O autor agradece a Susan Whitfield para preparação da Hillary Samagaio e Camille Martin e figuras para assistência com alguns dos experimentos.

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens.">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Rhizobiaceae+to+plant+cells.">Attachment of Rhizobiaceae to plant cells.</a> The Rhizobiaceae. , 235-249 (1998).</li><li>Matthysse, A. 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O autor declara que ela tem sem interesses financeiros concorrentes.

É importante estar ciente de todas as superfícies, para o qual as bactérias podem aderir durante o experimento. Assim, as bactérias que são capazes de se ligar ao vidro podem ser subestimadas se a contagem de células viáveis é feitas usando pipetas e tubos de vidro. Se as plantas são cultivadas em ágar ou solo e alguns do ágar ou solo permanece nas plantas, em seguida, as bactérias podem se ligar ao material aderente ao invés de plantas. Por outro lado, lavar a superfície da planta, particularmente no caso de raízes, pode remover revestimentos superficiais naturais tais como mucosa e, assim, alterar os resultados dos testes de aderência.
É importante ter certeza de que a bactéria adicionada à mistura de incubação permanecem viva durante o experimento. Assim, contagem de células viáveis de bactérias gratuito, bem como anexadas deve ser feitas rotineiramente. Alguns tratamentos ou mutações bacterianas podem reduzir a taxa de crescimento bacteriano ou mesmo causar a morte de uma fração da população bacteriana. Bactérias vivas e mortas não podem ser distinguíveis no microscópio, a menos que as manchas especiais são usadas. Há um kit de mancha útil para viver/mortos bactérias que depende a exclusão dos corantes de bactérias vivas. No entanto, se uma população mista de espécies bacterianas está presente então, contagem de células viáveis da espécie de interesse é provável que seja o método mais fácil para determinar se a incubação resultou em morte bacteriana.
Composição média irá influenciar o crescimento e sobrevivência bacteriana. Exsudado de raiz e materiais libertado da ferida e cortar sites irão fornecer substrato para apoiar o modesto crescimento bacteriano. Fosfato, nitrogênio e ferro tendem a ser um fator limitante nessas condições. Cátions divalentes, tais como cálcio e magnésio podem influenciar a adesão. Em alguns casos a fonte de carbono pode influenciar a adesão. pH também é importante. Em geral, o pH da rizosfera é entre 5,5 e 6,5.
É preciso ter cuidado na utilização de bactérias marcadas com resistência aos antibióticos. Os antibióticos mais frequentemente utilizados são a rifampicina e ácido nalidíxico. Resistência a estes antibióticos geralmente é devido a mutações nos genes cromossômicos (RNA polimerase e girase, respectivamente) e, portanto, não podem facilmente ser transferidas para outra estirpe durante a incubação. Este tipo de resistência também não resulta na degradação ou modificação do antibiótico. Marcação de bactérias com um plasmídeo-carregadas gene marcador não é recomendado a menos que o plasmídeo não pode ser transferido para qualquer outras bactérias. A resistência aos antibióticos não deve ser devido à degradação ou químicos, modificação do antibiótico como bactérias sensíveis aos antibióticos, então será capazes de crescer em placas de antibióticas, se eles estão localizados perto de bactérias resistentes.
Os métodos descritos neste artigo são úteis para amostras pequenas e/ou experimentos onde as amostras precisam ser contidos (por exemplo, experimentos envolvendo agentes patogénicos humanos). Para tamanhos de amostra grande (acima de 100 g de material ou de mais de 50 plantas) outros métodos ou drástica modificação desses métodos seria necessário10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. a presença de um grande número de microorganismos que não a espécie a ser estudada também pode representar problemas significativos. Possíveis soluções incluem o uso de bactérias marcadas com uma proteína fluorescente ou resistência aos antibióticos, como descrito nos passos 6.1.2 e 7.3. No entanto, quando as bactérias de interesse são raros indivíduos em uma população grande de outros microorganismos estes marcadores podem não ser adequados para permitir uma avaliação objetiva dos números da bactéria em estudo.
Todos os métodos descritos aqui são métodos laboratoriais com base. Pequenas modificações seriam necessários estudos com efeito de estufa. Mais grandes modificações são susceptíveis de ser necessária para estudos de campo onde, protozoários, insetos e outra animal variação de predação e clima complicam a provisão de condições definidas para os experimentos. No futuro esses métodos podem ser ampliados para incluir as interações de dois ou mais microorganismos na superfície da planta.

A medição de vinculação bacteriana para plantar superfícies tornou-se importante em três situações diferentes. A primeira situação é o exame da transmissão de agentes patogénicos humanos na planta superfícies1,2,3. O objetivo aqui é para impedir a ligação de bactérias ou para remover ou matar as bactérias vinculadas e, portanto, para reduzir a transmissão da doença pelo material de planta. A segunda situação é o exame da ligação de patógenos vegetais para plantar superfícies4. Mais uma vez, o objetivo aqui é para impedir a ligação ou para remover ou matar as bactérias vinculadas e, portanto, para reduzir a doença. A terceira situação é o exame da ligação de bactérias simbióticas ou planta-growth-promoting5,6. O objetivo aqui é promover bacteriano vinculativo e, assim, para aumento de fitossanidade e cultura produz.
As técnicas para medir a ligação bacteriana para plantar superfícies descritas neste artigo são baratos e relativamente fáceis de realizar. Os únicos requisitos são um microscópio e materiais encontrados geralmente em um laboratório de bacteriologia. Para algumas técnicas um sonicador de banho é útil. As técnicas descritas são projetadas para experiências realizadas usando tamanhos de amostra relativamente pequeno de vinculação. Medições de vinculação são feitas em laboratório, embora seja possível modificar algumas dessas técnicas para o uso na estufa ou no campo.
Estas técnicas têm sido utilizadas para medir a ligação bacteriana de raízes, brotos, folhas cortadas, frutas cortadas e tomatinhos intactos na laboratório7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Tem também sido costumavam medir a colonização de raiz de plantas que crescem no solo ou areia no laboratório16. As técnicas têm sido utilizadas com muitas espécies bacterianas, incluindo Agrobacterium tumefaciens, tem Sinorhizobium, Escherichia coli, Salmonella typhi e Pseudomonas fluorescens. Uma descrição útil de métodos para avaliar a interação da . tumefaciens com superfícies pode ser encontrada em Morton e Fuqua (2012)17. Em todos os casos as dimensões das amostras envolvidas eram pequenas, geralmente menos do que 25-50 plantas. As técnicas descritas são adequadas para uso com agentes patogénicos humanos que precisam ser mantidos contido durante os experimentos.

<table><tbody><tr><td>light microscope</td><td>any</td><td>N/A</td><td>phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td></tr><tr><td>seeds</td><td>any&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>make a note of the seed lot number and the cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>nutrient agar&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>sea sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sand</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrigfuge</td><td>any scientific company</td><td>N/A</td><td>to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>any scientific company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter counting cell</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatin chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>naladixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Este manuscrito descreve um método para medir a ligação bacteriana às superfícies da planta axénica no microscópio de luz e através do uso de contagem de células viáveis. Materiais vegetais usados incluem raízes, brotos, folhas e cortar frutas. Os métodos descritos são de baixo custo, fácil e adequado para amostras pequenas. Vinculação é medida em laboratório e uma variedade de condições e meios de incubação pode ser usada. O efeito de inibidores pode ser determinado. Situações que promovem e inibem a ligação também podem ser avaliadas. Em alguns casos é possível distinguir-se várias condições alteram ligação principalmente devido aos seus efeitos na planta ou sobre as bactérias.

A. tumefaciens coloniza as superfícies da raiz. A fim de determinar se a produção bacteriana da celulose desempenha um papel na colonização de raiz, os efeitos de mutações de bactérias que impedem a síntese de celulose foram examinadas16. Foram utilizadas as técnicas descritas em etapas 1.3 e 7.1. Sementes de tomate foram superfície esterilizada e germinadas em água estéril. Quando as raízes estavam cerca de 2 cm de comprimento foram mergulhadas em uma suspensão de 105 bactérias / mL e plantadas em solo pasteurizado em recipientes. As plantas foram cultivadas por 14 dias a 25 ° C num ciclo escuro h luz/12 de 12 h. Depois que as vezes as plantas indicadas foram removidas dos recipientes. As raízes foram lavadas e lisadas em um sonicador de banho para remover as bactérias acopladas. Bacterianos números foram determinados usando a contagem de células viáveis. A Figura 2 mostra o efeito das mutações de celulose-menos dois diferentes sobre a capacidade das bactérias para colonizar raízes de tomate. Embora os desvios-padrão de algumas medidas foram tão alto quanto 0.9 log10 (um problema comum com este tipo de medida) a redução na ligação da celulose-menos mutantes é claramente evidente e podemos concluir que a produção bacteriana de celulose auxilia as bactérias na colonização de raízes de tomate.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Raiz de colonização por tipo selvagem e mutantes de celulose-menos da . tumefaciens. Log10 número total de bactérias por cm de comprimento de raiz recuperado de raízes de tomate inoculadas com estirpe de tipo selvagem a. tumefaciens C58 e celulose-menos mutantes, C58:1 e C58:A60. Os números mostrados são os meios de um mínimo de quatro experimentos separados. As barras indicam desvios-padrão dos meios. As raízes foram inoculadas mergulhando-os em uma suspensão de 105 bactérias / mL para um minuto. As plantas foram cultivadas em recipientes e as bactérias frouxamente aderentes foram removidas lavando as raízes no buffer em um frasco de vidro de lavagem. Firmemente aderentes bactérias foram removidas usando um sonicador de banho e a suspensão resultante chapeado para determinar a célula viável conta16. Esta figura foi modificada de Matthysse e McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Analisou-se o papel de exopolissacarídeo na ligação de e. coli e outras bactérias de brotos de alfafa. Alguns surtos de doenças diarreicas devido a e. coli O157: H7 têm sido rastreados para brotos de alfafa contaminada. Ligação das bactérias do tipo selvagem e mutantes incapazes de fazer vários exopolissacarídeo foi medida usando os métodos descritos nas etapas 1.1, 5.1 e 7.2. Rebentos de alfafa foram superfície esterilizada e germinadas por um dia em água estéril a 25 ° C, no escuro. Quatro brotos com os revestimentos de semente anexados foram colocados em pratos de plástico estéril contendo 5 mL de água. Bactérias cultivadas em caldo Luria foram adicionadas a uma concentração final de aproximadamente 5 x 103 / mL. Os brotos inoculados foram incubados a 25 ° C, no escuro por 3 dias. Os brotos foram lavados duas vezes em 5 mL de água estéril em um frasco por inversão vigorosa e homogeneizados no buffer usando um homogeneizador de vidro do Teflon motorizado de lavagem. Experiências anteriores usando bactérias marcado com um plasmídeo que carreg o gene GFP não mostrou nenhuma bactéria interiorizada embora superfície bactérias observaram-se facilmente. Os resultados são mostrados na tabela 1. Foram examinadas duas estirpes de Escherichia coli O157: H7. Em ambas as cepas a produção de acid(PGA) poli-β-1,6-glucurônico apareceu para fazer a maior contribuição para a ligação de patogênicas Escherichia coli para plantar superfícies. Ácido do cólon também desempenhou um papel significativo na ligação. Enquanto a redução da ligação em celulose-menos mutantes foi significativa não era tão grande como para os outros dois polissacarídeos.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Efeitos das mutações nos Genes de produção de exopolissacarídeo na vinculação de E. coli O157: H7 de brotos e revestimentos de semente abertos</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Estirpe bacteriana</td>
			<td rowspan="2">Mutação ou genótipo (fenótipo relevante)</td>
			<td colspan="2">10 número de bactérias vinculado por broto ou semente casaco de log</td>
		</tr>
<tr>
<td>B de brotos de alfafa
</td>
			<td>Revestimentos de semente abertos</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Nenhum (tipo selvagem)</td>
			<td>4,7 ± 0,6</td>
			<td>5,6 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (celulose-subtração)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0,6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (menos ácido do cólon)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-subtração)</td>
			<td>< 1,0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Nenhum (tipo selvagem)</td>
			<td>5,6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (celulose-subtração)</td>
			<td>de 4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4.1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (menos ácido do cólon)</td>
			<td>3,9 ± 0.5c
</td>
			<td>de 4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-subtração)</td>
			<td>< 1,0c
</td>
			<td>1.2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">média ± desvio padrão de um mínimo de três medições do número de bactérias (log10) vinculado depois de 3 dias.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b brotos foram lavados antes da medição.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente diferente do tipo selvagem: P < 0,01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente diferente do tipo selvagem: P < 0,05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: efeitos das mutações nos genes de produção de exopolissacarídeo na ligação de Escherichia coli O157: H7 de brotos. A fim de determinar o papel de vários exopolissacarídeo e lipopolissacarídeo na ligação de patogenicidade estirpes de Escherichia coli O157: H7 de brotos de alfafa, a vinculação de um conjunto de mutantes para os brotos e revestimentos de semente abertos foi examinado usando os métodos descrito na etapa 6. Os resultados mostraram que poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) parece ser essencial para a ligação com as couves e esse ácido tanto celulose e colanic são necessários para ligação máxima de Escherichia coli O157. Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
A fim de determinar se a produção de PGA é suficiente para causar ligação bacteriana plantar superfícies, um plasmídeo (pMM11) carregando o operon clonado codificação os genes necessários para PGA produção foi introduzida em duas bactérias diferentes que não Normalmente, seria capaz de ligar a tomate raízes10. A. tumefaciens A1045 é um mutante da estirpe selvagem tipo C58 que não efectuar cíclico-1,2-β-glucan e também falha ao ligar para plantar superfícies29. Sinorhizobium tem 1021 que forma nódulos na alfafa falha ao ligar para não-leguminosas incluindo tomate12. As técnicas descritas em etapas 1.1, 5.1, 7.1 e 6.3 foram usadas para determinar se a capacidade de fazer PGA geralmente maior vinculação bacteriana às superfícies de raiz. Sementes de tomate foram superfície esterilizada e germinadas em água estéril. As raízes foram cortadas em segmentos de 1 cm de comprimento e colocadas em água estéril e as bactérias foram vacinadas. Como estas duas espécies de bactérias crescem em ritmos diferentes, vinculação foi medida em momentos diferentes para permitir quantidades aproximadamente iguais de crescimento bacteriano. A presença de pMM11 o plasmídeo causada semelhante aumento significativo no número de bactérias limite de ambas as espécies (tabela 2)10. Um aumento significativo na ligação também foi visto no microscópio de luz, mas a ligação era muito diferente para as duas espécies (Figura 3). A. tumefaciens A1045 associadas como bactérias individuais para a superfície da raiz. S. tem ligado em grandes aglomerados em que somente algumas das bactérias eram conectadas diretamente à raiz, e a maioria das bactérias foram anexada a outras bactérias. Este exemplo mostra que simplesmente analisar os números de bactérias vinculados sem incluir observações microscópicas pode dar uma ideia errada dos resultados de um experimento. Embora ambos os métodos (contagem de células viáveis e observações microscópicas) mostram que pMM11 aumentou bacteriana ligação às raízes de tomate, o tipo de ligação causada pela produção de PGA foi diferente para as duas espécies bacterianas10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">O efeito da pMM11 plasmídeo sobre a ligação de bactérias às raízes de tomate</td>
		</tr>
<tr>
<td>Estirpe bacteriana</td>
			<td>Plasmídeo</td>
			<td>Limite de número de bactérias por mm de comprimento de raiz</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045um
</td>
			<td>nenhum</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntese de PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. tem 1021b
</td>
			<td>nenhum</td>
			<td>Não detectado</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vector)</td>
			<td>Não detectado</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (síntese de PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">uma associação bacteriana foi medida após 2 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b ligação bacteriana foi medida após 18 horas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: O efeito de um plasmídeo carregando os genes para a síntese de PGA na ligação de A. tumefaciens A1045 e S. tem 1021 para segmentos de raiz de tomate. A fim de examinar a capacidade de poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) para promover a ligação de bactérias para plantar raízes, o efeito de um plasmídeo confere a capacidade de fazer PGA (pMM11) na ligação de duas cepas de bactérias associadas a planta para raízes de tomate foi examinado. Nem cepa de bactérias mostrou significativa ligação às raízes de tomate na ausência do plasmídeo ou na presença do plasmídeo sem os genes que codificam a síntese de PGA (pBBR1mcs). A adição do plasmídeo com genes de síntese PGA aumentou a vinculação por ambos os tipos de bactérias. Porque a. tumefaciens cresce mais rápido do que o S. tem ligação foi medida após 2 h de incubação para a. tumefaciens e após 18 h para S. tem. As técnicas utilizadas são as descritas na etapa 7. Esta tabela foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : O efeito da pMM11 plasmídeo carregando os genes de biossíntese de PGA na ligação da . tumefaciens A1045 e S. tem 1021 para cabelos de raiz tomate. Ligação para cabelos de raiz de tomate da) a. tumefaciens A1045, B) pMM11 a. tumefaciens A1045, C) tem S. 1021 e D) tem S. 1021 pMM11. Embora o aumento da vinculação das duas espécies bacterianas é mais ou menos semelhante os detalhes da ligação como visto no microscópio luz são completamente diferentes. As técnicas utilizadas são as descritas na etapa 6. Esta figura foi modificada de Matthysse, Deora, Mishra e Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Às vezes é possível usar a ligação de superfícies não-biológicos para auxiliar na distinção entre a contribuição das bactérias e da planta em uma interação específica. O polysaccharide(UPP) unipolar da . tumefaciens tem demonstrado ser capaz de mediar bacteriana vinculação a uma variedade de ambas as superfícies biológicos e não biológicos30. Cálcio, observou-se inibir a ligação da a. tumefaciens plantar superfícies mediadas por UPP28. A fim de determinar se a inibição por íons de cálcio da vinculação bacteriana para plantar superfícies é devido a um efeito sobre as bactérias ou sobre a superfície da planta, analisou-se a vinculação das bactérias de fios de nylon. As técnicas se descreve no passo 8.2 foram usados. Sementes de tomate foram superfície esterilizada e germinadas em água conforme descrito na etapa 1. As bactérias foram cultivadas em meio mínimo com sacarose e adicionadas a raízes de tomate ou fios de nylon em uma concentração final de aproximadamente 105/mL, conforme descrito na etapa 5.1. O efeito da adição de CaCl2 sobre vinculação bacteriana a raízes de tomate e fios de nylon foi examinado no microscópio. A Figura 4 mostra uma semelhante inibição da ligação de cálcio usando qualquer superfície sugerindo que o efeito do cálcio é principalmente sobre as bactérias10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : O efeito do cálcio na ligação da . tumefaciens para cabelos de raiz de tomate e fios de nylon. A. tumefaciens foi incubada com raízes de tomate (A e B) ou fios de nylon (C e D) por 24 h em um 01:10 diluição dos sais de MS e um 01:20 diluição do meio mínimo AB, 0,4% de sacarose (A e C) ou em um 01:10 diluição dos sais de MS e 01:20 diluição do meio mínimo AB , 0,4% de sacarose que contém 60 mM CaCl2 (B e D)31. O adicionado CaCl2 inibiu bacteriana vinculação a raízes e fios de nylon, sugerindo que a inibição foi principalmente devido a um efeito sobre as bactérias, e não sobre a superfície da planta. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Um método fácil para medir e caracterizar adesão bacteriana em plantas, principalmente raízes e brotos, é descrito neste artigo.

Aderência de bactérias para plantar superfícies medidas em laboratório

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K visualizações.  University of North Carolina at Chapel Hill. Um método fácil para medir e caracterizar adesão bacteriana em plantas, principalmente raízes e brotos, é descrito neste artigo.

Vídeo: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Ensaio in vitro da adesão bacteriana em mamíferos Células Epiteliais

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Imunologia e Infecção

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Engenharia bactérias aderentes pela criação de um único sintético Curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioengenharia

Detecção de colonização por rizobactérias em Arabidopsis thaliana

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Autor em destaque: Aumentando a colonização de rizobactérias nas raízes das plantas para melhorar a eficiência do fertilizante microbiano

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

Medindo a colonização bacteriana em raízes de Arabidopsis thaliana em condição hidropônica

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Ambiente

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

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Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

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Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily composed of multiple copies of the major fimbrial subunit FimA. FimH adhesin, however, is present as a fibrillar tip structure that drive bacteria binding to host cellular mannose containing receptor. Here, we provide protocols to evaluate and compare the function of type 1 fimbrial subunits in F18ab fimbriae+ Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). We found that both FimA and FimH are required for bacterial adhesion, invasion, and biofilm formation. Deleting fimA gene showed much more reduction in bacterial adhesion and invasion to porcine intestinal columnar epithelial cells IPEC-J2, than that of fimH mutant. Biofilm formation was significantly reduced in both mutants with an equal level. In addition, qPCR demonstrated that either fimA or fimH deletion down-regulated the bacterial flagella and F18 fimbriae genes expression, while up-regulated adhesin was involved in diffuse adherence-I (AIDA-I) gene expression, suggesting the co-regulation of cell surface-localized adhesins in F18ab fimbriae+ STEC.

<meta charset="utf8"></head><body>Uso de bastonete fimbrial para fímbrias F18ab + colonização STEC em células hospedeiras

Here we present a protocol to study the function of fimbriae in bacterial colonization.

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