O uso de expressão específica do tecido de repórter fluorescente de poliglutamina em C.elegans é significativo porque permite a descoberta e caracterização de reguladores de proteostase no contexto de um organismo multicelular intacto. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização e quantificação do declínio associado à idade na proteostase celular in vivo, o que é essencial para obter uma visão mecanicista mais profunda sobre como os organismos mantêm a dobra adequada e a função do proteome e os efeitos do envelhecimento. Mecanismos elucidantes capazes de preservar a proteostase facilitarão o desenvolvimento de intervenções direcionadas para o tratamento de doenças associadas ao envelhecimento em que a proteostase está comprometida e promoverá o envelhecimento saudável.
O colapso da proteostase é um problema clínico massivo, pois está por trás do desenvolvimento de doenças de dobra de proteína, incluindo Alzheimer, Parkinson, doença de Huntington e esclerose lateral amiotrófica. Comece usando placas de Petri de 6 centímetros de diâmetro para preparar cinco placas de ágar para cada condição de teste. Para experimentos com RNAi, induza a produção de dsRNA em HT115 E.coli transformado e use ágar RNAi.
Use OP50 E.coli no ágar NGM padrão para experimentos sem RNAi. Cresça as culturas E.coli durante a noite a 37 graus Celsius enquanto treme a 220 RPM. No dia seguinte, pelotar as bactérias por centrifugação a 2.400 G por 15 a 20 minutos, em seguida, aspirar o supernante e suspender novamente a pelota em um décimo do volume inicial de lb.
Alíquota de 200 microliters de bactérias concentradas em cada placa e permite que as placas abertas sequem em um ambiente limpo até que todo o líquido tenha sido absorvido. Para sincronizar os C.Elegans com tratamento de hipoclorito, lave hermafroditas áridas duas vezes com tampão M9, depois transfira-os para um tubo fresco e incubar em 5 mililitros de solução hipoclorito por cinco minutos, sacudindo-os a cada minuto. Após a incubação, gire os animais e lave-os três vezes com tampão M9.
Permita que os embriões eclodam em tubos durante a noite em 3 mililitros de solução M9 com rotação a 20 graus Celsius. Calcule a densidade de animais L1 soltando 10 microlitadores de solução L1 três vezes em uma placa de 6 centímetros e contando o número de animais L1. Periodicamente, misture as soluções L1 para evitar que os animais se instalem.
Semente 50 L1 um animal em cada prato, conte e regise o número semeado, e mova as placas para uma incubadora de 20 graus Celsius. Alternativamente, para sincronizar os animais através de ovo lay, coloque cinco a dez animais adultos jovens e gravid em cada prato por quatro a seis horas e permita que eles coloquem ovos até que haja aproximadamente 50 ovos por prato. Remova todos os adultos gravid e mova as placas com os ovos para uma incubadora de 20 graus Celsius.
Cresça os animais até a etapa L4, que levará aproximadamente 40 horas a 20 graus Celsius. Em seguida, adicione 50 microliters de 160 vezes FUDR. Para medir o declínio da proteostase no tecido muscular, escolha 20 animais e monte-os em um slide de microscópio com uma almofada de 3% de agarose e uma queda de 5 microliter de 10 milimilas de azida de sódio.
Depois que todos os vermes são imobilizados, imagem de todos os corpos dos animais usando uma lente de ampliação de 10 X. Use um filtro FITC ou YFP e a mesma exposição para cada animal. Quando terminar, descarte os slides.
Conte o número de focos nos músculos da parede do corpo de todo o animal. Os focos são sinais pontuados mais brilhantes que podem ser diferenciados do sinal solúvel de dimmer no fundo. Nos dias de pontuação, olhe as placas com os animais e regise o número de animais paralisados, em seguida, remova animais paralisados da placa.
Ao final do experimento, calcule a taxa de paralisia de cada condição e plote a progressão da paralisia. Para medir o declínio da proteostase no tecido neuronal, monte os vermes em um slide como descrito anteriormente e leve imagens da cabeça dos animais em um microscópio composto usando uma lente de ampliação de 40 X. Descarte os slides após a imagem.
Depois de adquirir as imagens, achate as pilhas Z e use-as para quantificar o número de focos em neurônios localizados na área do anel nervoso. Traçar a progressão do acúmulo de focos YFP dos dias 4, 6, 8 e 10. No segundo dia da vida adulta, escolha 10 animais sincronizados da placa e coloque-os em uma queda de 10 microliter de tampão M9 em um slide de microscópio.
Repita esta etapa pelo menos quatro vezes para obter uma amostra de 40 ou mais animais. O vídeo registra o movimento dos animais por um período de 30 segundos em um microscópio estéreo com uma câmera capaz de vídeo. Uma vez que todos os vídeos com os animais a serem analisados são gravados, reprodumente o vídeo e marque as curvas do corpo de cada animal.
Plote o número de curvas corporais para cada animal em um gráfico de coluna, onde cada ponto representa o número de curvas do corpo em 30 segundos no eixo Y e as diferentes condições testadas no eixo X. O modelo de repetição de poliglutamina tem sido fundamental para a identificação de genes que regulam a rede proteostática. A expressão poliQ-YFP específica do músculo resulta no acúmulo de focos fluorescentes que são fáceis de quantificar sob um microscópio de dissecação fluorescente simples.
Os animais ficam paralisados durante a meia-idade, pois o proteome dentro do músculo entra em colapso devido ao efeito proteotóxico do repórter. O declínio associado à idade na proteostase neuronal pode ser seguido por quantificação direta da formação agregada e declínios em curvas corporais coordenadas após a colocação de animais em líquido. Este método tem sido usado para mostrar que o domínio homeo interagindo proteína quinase, um cofator transcricional, influencia a proteostase durante o envelhecimento, regulando a expressão de autofagia e acompanhantes moleculares.
A perda de HPK-1 aumenta o número de agregados Q35-YFP que se acumulam durante o envelhecimento. Os animais de controle apresentaram uma média de 18 agregados, enquanto os animais tratados com HPK1 e HPK1 RNAi apresentaram uma média de 28 e 26 agregados, respectivamente. No oitavo dia da idade adulta, 77 a 78% dos animais deficientes do HPK1 estavam paralisados, em comparação com apenas 50% do controle.
Além disso, a superexpressão do HPK1 foi demonstrada para regular a formação de proteínas agregadas e proteger animais envelhecidos da paralisia associada ao Q35-YFP durante o envelhecimento. Este método mede o declínio geral do proteome dentro de um tipo de célula. Existem muitos métodos para avaliar mudanças em componentes específicos da rede prostática.
Juntos, eles fornecem uma imagem abrangente. A proteostase em declínio é uma marca do envelhecimento. Essa abordagem permite que os pesquisadores quantifiquem esse declínio.
Quando combinado com a análise genética, é uma ferramenta poderosa para a descoberta.
