Peptídeos RAN são uma característica de distúrbios neurodegenerativos de expansão repetida, como a doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica e demência frontotemporal. Esses protocolos fornecem uma abordagem padronizada importante para quantificar a toxicidade do peptídeo RAN no sistema modelo C.elegans. As técnicas descritas são simples de aprender e baratas, podem ser realizadas rapidamente e aproveitam as características reprodutíveis do sistema C.elegans, como movimento e reprodução.
Ao tentar este protocolo, o maior desafio é obter toxicidade e expressão consistentes de peptídeos ran. Os principais fatores a serem controlados incluem temperatura da droga, tempo de mudanças de temperatura e preparação de placas de ensaio. É importante que os experimentadores classifiquem consistentemente os fenótipos dos animais neste ensaio de processo dependente da idade.
A demonstração visual desta técnica mostra seus critérios de classificação. Comece por derramar meio de crescimento padrão de nematoide com um IPTG milimolar e 25 microgramas por mililitro carbenicillin em placas de 24 poços. Ramal fora RNAi alimentando clones em bactérias HT115 em ágar lb carbenicilina e cultivá-los a 37 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, escolha uma única colônia em um mililitro de mídia líquida de carbenicilina LB e cresça a bactéria por 18 horas a 37 graus Celsius enquanto treme a 250 rpm. Localiza quatro poços individuais da placa NGM RNAi 24-well com 20 microliters de culturas bacterianas durante a noite, como descrito no manuscrito do texto e permita que as bactérias RNAi induzam a produção de RNA de dupla rerculação durante a noite. Use o método padrão de hipoclorito para isolar os ovos do primeiro dia de C.elegans adultos expressando o transgene de peptídeo RAN integrado.
Em seguida, semente cerca de 30 ovos em cada poço da placa de 24 poços e incubar a placa a 20 graus Celsius por sete dias. Para realizar a análise da velocidade de vídeo, adquira dois vídeos de dois poços separados para cada condição RNAi usando um microscópio de dissecação estéreo equipado com uma câmera monocromática. Certifique-se de usar configurações de aquisição consistentes entre poços.
Para cada vídeo, defina a duração por 10 segundos e o intervalo de tempo para 76 milissegundos. Defina o tempo de exposição da imagem para quatro milissegundos e use a configuração de zoom de 1,49. Em seguida, selecione dois por dois binning.
Verifique se a resolução é de 800 por 600 pixels e comece a gravar. Após a aquisição, rotule cada vídeo imediatamente com a cepa, condição RNAi e número do poço. Em seguida, meça a distância percorrida e o comprimento de cada animal para 20 animais diferentes por vídeo, examinando um total de cerca de 40 vermes para cada condição RNAi.
No software, selecione o botão de ferramentas de anotação. Em seguida, a ferramenta de texto de saque. Clique em um ponto no centro do worm sendo medido no primeiro quadro do vídeo e marque-o com um número.
Avance o vídeo até o final enquanto rastreia visualmente o worm. Em seguida, clique nele e marque-o com o próximo número correspondente. Use a ferramenta da barra de escala de saque para desenhar uma linha do primeiro número para o segundo número e registrar a distância percorrida em uma planilha.
Repita esta medição para outros 19 worms no vídeo, preservando cada medição individual na janela de análise. Uma vez que as medidas estejam concluídas, tire um instantâneo do quadro de vídeo final ilustrando todas as linhas de medição para que os dados possam ser rastreados até o animal de onde ele se originou. Em seguida, analise os dados usando uma planilha de quatro colunas onde a coluna um é o identificador de worm e a coluna dois é a velocidade.
O tempo de cada vídeo pode ser encontrado clicando com o botão direito do mouse no vídeo sob o experimento e indo para as propriedades. Para normalizar a medição de velocidade, encontre o comprimento de cada animal. Use a ferramenta de polilina de desenho para rastrear livremente os C.elegans desde a ponta da cabeça até a ponta da cauda.
Em seguida, tire uma foto do quadro de vídeo final ilustrando todas as polilinas. A duração das linhas será registrada nas estatísticas. Adicione duas colunas à planilha, uma para comprimento animal e outra para velocidade normalizada.
Finalmente, analise os dados de velocidade normalizados usando um ANOVA unidirecional com testes pós-hoc versus rnai vetor vazio. Coloque quatro a seis L4 C.elegans transgênicos expressando GFP de peptídeo RAN em uma placa GFP RNAi de seis centímetros e plante-os a 20 graus Celsius. Se o experimento estiver utilizando a RNAi para testar os efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, mova 10 adultos gravid transgênicos para cada um dos dois vetores vazios RNAi GFP RNAi ou placas RNAi específicas de genes.
Se os mutantes estão sendo usados para analisar efeitos genéticos na toxicidade do peptídeo RAN, coloque 10 animais selvagens gravid ou animais mutantes expressando o mesmo transgene RAN em cada uma das duas placas de vetor vazio RNAi ou GFP RNAi. Cresça-os a 20 graus Celsius por 48 horas. Escolha 10 conjuntos de 10 L4s transgênicos das placas RNAi e coloque cada conjunto em uma placa RNAi de três centímetros.
Certifique-se de que os vermes selecionados para o ensaio tenham motilidade superficialmente normal. Coloque as placas em um saco plástico para reter a umidade e incuba-las a 25 graus Celsius. Após 24 horas, analise os animais para mobilidade, tocando nas placas do microscópio dissecando e verificando se há movimento.
Se um verme se mover mais do que um comprimento corporal, conte-o como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de três centímetros. Use uma picareta de platina para tocar os vermes restantes na cabeça e na cauda. Se o animal se mover mais do que um comprimento corporal, conte o animal como móvel e transfira-o para uma nova placa RNAi de três centímetros.
Se a paralisia significativa não for observada no controle de vetores vazios até o segundo dia, termine o ensaio e comece de novo. Agrupar todos os vermes não-movimentos para que o movimento de mais de um comprimento corporal possa ser facilmente detectado. Conte todos os vermes paralisados, ensacados ou mortos e descarte a placa.
Continue marcando os animais para paralisia todos os dias por cinco a sete dias. O ensaio de crescimento foi utilizado para medir o efeito das inibições genéticas sobre a toxicidade dos dipeptídeos ran que são encontrados em pacientes com ELA com uma expansão repetitiva G4C2. A expressão do PR50 GFP sozinho resultou em uma prisão completa de crescimento, mas a derrubada de vários genes suprimiu a toxicidade do desenvolvimento.
O efeito de knockdowns genéticos específicos sobre a motilidade de desenvolvimento dos animais expressos pr50 foi medido utilizando-se o método de análise de velocidade de vídeo. Como esperado, a inibição da expressão PR50 GFP resultou em um grande aumento da motilidade em comparação com o vetor vazio RNAi. Além disso, o RNAi contra a subunidade proteasome RPN7 resultou no aumento significativo da motilidade PR50.
Quando os fenótipos adultos foram analisados com o ensaio de paralisia dependente da idade, PR50 GFP apresentou até 80% de paralisia por cinco dias de idade. No entanto, rnAi direcionado para o gene cul-6 paralisia significativamente retardada sugerindo que cul-6 é necessário para a toxicidade PR50 GFP. Para determinar se as proteínas RAN causam neuropatologia quando expressas em neurônios C.elegans, a toxicidade específica do neurônio foi examinada usando o ensaio de comissure.
No segundo dia, a expressão PR50 GFP nos neurônios motores levou a um aumento significativo no blebbing do neurônio motor. Esta neuropatologia foi significativamente suprimida por uma mutação no gene receptor de insulina IGF homólogo DAF-2 que atrasa as propriedades tóxicas de várias proteínas neurodegenerativas. Para o ensaio comportamental, é importante que os peptídeos RAN produzam um fenótipo altamente penetrante.
Tais genes ou drogas poderiam fornecer novos biomarcadores ou opções terapêuticas para doenças de peptídeos ran. Usando esses ensaios, realizamos uma tela RNAi em todo o genoma para supressores do peptídeo RAN proline-arginina associado C9ORF72. Os genes identificados nesta tela incluem muitos genes novos e conservados que serão objeto de futuros estudos mecanicistas.
