We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Monitoramento transcelular Espalhando de proteínas príon-like por In Vivo tempo-lapso NOTA: Crescer C. elegans do tipo selvagem (WT) (N2) e linhas transgénicas de acordo com métodos padrão e controlar cuidadosamente a temperatura de cultivo 47. <ol><li> Gerar linhagens transgênicas de C. elegans que expressa a proteína prion-like, marcado com proteína fluorescente vermelha monomérica (MRFP). Assista a este vídeo que demonstra como usar a microinjeção 48. Para mais detalhes e métodos que descrevem como integrar estas linhas extracromossómicos, consulte 49. </li><li> Prepare populações sincronizadas por colocação de ovo ou branqueamento de acordo com métodos padronizados 50. <ol><li> Sincronização de postura de ovos <ol><li> Transferência de 10-20 adultos grávidas em um prato e deixe que eles põem ovos por 1-2 horas. Remover adultos a partir da placa e deixar a crescer até a progenitura idade desejada. </li></ol></li> &lt;li&gt; Sincronização por branqueamento <ol><li> Recolha uma população de adultos grávidos não sincronizado e branquear com uma solução de hipoclorito alcalino (NaOH a 250 mM e 1: 4 (v / v) diluição da lixívia comercial em H 2 O). Lavar os ovos duas vezes (218 xg durante 1 min) com tampão M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO · 4 7H 2 O, adicionar dH2O até 1 L). </li><li> Permita-lhes a eclodir em tampão M9 com suave agitação O / N a 20 ° C. Desenvolvimento verme vai prender na fase L1 na ausência de uma fonte de alimento, deixando uma população sincronizada. Transfira para L1s fresco nematóides Crescimento Media (NGM) placas semeadas com OP50 E. coli bactérias e deixar a prole se desenvolver até a idade desejada 47. </li></ol></li></ol></li><li> Prepare 2% almofadas de agarose (em H 2 O) em uma lâmina de microscópio como descrito 50. <ol><li> Prepare dois microscope com lâminas de fita de rotulagem colocados ao longo de todo o seu comprimento para ser usado como espaçadores. Colocar uma terceira lâmina de microscópio entre eles. </li><li> Dissolve-se 2% de agarose em H 2 O e uma pipeta de queda sobre a lâmina limpa. </li><li> Coloque uma quarta corrediça perpendicular aos outros três lâminas sobre o topo da gota de agar. Pressione levemente para baixo para achatar a almofada para a mesma espessura que a fita de rotulagem. </li><li> Deixe secar por 1 min antes de retirar os espaçadores e puxando os slides separados. A almofada de agar vai ficar com um deles. </li></ol></li><li> Pipeta ~ 10 ul anestésico (2 levamisol mM em tampão M9) para a almofada de transferência e ~ 10 animais utilizando-se uma escolha de fio de platina. Cubra com uma lamela (~ 22 x 22 mm) e tirar fotos dentro de 1 hora. </li><li> Alternativamente, para adquirir os filmes ao longo de um longo período de tempo ou para reduzir ainda mais a possibilidade de uma deslocação dos animais, usar uma combinação de anestésico e talão de imobilização 51. <ol><li> Prepare 10% agaalmofadas aumentou (em tampão M9), conforme descrito 51 e adicionar minhocas a 3 ul solução padrões de tamanho nanosphere (esferas de poliestireno, 100 nm), mais 3 anestésicos ul (4 levamisol mM em tampão M9). Cubra delicadamente com uma lamela. Para evitar a desidratação, selar a lamínula com valap (mistura de quantidades iguais de vaselina, lanolina e cera de parafina). </li></ol></li><li> Imagem vermes imobilizada utilizando um microscópio confocal. Nota: Os resultados são obtidos utilizando um disco giratório AF confocal microscópio equipado com uma câmera de EM-CCD e um Software Microscopia Automação e Análise de Imagem, como MetaMorph e delinear os detalhes abaixo, mas outros sistemas de imagem confocal comparável também pode ser usado. <ol><li> Use o objetivo de óleo 63X ou 100X / 1.4NA e coloque a lâmina de microscópio contendo vermes no suporte da lâmina de microscópio. </li><li> Abra o software. Ajuste de potência do laser e filtros para MRFP imagem. Use o laser 561 nm a 10% de energia e emissão de filtro&gt; 600 nm. </li><li&gt; Open &quot;MultiDimensional Aquisição&quot;. Na aba &quot;Main&quot;, marque as caixas de &quot;Timelapse&quot; e &quot;Run Journals&quot; (Hardware Auto Foco: off). </li><li> Sob a guia &quot;Saving&quot; selecionar ou criar a pasta do diretório onde os arquivos devem ser salvos. Atribua um nome para o arquivo. </li><li> No separador &quot;Comprimento de onda&quot;, selecione a iluminação adequada e ajustar a exposição e ganho. Use &quot;YokoQuad Red&quot; (ou uma configuração de iluminação equivalente para MRFP de imagem) com uma exposição de entre 100 e 300 ms e um ganho da câmera entre 100 e 300, dependendo da amostra individual (avaliada usando a imagem ao vivo). </li><li> No separador &quot;Timelapse&quot; selecionar &quot;Número de pontos de tempo&quot; = 301, &quot;Duração&quot; = 5 min e &quot;Time / Interval&quot; = 1 seg. </li><li> Sob a &quot;Journals&quot; tab selecione Journal: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; e &quot;AFC Return to Z HOLD&quot;, Tipo: &amp;# 8220; Special &quot;(duas vezes), Ponto inicial:&quot; Inicio do horário de ponto &quot;e&quot; Fim do ponto de tempo &quot;. Esta opção de focagem automática é importante para a imagem da mesma secção ao longo de um período mais longo de tempo. </li><li> Quando a instalação for concluída, pressione &quot;Adquirir&quot;. O vídeo timelapse é safed como arquivos TIFF separados. </li><li> Abra todas ficheiros.tiff de uma determinada série tempo em ImageJ. Vá em &quot;Imagem&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Imagens para Stacks&quot;. Opcionalmente, ajustar brilho e contraste, adicionar bar tamanho, etc. Exportar o filme em &quot;File&quot; → &quot;salvar como&quot; → &quot;AVI ...&quot; (por exemplo, ver vídeo 1 e 2 correspondente à Figura 1). </li></ol></li></ol> 2. Usando dobráveis ​​Sensores e Repórteres de estresse para Investigar celular autónomos e não celular Autónoma afeta em Proteostase e Toxicidade <ol><li> Gerar linhagens transgênicas que co-expressar um sensor de dobragem ou estresse reporter em conjunto com a proteína prião semelhante. Para os métodos sobre como estabelecer cruzes ou gerar linhagens transgênicas, ver 48,49,52. Ver Tabela 1 para uma lista de C. elegans estirpes que podem ser utilizadas. </li><li> Prepare populações sincronizados de animais transgênicos e cultivá-las até a idade desejada, conforme descrito acima (seção 1.2) 50. </li><li> Usando um microscópio estereoscópico, examinar o respectivo fenótipo do sensor de dobragem ou estresse repórter. <ol><li> Para o sensor de dobragem, determina o número de animais que albergam agregados em cada dia depois da sincronização (por exemplo, ver Figura 2E e F). </li><li> Para o repórter tensão, se o ensaio de co-expressão dos resultados priões do tipo de proteína em uma fluorescência aumentada do repórter (para um exemplo, ver Figura 3). </li></ol></li></ol> 3. Tela Genome-wide para Repressão de toxicidade induzida por Prion em C. elegans<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figura 4. Representação esquemática do protocolo de triagem RNAi. Consulte a seção de protocolo 3 para uma descrição detalhada das etapas individuais. <ol><li> Sincronização de C. vermes elegans e duplicação de biblioteca RNAi <ol><li> Para a tela de RNAi, usar a biblioteca Ahringer RNAi (ou a biblioteca Vidal RNAi) 53,54. Rearray a biblioteca de RNAi do original 384 formato bem em placas de 96 poços, preenchendo as placas com 100 ul meio LB-amp (50 ug / ml de ampicilina em LB) suplementado com 10% de glicerol e inocular utilizando um replicador de 96 pinos. Crescer a 37 ° CO / N com agitação e armazenar a -80 ° C. </li><li> Manter C. linhagens transgênicas em 20 ° C em placas NGM elegans WT e semeado com OP50 E. bactérias coli de acordo com métodos padrão 47. </li><li>Sincronize transgênico domínio prion e WT (controle) nematóides pelo branqueamento (ver secção 1.2). </li><li> No mesmo dia em que os vermes são branqueados, preparar meio LB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina. Usar um dispensador automático para distribuir o reagente (ou pipeta manualmente) 65 ul dos meios LB-amp em cada poço de uma placa de 96 poços. </li><li> Retirar 96 poços placas biblioteca Ahringer RNAi de -80 ° C e trazê-los para um capuz estéril forrado com papel toalha. Remover imediatamente o selo-tape, segurando a placa de cabeça para baixo, enquanto as placas ainda estão congelados, tendo o cuidado para evitar a contaminação de gelo do lado de fora das placas. Reinverter as placas e deixá-los descongelar por cerca de 30 min. </li><li> Mergulhe uma estéril 96 pin replicador em uma placa de RNAi biblioteca, e, em seguida, em uma placa de LB-amp fresco. Use um replicador estéril nova para cada prato. Vede todas as placas com fita adesiva e papel alumínio retornar as placas da biblioteca para -80 ° C. Os replicadores pode ser embebido em água sanitária, enxaguado,e autoclavado para ser usado novamente. </li><li> Permitir placas duplicadas de ARNi para crescer O / N em uma incubadora ajustada a 37 ° C e 300 rpm. Para usar HT115 E. coli bactérias que albergam o vector vazio (L4440) como um controlo, crescem-lo separadamente num tubo de cultura e, em seguida, pipeta 65 ul da cultura com uma pipeta de canais múltiplos dentro de um quarto de duas placas de 96 poços. </li></ol></li><li> A indução da produção bacteriana ARNcd e adição de vermes <ol><li> Dilui-Isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) para uma concentração de 5 mM em ddH 2 O. Utilize uma estação de trabalho automatizada com uma cabeça para dispensar múltiplos canais (ou pipeta manualmente) 10 ul de IPTG diluída em todos os poços das bactérias RNAi e as placas de controlo. Voltar a vedar e colocar as placas de novo na incubadora. Deixá-los agitar durante 3 horas a 37 ° C. </li><li> Enquanto as bactérias estão tremendo, preparar os vermes. Misture a suspensão M9 / verme bem, e pipetar uma pequena amostra (~ 5 - 10 ul) para uma lâmina de microscópio de vidro. Contaro número de vermes sob microscópio estereoscópico e calcular o número de vermes por ul. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, preparar uma solução de M9 suplementado (M9 +) com as seguintes concentrações finais: 0,20 mg / ml de IPTG, 8,0 ug / ml de colesterol, 50 ug / ml de ampicilina, 9,6 ug / ml de tetraciclina, 0,0835 ug / ml de Fungizone, e 15 vermes por 50 ul. <ol><li> Faça soluções separadas para transgênica domínio prion e vermes WT. O volume final da solução verme M9 + necessária irá depender do número de placas de ARNi copiados (ver abaixo), além de ~ 30 ml de volume morto que vai permanecer no reservatório, se um distribuidor automático é usado. </li></ol></li><li> Após a indução de 3 horas de produção dsRNA bacteriana, tirar as placas fora da incubadora e deixe-os arrefecer à RT (~ 30 min) para evitar calor perturbar os animais. </li><li> Dispensar 50 ul de domínio de prião solução verme transgénico M9 + para cada poço das placas de ARNi e uma das placas de controlo do vector vazio. FazerCertifique-se de misturar a solução verme antes de cada passo como os animais tendem a sedimentar para o fundo do reservatório. </li><li> Dispensar vermes WT para a segunda placa de controle. Deixar as placas não vedadas para permitir o arejamento. Para manter a cultura líquido evapore, empilhe 4-5 placas juntos e enrole com uma toalha de papel úmido e papel alumínio. Incubar a 200 rpm a 20 ° C durante 4 dias. </li></ol></li><li> Scoring NOTA: Após 4 dias na incubadora, os vermes estará no segundo dia de vida adulta e estão prontos para o rastreio. Deixe os animais se adaptar às condições não agitam durante 30 minutos antes de triagem para garantir surra sem serem incomodados. <ol><li> Usando uma câmara Falcon 4M60 ligado a um computador com um monitor, para o aumento da tela visualmente debulha, em comparação com o domínio de prião animais transgénicos de controlo tratados. </li><li> Compilar uma lista de visitas preliminares para confirmar usando wrMTrck (veja a próxima seção). </li></ol></li></ol> 4. Confirmação da PreliminarBatida de tela <ol><li> Ensaio de motilidade em placas sólidas <ol><li> Preparar placas com NGM suplementadas com 100 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de tetraciclina e 1 mM de IPTG, de acordo com métodos padrão 47. Se possível, use uma máquina de despejar placa para assegurar todas as placas têm a mesma altura dos meios de comunicação, o que permitirá um processo de aquisição de vídeo mais simplificado. </li><li> Crescer as diferentes clones de ARNi em ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml de ampicilina, O / N a 37 ° C e 250 rpm. </li><li> No dia seguinte, induzir a expressão do ARNcd com IPTG 1 mM durante 3 h. Semente as placas com 150 mL de cada clone bacteriano RNAi, distribuídos em uma camada fina. Deixe as bactérias secas durante 2 dias à TA no escuro. Prepare 3 placas por RNAi clone. </li><li> Sincronize a população sem-fim por branqueamento de acordo com métodos padronizados 50 (ver secção 1.2), e deixe os ovos eclodem O / N em M9 mídia. </li><li> Tomar uma amostra da suspensão verme e determinar a quantidade de NEMatodes por ul no microscópio estereoscópico. Em seguida, pipetar o volume adequado de meio M9 mais vermes em cada placa experimental de modo que contenha 25 - 30 vermes L1. Crescer as nemátodos a 20 ° C durante 4 dias até que os vermes atingir dia 2 da fase adulta. </li></ol></li><li> A análise quantitativa da motilidade verme com o plugin wrMTrck para ImageJ NOTA: Os vídeos foram gravados usando um microscópio estereoscópico com aumento de 10x com um Hamamatsu Orca-R2 câmera digital C10600-10B eo software PCI imaging Simples Hamamatsu. <ol><li> Ligue a câmera eo software PCI imagem simples. Clique em &quot;Live&quot; para permitir o ajuste das condições de imagem. </li><li> Configurar as condições de vídeo como se segue: Ganho = 0; Modo Luz = alta; Índice de Velocidade = 1; Binning = 2. Clique em &quot;Auto Exposé&quot; e, em seguida, ajustar as condições de iluminação, movendo-se os espelhos microscópio e do brilho e contraste mostradores. NOTA: O vídeo precisa ter um alto contraste sem ser OVEREXPosed, de modo que os animais aparecem como formas pretas em um fundo brilhante. </li><li> Clique em &quot;Scan Time&quot; e escolha uma pasta e um nome de arquivo. Defina &quot;Campo Delay&quot; para 20 ms e &quot;Pare no Time&quot; a 30 seg. Pressione &quot;Review Live&quot;, a fim de escolher a área da chapa para gravar (onde a maioria dos worms são). Toque na placa 3 ou 4 vezes no palco, rapidamente confirmar a sua posição no campo de visão e pressione &quot;Start&quot;. </li><li> Depois que o filme termina de gravar, clique direito sobre a imagem e escolha &quot;Exportar Montage Sequence&quot; para exportar o filme a partir de um formato .cxd a um .avi. </li></ol></li><li> Analisando os vídeos de motilidade <ol><li> Abra o software ImageJ, vá para a aba &quot;Plugins&quot; e depois em &quot;wrmtrck&quot; e selecione &quot;Batch wrMTrck&quot;. Selecione o diretório que contém todos os arquivos a serem analisados. </li><li> Na janela de entrada principal do wrMTrck_Batch, carregar os valores de entrada, conforme detalhado na Figure 5C. Explicação para cada um dos parâmetros podem ser encontradas no manual de instruções que acompanham o plugin. Clique em &quot;OK&quot; e deixar a análise do movimento de execução. </li><li> Para a curadoria os resultados e confirmar que todas as faixas detectadas são de real C. elegans e eliminar artefatos, abra cada um dos arquivos .txt criados para cada filme e copiar as informações em um arquivo de software de análise de dados. Abra o &quot;* _labels.zip&quot; arquivos criados e executar o que resulta &quot;* _labels.tif&quot; para verificar e eliminar faixas vermes falsos manualmente. </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Os métodos descritos aqui ajudam a ilustrar espalhando e celular toxicidade autônoma da célula complexo autônomo e não de proteínas príon-like. Descobrimos recentemente que um domínio de prion cytosolic agregação propensas é retomado em vesículas ligadas à membrana em um processo de autofagia relacionados. Um subconjunto específico dessas vesículas transporta o domínio de prião dentro e entre as células e tecidos 40. A chave para controlar o seu movimento no animal vivo é que a proteína te...

Muitas doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), e encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), estão associados a proteínas de agregação propensas e são, portanto, conhecidos coletivamente como proteína misfolding transtornos (EPM ). EET ou doenças provocadas por priões constituem uma classe única de EPM em que eles podem ser infecciosas em seres humanos e animais 1. A nível molecular, prions replicar recrutando e convertendo monomérica α-hélice-rico codificado-host PrP celular (PrP C) para o patológico β-folha-rico conformação PrP Sc 2,3. Agregados de proteína auto-propagação também foram identificados em fungos, que partilham características importantes de mamíferos com priões 4,5. Além disso, os priões mamíferos são capazes de mover a partir de célula-a-célula e infectar células naive 6,7. Enquanto EPM other do TSE não são infecciosos, eles compartilham um princípio patogênico comum com doenças de príon 8,9. Embora as proteínas ligadas a cada um dos EPM não estão relacionados em termos de estrutura ou função, eles todos formam agregados por meio de um processo de cristalização, chamado nucleada ou semeada de polimerização; Além disso sementes proteicos crescer através do recrutamento de suas isoformas solúveis 2,10,11. A eficiência para a auto-propagam in vivo varia, dependendo das propriedades intrínsecas da proteína, que, em conjunto com factores celulares adicionais, tais como as chaperonas moleculares, em última análise determinam as taxas de nucleação agregado, a sementeira, a fragmentação e espalhamento 12-15. Por isso, deve haver um bom equilíbrio entre esses fatores que permite a propagação eficiente de agregação de proteínas. Isso também pode explicar por que apenas alguns agregados amiloidogénicas abrigar as características de um prião, e, assim, nem todos os EPM são infecciosas. Os príons parecem representar o &#39;top-performers&#39;fa amplo espectro de agregados proteicos de auto-replicação, o que os torna uma ferramenta poderosa para estudar EPM 8,13. Curiosamente, a toxicidade associada com agregados relacionados com a doença muitas vezes tem um componente autônomo não célula 16,17. Isto significa que eles afectam as células vizinhas que não expressam o gene correspondente, em contraste com um efeito estritamente autónoma célula, o que implica que apenas as células que expressam o gene exibem o fenótipo específico. Este foi convincentemente demonstrada pela expressão específica de tecido ou derrubar das respectivas proteínas em vários modelos de doenças neurodegenerativas 18-26. Vários mecanismos têm sido sugeridos como uma base para esta não-toxicidade celular autônomo na EPM, incluindo o fornecimento de nutrientes diminuído, o desequilíbrio na sinalização neuronal, excitotoxicidade do glutamato, e neuroinflammation 16,27,28. Além disso, um movimento de prião semelhante de agregados ligados de doenças entre as células might contribuir para este aspecto 29,30. Uma evidência crescente sugere que outras inclusões de proteína que pode transmitir priões a partir de célula-para-célula, o que pode explicar a característica de difusão na patologia observada em muitos EPM 30-36. No entanto, ele ainda não foi determinado se há um claro nexo de causalidade entre o movimento intercelular de proteínas doença eo efeito tóxico sobre as células vizinhas. Por conseguinte, um melhor entendimento das vias celulares que estão subjacentes a transmissão célula-a-célula e célula não autónomo toxicidade é necessária e essencial para o desenvolvimento de novas terapias. No entanto, muitos aspectos do prião como espalhando-celulares e factores que influenciam a transmissão célula a célula de proteínas mal enroladas em metazoários não são bem compreendidos, em particular ao nível dos organismos. O nemátodo Caenorhabditis elegans tem várias vantagens que oferecem o potencial de descobrir novas facetas de spreadi prion-likeng em metazoans 17. É transparente, permitindo a rastrear in vivo de proteínas marcadas fluorescentemente no organismo vivo. Além disso, muitos processos celulares e fisiológicas afectadas pela doença são conservados de vermes para a saúde humana, e C. elegans é também susceptível a uma grande variedade de manipulações genéticas e análises moleculares e bioquímicos 37-39. Exatamente 959 células somáticas compõem o hermafrodita adulto com um plano corporal simples, que ainda tem vários tipos de tecidos diferentes, incluindo músculos, neurônios e intestino. Para estabelecer um novo modelo de príon em C. elegans, que escolheu para expressar exogenamente a glutamina bem caracterizada / asparagina (Q / N) rico em prião NM domínio do cytosolic proteína de levedura prion Sup35, já que não há proteínas príon endógenas conhecidas em vermes 4,40. Prions levedura foram inestimáveis ​​para elucidar os mecanismos básicos de prion replicação 41-44. Além disso, NM é o abetoproteína prião como citosólica-r que tem sido mostrado para recapitular o ciclo de vida completo de um prião em cultura de células de mamífero 45,46. Da mesma forma, quando expresso em C. elegans, o domínio prion Sup35 adotado muito bem com as diferentes necessidades para propagação em células metazoários em comparação com células de levedura e principais características expostas da biologia prion agregação 40. NM foi associada com um fenótipo tóxico profunda, incluindo a ruptura da integridade mitocondrial e aparecimento de várias vesículas autofagia relacionados sobre o nível celular, bem como prisão embrionário e larval, atraso do desenvolvimento, e uma perturbação generalizada do ambiente dobramento de proteínas ao nível do organismo. Surpreendentemente, o domínio príon celular apresenta toxicidade autônoma e não autônomos celular, afetando tecidos vizinhos em que o transgene não foi expressa. Além disso, o transporte vesicular do domínio prião dentro e entre as células é monitorado em tempo real &lt;em&gt; in vivo 40. Aqui nós descrevemos como examinar divulgação prion-like em C. elegans. Vamos explicar como monitorar o transporte intra e intercelular de vesículas contendo o domínio prion usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo. Vamos enfatizar o uso de sensores de dobradura de tecidos específicos e universalmente expressa repórteres de estresse para avaliar Cell efeitos autônomos autónomos e não sobre fitness celular. Finalmente, vamos descrever o procedimento de uma grande tela recentemente realizada genoma RNA de interferência (RNAi) para identificar novos modificadores de toxicidade induzida por prion. Em conjunto, estes métodos podem ajudar a provocar uma separação de caminhos genéticos envolvidos no movimento intercelular de proteínas e sua toxicidade autónoma non celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Monitoramento intercelular difusão de proteínas príon-like in vivo por time-lapse imaging Transgênicos C. linhas elegans que expressam o domínio prião são particularmente bem adaptados para a análise de certos aspectos de proteínas priões do tipo, por exemplo, transmissão de célula para célula e a toxicidade celular não autónomo. A transparência dos animais permite o acompanhamento de fluorescente etiquetado proteínas de d...

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Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K visualizações.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Anticorpo de coloração em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Usando o &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medição dos Efeitos de bactérias em<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento Usando um Retenção Ensaio Egg

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.