nucleares são processos demorados que limitam o número de núcleos que podem ser analisados. A fim de estudar os eventos raros que visam fazer imagens de alta taxa de transferência automatizado. Então, com os controlos apropriados no lugar, um número suficiente pode ser comparado para permitir a análise estatística robusta das relações espaciais. Rotineiramente analisar 600 núcleos por ponto de dados para o qual vamos determinar as coordenadas 3D de todos os sinais de peixe dentro do volume nuclear. Esses dados exigem muito pouco espaço de armazenamento e permitir a análise das distâncias inter e intra-alélicas, ou posições radiais em qualquer momento posterior. Além disso, o processamento automatizado pode ser feito de uma maneira cega investigador que reduz grandemente a probabilidade de polarização inconsciente. Para habilitar este tipo de analys de alto rendimentoé, nosso objetivo foi o de estabelecer uma maneira rápida e eficiente de realizar FISH DNA. Encontramos o protocolo descrito aqui para ser extremamente robusto, de forma consistente a produção de sinais luminosos, com baixo fundo. Ela trabalhou para todos os tipos de células que tentaram desde que adaptado a etapa de fixação das células para o slide. Além disso, com exceção de uma, todas as BACs que usamos poderia ser transformado em sondas brilhantes. Temos também detectado com êxito um certo número de proteínas nucleares por coloração de anticorpos após ADN FISH. Enquanto para algumas proteínas Isso funciona bem, recomendamos comparação com a imunofluorescência tradicional (IF) para garantir a consistência do padrão de coloração de anticorpos entre IF e DNA imuno FISH (compare 11). Geralmente, verificou-se que as sondas marcadas com cores diferentes produziu os mesmos resultados. No entanto, os seguintes aspectos devem ser considerados ao escolher a tinta rotulagem. Primeiro, a cor do fluoróforo deve ser bem detectável pelo u microscópiosed. Em segundo lugar, o comprimento de onda da luz emitida pelos fluoroforos deve ser suficientemente diferente para evitar sangramento através do canal para o outro. Isto irá depender dos filtros no microscópio. E em terceiro lugar, pelo menos em nossas mãos, algumas cores produzir sinais luminosos de forma mais consistente do que outros. Nós sempre usaram DAPI (azul) como um contrastante que faz Alexa Fluor 555 (vermelho), 488 (verde) e 647 (muito vermelho) boas opções para marcação de sondas. Com o nosso sistema de imagens, encontramos Alexa Fluor 555 (vermelho) para produzir os sinais mais brilhantes, seguidos por Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (vermelho longínquo) tem a desvantagem de que não pode ser detectada pelo olho humano e, portanto, não há sinais pode ser visto quando se olha através do microscópio. Assim, se fazendo FISH duas cores, recomendamos a combinação de corantes vermelhos e verdes. Podem surgir dois problemas principais: células lavando os slides e sinais fracos. Como as células também aderir ao slide é entr extremamente variáveltipos de células een, eo melhor protocolo para resolver / seed as células precisa ser determinado. Nós utilizamos com sucesso, quer carregados positivamente ou poli-L-lisina lâminas revestidas (comprado pronto a utilizar), mas foram encontradas células geralmente adere melhor à poli-L-lisina lâminas revestidas. Descobrimos também que, quando as células eram muito densas áreas inteiras seria descascar como uma folha, enquanto imagem automatizada foi prejudicada se as células eram muito escassos. Assim, se a amostra não for muito precioso, diferentes números de células deveriam ser semeadas para determinar a densidade ideal. Se as células são particularmente propensas a lavar, uma caneta de barreira hidrofóbica pode ser usado, e os passos de peixe pode ser realizada por pipetagem cuidadosa soluções directamente sobre a lâmina. Pipetagem também reduz drasticamente os volumes de reagentes necessários, mas leva muito mais tempo ao fazer vários slides. Sinais fracos são geralmente devido a sondas pobres, e vale a pena investir tempo em fazer bons. Limpo DNA CCB deve ser usard como material de partida, que pode ser obtido por precipitação repetida ou kits disponíveis comercialmente. A contaminação com ADN genómico bacteriano afecta negativamente a qualidade da sonda e tratamento cuidadoso durante a lise celular e de filtragem do lisado de células é necessária para mantê-lo a um nível mínimo. É, no entanto, não é necessário usar um passo de digestão com exonuclease de ADN linear, como esta reduz grandemente o rendimento. Rotulagem eficiente da sonda é crucial. O controle de qualidade mais importante para esta etapa é verificar o tamanho do fragmento após a tradução nick (ver resultados representativos). A &#39;boa&#39; smear quase sempre resultam em uma sonda de cor viva. No entanto, verificou-se que, ocasionalmente, uma certa BAC não pode ser transformado em um bom sonda, e uma TAS diferente deve ser escolhido. Outro passo importante é a desnaturação pelo calor. Se a temperatura for demasiado baixa, o ADN será apenas parcialmente desnaturada e hibridação da sonda será prejudicada. Se a temperatura for demasiado elevada, a estrutura nuclear wivai ser perturbado mais do que o necessário. Nas nossas mãos, 78 ° C sobre um bloco quente invertida é o compromisso ideal, mas isto pode variar, dependendo do respectivo bloco quente utilizado. Temos tido bons resultados usando meio de montagem Vectashield, mas descobriu que SlowFade Gold tem menos fundo e preserva o sinal fluorescente por mais tempo. Nós não recomendamos o uso de hard-set meio de montagem como descobrimos isso afetar a estrutura 3D e formar bolhas de ar ao longo do tempo. Em conclusão, brilhantemente fluorescentes directamente sondas marcadas em conjunto com o protocolo de ADN FISH aqui descrito oferecem uma solução eficaz para a análise robusta e rápida da arquitectura nuclear, que é aplicável a uma ampla variedade de questões biológicas.

DNA de hibridização in situ de fluorescência (FISH ADN) permite a visualização tridimensional de loci de genes individuais, domínios subcromossómico e cromossomas inteiros, mesmo durante todas as fases do ciclo celular. PEIXES 2D é utilizado para estudos FISH metafase enquanto 3D tem sido extensivamente utilizado para sondar a relação espacial entre a organização do genoma e a sua função durante a interfase (1,2 e referências citadas). Historicamente, os estudos de co-associação foram realizadas por investigar dezenas a centenas de loci individuais por FISH. Mais recentemente poderoso de alto rendimento com base em técnicas tais como 3C 4C e Hi-C foram desenvolvidos três, permitindo que a investigação das molecular conversa cruzada entre os muitos milhares de diferentes loci. Embora as técnicas baseadas em 3C e FISH DNA podem ser métodos complementares, que não necessariamente responder as mesmas perguntas. Métodos baseados em 3C proporcionar uma leitura de conjunto de populações de células misturadas, resultando numa probabildade de co-associações. Por outro lado, enquanto a baixa no rendimento, técnicas de base de peixe oferecem a possibilidade de analisar arranjos espaciais de loci ou cromossomos nas células individuais de acordo com as suas fases do ciclo de desenvolvimento ou celular. Assim, FISH continuará a ser uma importante ferramenta para sondar relações estrutura-função nucleares. Há duas considerações importantes na realização de experiências bem-sucedidas Fish 3D. Estes são: 1. obtenção de sondas marcadas optimamente e 2. escolha de tratamentos celulares, incluindo fixação, pré-e pós-passos de hibridação, para preservar a morfologia nuclear, tanto quanto possível, ao mesmo tempo que o DNA suficientemente acessível para hibridação da sonda. Eficiente rotulagem sonda é criticamente importante para os peixes. Tradicionalmente, a nick-translation foi usado para introduzir ou hapteno ou nucleótidos fluoróforos 4. Da mesma forma, kits nick-tradução comerciais estão disponíveis para hapten direta ou incorporação fluorophore, but também para duas etapas de marcação utilizando nucleótidos aminoallyl e corantes reactivos com amina. Este último torna corante incorporação mais eficiente, dando uma molécula de ADN-polimerase menos volumoso para trabalhar. Mais recentemente, a kits para a rotulagem não enzimática do DNA têm sido desenvolvidos, que exploram ligação coordenativa de platina para os ácidos nucleicos. Sondas de peixe pode até ser comprado já com o 5. Enquanto kits e sondas fabricadas comercialmente sem dúvida dar a facilidade de uso, eles são consideravelmente mais caro do que comprar os componentes individuais e produzir sondas em casa. Nós otimizamos um nick protocolo tradução de baixo custo, a fim de marcar diretamente diversos sondas BAC em várias cores. Nós descobrimos que a obtenção de ADN BAC de elevada pureza é importante e resulta num requisito de que apenas 10-20 ng de sonda por lâmina FISH, ante de 10 - 20 vezes mais quando o ADN molde impuro é usado, resultando num maior custo e tempo- poupança. A utilização de amino-allyldUTP permite rotulagem flexívelsondas com amina disponíveis corantes reactivos (por exemplo, Alexa Fluor ou CY-corantes) ou haptenos (por exemplo, biotina, digoxigenina). Sondas de hapteno-marcadas são detectadas por anticorpos fluoróforos ou estreptavidina para amplificar o sinal e visualizar. Sondas marcadas directamente brilhantes mostram geralmente menos a coloração de fundo e evitar o excesso de amplificação de sinais, daí resultando uma representação mais precisa da localização nuclear e morfologia lócus. Existem várias técnicas diferentes peixes que usam diferentes fixadores, pré-tratamentos e lavagens pós-hibridação, mas estes geralmente se enquadram nas seguintes categorias: fixação de glutaraldeído com NaOH desnaturação, fixação em formol com HCl desnaturação e fixação em formol com desnaturação 6-9 . Cada um destes tem vantagens e desvantagens. Glutaraldeído resultados de fixação em bom estado de conservação estrutural nuclear, mas necessita de tratamento com agentes redutores para minimizara autofluorescência resultante, tratamento com NaOH e deve ser cuidadosamente controlado para equilibrar a desnaturação do ADN suficiente e dano potencial a estrutura nuclear 6. Fixação em formol é menos forte, dando uma maior probabilidade de perturbações da arquitetura nuclear, mas também geralmente com sinais mais fortes e mais confiáveis ​​e menores autofluorescência 9. HCl tratamento depurinates DNA e tiras fora proteínas, proporcionando um bom acesso ao DNA para as sondas, mas também pode apresentar quebras de DNA. Aquecimento separa fisicamente as duas fitas de DNA, resultando em boa hibridização alvo e sinais fortes, mas pode causar alguma perturbação da estrutura nuclear 8. O grau em que cada uma destas técnicas afecta epitopos da proteína varia amplamente 6,9, resultando na necessidade de determinar experimentalmente para cada proteína o protocolo ideal para usar em experiências de imuno-peixe. Embora não haja um &#39;perfeito&#39; DNA FISH tehaver descrição prévia, todos eles podem ser úteis se forem bem controlados. O nosso objectivo foi o de optimizar um protocolo para robusto e reprodutível PEIXES DNA para investigar o posicionamento espacial dos múltiplos loci em uma variedade de tipos de células 10, incidindo sobre o método de aquecimento para a maioria dos sinais fiáveis. Com esta e a utilização de um sistema de imagem automatizado que visa aumentar a taxa de transferência para a análise de arranjos nucleares de célula única.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NTB buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen </td>
 <td>D-1532</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTPs</td>
 <td>Bioline</td>
 <td>BIO-39025</td>
 <td>Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aminoallyl-dUTP</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM8439</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA Polymerase I</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M02095</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase I recombinant RNase free</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4716728001</td>
 <td>Step 1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR purification kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104</td>
 <td>Step 1.1.4, 1.2.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaOAc</td>
 <td>VWR</td>
 <td>27653</td>
 <td>Step 1.1.5, Step 2.1.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S5761</td>
 <td>Step 1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications</td>
 <td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
 <td>A32750, A32756, A32757</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO (anhydrous) </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>276855</td>
 <td>Step 1.2.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
 <td>Life Technologies </td>
 <td>S33102</td>
 <td>Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cot-1 DNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18440-016</td>
 <td>Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single stranded DNA from salmon testes </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>D7656 </td>
 <td>Step 2.1.1.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Deionized formamide</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>F-9037</td>
 <td>Step 2.1.1.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate</td>
 <td>Sigma Life Sciences</td>
 <td>D8906 </td>
 <td>Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XMP painting probes</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td>000000-0528-837</td>
 <td>Step 2.1.1.4 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-lysine coated slides</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P0425</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrophobic pen (ImmEdge)</td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>H-4000</td>
 <td>Step 2.1.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>70 &mu;m sieve (Mouse fetal liver cells only)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352350</td>
 <td>Step 2.1.2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P6148 </td>
 <td>Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Cl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saponin from Quillaja bark</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100</td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T9284 </td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x PBS</td>
 <td>Life Technologies (GIBCO)</td>
 <td>70011-036</td>
 <td>Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>G/0650 </td>
 <td>Step 2.1.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HCl</td>
 <td>VWR</td>
 <td>20252</td>
 <td>Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formamide</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>47670</td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SSC</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 22</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022022A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverslips 22 x 50</td>
 <td>Menzel-Glaser</td>
 <td>BB022050A1</td>
 <td>Step 2.1.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rubber cement</td>
 <td>Marabu</td>
 <td>2901 (10 000)</td>
 <td>Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen Molecular Probes</td>
 <td>D3571</td>
 <td>Step 2.2.8 (Health hazard)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SlowFade Gold</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S36936</td>
 <td>Step 2.2.10 (mounting medium)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear nail polish</td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.2.10</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nanodrop 2000</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td>
 <td>GE Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Step 1.2.4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coplin jars</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td>
 <td>Step 2.1.3 onwards</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen dewar </td>
 <td>Any supplier</td>
 <td></td>
 <td>Step 2.1.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Base with Black Lid (light-tight chamber)</td>
 <td>Simport</td>
 <td>M920-2</td>
 <td>Step 2.1.17</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer comfort</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5355 000.011</td>
 <td>Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 &deg;C room)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Imaging and Image processing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metafer - Imaging Automation Platform</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis</td>
 <td>MetaSystems</td>
 <td></td>
 <td>automated imaging software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axio Imager Z2 upright</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td></td>
 <td>epifluorescence microscope used with automated imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IX81 confocal microscope (FV1000)</td>
 <td>Olympus</td>
 <td></td>
 <td>confocal microscope</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bitplane, version 7.3</td>
 <td>Imaris</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and 3D modeling software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scientific volume Imaging, version 4.1</td>
 <td>Huygens</td>
 <td></td>
 <td>image analysis and deconvolution software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 FISH buffers and reaction mixes 
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Composition</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x NTB buffer</td>
 <td>0.5 M Tris-HCl, pH 7.5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.05 M MgCl2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mg/ml BSA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP Mix</td>
 <td>0.5 mM dGTP</td>
 <td>Store 50 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dATP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.5 mM dCTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>0.125 mM dTTP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 % PFA</td>
 <td>Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 &deg;C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA.</td>
 <td>Store 50 ml aliquots at -20 &deg;C, do not re-freeze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 % saponin solution</td>
 <td>Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. </td>
 <td>Store 5 ml aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 x SSC</td>
 <td>Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dextran sulphate mix</td>
 <td>20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight.</td>
 <td>Store 500 &mu;l aliquots at -20 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </td>
 </tr> 
 </tbody>
</table>

robust 3d dna fish using directly labeled probes

PEIXES 3D DNA tornou-se uma ferramenta importante para a análise de organização tridimensional do núcleo, e várias variações da técnica têm sido publicados. Neste artigo descrevemos um protocolo que foi otimizado para robustez, reprodutibilidade e facilidade de uso. Brilhantemente fluorescentes directamente as sondas marcadas são gerados por nick-translation com amino-allyldUTP seguido por acoplamento químico do corante. 3D ADN FISH é realizada utilizando um passo de congelamento-descongelamento para permeabilização celular e um passo de aquecimento para a desnaturação simultânea de sonda e o DNA nuclear. O protocolo é aplicável a uma variedade de tipos de células e uma variedade de sondas (BACs, plasmídeos, fosmids ou tintas cromossoma inteiro) e permite a imagiologia automatizado de alto débito. Com este método rotineiramente investigar a localização nuclear de até três regiões cromossómicas.

O protocolo aqui descrito (Figura 1 para uma descrição) foi usado para um grande efeito de combinar o ADN FISH com captura de imagem de alto rendimento para a análise da organização genómica. A geração de sondas de boa qualidade é fundamental para o sucesso (ver Discussão). Figura 2 demonstra duas importantes controles de qualidade para sondas de peixe. Depois de nick-translation, uma mancha de DNA deve ser visível com a maior parte dos fragmentos de funcionamento, entre 150 e 700 pb (Figura 2A). Após o acoplamento químico, a incorporação do corante fluorescente pode ser medida por meio de análise espectroscópica da sonda (Figura 2B). Ao utilizar boas sondas, seguindo o protocolo FISH DNA geralmente resulta em claros sinais de FISH de DNA em baixo de fundo. Temos utilizado com sucesso este protocolo em uma variedade de diferentes tipos de células, e tanto com microscópios de epi-fluorescência e confocal. Imagem automatizada usando um epi-fluorescence microscópio de sinais de FISH requer cortantes, facilmente identificáveis ​​com pouco fundo (Figura 3), ao passo que a microscopia confocal requer sinais mais intensos. Figura 4A mostra imagens representativas transformados. Coordenadas nucleares de sinais de peixe pode ser obtida, e as relações espaciais de regiões genômicas pode ser computada (para um exemplo veja a Figura 4B). Temos também utilizado pilhas de imagens obtidas por microscopia confocal para modelagem 3D de sinais de FISH nos seus territórios de cromossomos (Filme 1). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo de Trabalho para a rotulagem sonda e FISH DNA. Preparação Probe é mostrado em azul. Procedimento FISH DNA é mostrado em preto com detalhes fornecidos em verde. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Figura 2. Marcação de sondas por nick-translation e controle de sondas marcadas qualidade. A) Gel mostrando esfregaço ideal antes de aquecer para inativar DNase I (pista 1: escada de DNA, a pista 2 e 3: BACs após nick-translation). Fragmentos deve estar no intervalo de 150-700 pb. Uma mancha adicional no ~ 1 kb é freqüentemente observada com reações nick-tradução de sucesso. B) análise espectro Microvolume de sondas marcadas. Um pico de ADN, a 260 nm, é observada com um segundo pico, que corresponde ao comprimento de onda de absorvância do fluoroforo a sonda é marcada com: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. São mostrados três sondas com boa incorporação: os picos de absorção fluoróforo são uma altura similar ou superior aos picos de DNA. Alexa Fluor 647 tipicamente tem maior absorvânciade Alexa Fluor 555, que por sua vez tem uma maior absorvência de Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 também absorve um pouco de luz a 260 nm, portanto, o primeiro pico para esta sonda é maior do que os outros. Sondas com má incorporação mostra fluoróforo absorvância 2-3-vezes inferior do que a absorção de DNA. Sondas com mais do que um pico maior fluoróforo 2 vezes do que o ADN de pico normalmente contêm corante não conjugada que podem causar fundo no peixe. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Figura 3. Tela do software de imagem 3D peixe MetaCyte mostrando uma experiência típica FISH três cores. A tela é dividida em várias partes. A) imagem de campo de visão (FOV) Raw capturado pelo Metafer / MetaCyte sistema de digitalização de slides. B) Gallery de imagens de núcleos identificadas que têm unprocessamento de imagem dergone e segmentação de sinais de peixe. Vários tipos de dados podem ser exibidos em cada galeria de imagens. Neste exemplo, o número de células é mostrada superior esquerdo com vários interallelic e interlocus distâncias topo direita e para ambos os lados por baixo de cada imagem. C) Razão corrediça com o número de núcleos identificados na análise. D) Representação da corrediça com a área digitalizado pela sistema. E) O alargamento da área digitalizada. Manchas brancas representam os núcleos identificados por FOV. F) dados processados. Neste exemplo são apresentados interallelic distâncias máximas entre os sinais verdes (topo) e vermelho (inferior). Os dados mostrados são de rato P20 células germinativas. As sondas estão localizados em cromossomos diferentes, cobrindo HBB e genes HBA e um conjunto de histonas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Dentro-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de imagens processadas e os dados posicionais derivados. A imagens) processados ​​para E13.5 rato as células do fígado fetal corados com sondas BAC localizados em cromossomos diferentes que cobrem Myc e KCNQ1 genes (chamados myc e KvDMR, de cor verde e vermelho, respectivamente). B) Tukey parcelas box-whisker representando a distância interallelic distribuição para os mesmos loci em núcleos 600. Interallelic distância é representada como uma fracção do raio do núcleo &#39;(distância / do raio) para ter em conta as variações no tamanho nuclear. Núcleos de células ES têm um raio de cerca de 5 micrómetros. Sondas vermelhas são significativamente mais juntos do que as sondas verdes (***: p &lt;0,01, teste t não pareado). Dados a partir de 10. Filme 1. Modelagem 3D de dois loci dentro de seu cromossomo territory. Duas sondas BAC localizados perto de cada extremidade do cromossomo 7 do mouse foram rotulados (vermelho e vermelho distante, (branco pseudo-colorido)) e hibridizado com uma tinta cromossomo inteiro (verde) de células-tronco embrionárias de rato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> .

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Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

robust-3d-dna-fish-using-directly-labeled-probes

Research

JoVE Journal

Biology

34.4K visualizações.  The Babraham Institute. Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Vídeo: Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Biologia

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Avaliando Contribuições Espécies específicas Para o Desenvolvimento Craniofacial Utilizando Quimeras Codorniz-pato

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Observação e Quantificação de Telomere e Sequências Repetitivas Utilizando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; Fluorescente (FISH) com PNA Sondas em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems for sperm analysis were developed to measure several parameters and one of the most commonly measured is the sperm motility.
Initially, this computer technology was designed for mammalian species, although it can also be used for fish sperm analysis. Fish have specific features that can affect sperm assessment such as a short motility time after activation and, in some cases, adaptation to lower temperatures. Thus, it is necessary to modify both software and hardware components to make motility analysis more efficient for fish sperm analysis. For mammalian sperm, the heating plate is used to maintain optimal temperatures of spermatozoa. However, for some fish species, it is advantageous to use a lower temperature to prolong the duration of motility, since the sperm remain active for less than 2 min. Therefore, cooling devices are necessary to refrigerate samples at constant temperature over the time of analysis, including on the optical microscope. This protocol describes the analysis of fish sperm motility using software for sperm analysis and new cooling devices to optimize the results.

The present protocol describes a procedure of fish sperm assessment using computer-assisted sperm analysis and cooling devices. The software gives a rapid, accurate and quantitative analysis of fish sperm quality based on spermatozoa motility, which can be a useful tool in aquaculture to improve reproduction success.

Avaliação do esperma de peixe utilizando Software e dispositivos de refrigeração

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...