A automação de microscópios de força atômica é uma inovação fundamental na evolução da tecnologia para aplicações biomédicas. Também abre o acesso à investigação das propriedades biomecânicas das populações celulares. Nosso método permite gravar medições de AFM para 1.000 células em quatro horas, em comparação com os métodos usuais, que levam quatro horas para medir 10 células, este é realmente um ganho significativo de tempo.
Se a automação é um pré-requisito para trazer essa tecnologia para laboratórios hospitalares, esse protocolo de prova de conceito sugere seu potencial de uso no desenvolvimento de estratégias específicas de diagnóstico médico. Este protocolo usa uma haste PDMS versátil que pode ser preenchida com vários micróbios permitindo que diferentes sistemas sejam explorados. Para preparar o selo PDMS, misture 55 gramas de solução pré-polímero PDMS a uma relação de massa de 10 para um em PDMs, oligômeros e agente de cura e degas a solução resultante sob vácuo em uma vez 10 para o negativo de uma a uma vezes 10 para as duas barras negativas por cinco a 10 minutos.
Quando todas as bolhas de armadilhas tiverem sido removidas, despeje 20 gramas da solução desgaseada em um molde mestre de silício para uma espessura de dois a três milímetros e degas novamente. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, reticule o PDMS a 80 graus Celsius por uma hora e use um bisturi para cortar o selo micro estruturado PDMS paralelo às matrizes de microestrutura visível. Em seguida, retire o carimbo do molde mestre de silício e coloque o local da microestrutura de selo em um escorregador de vidro com as micro estruturas alinhadas com o lado do slide.
Para preparar as células para o dispositivo, centrífugas 600 microliters da suspensão celular de interesse e adicionar 200 microliters do supernatante ao selo. Degas o supernatante sob vácuo por cerca de 40 minutos. Quando todas as bolhas tiverem sido removidas, substitua o supernascer da superfície PDMS por 200 microliters da solução celular resuspended para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.
Para carregar as células nas micro estruturas do selo, use um slide de vidro mantido em um ângulo de 30 a 50 graus para espalhar as células através do selo em ambas as direções, várias vezes conforme necessário. Quando uma alta taxa de enchimento das microestruturas for alcançada, use uma pipeta para remover a suspensão celular e lave as três vezes com um mililitro de tampão de acetato por lavagem para remover quaisquer células não arrastadas. Após a última lavagem, use o fluxo de nitrogênio para secar a parte de trás da amostra e coloque o carimbo em uma placa de Petri.
Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de acetato fresco ao prato. Para microscopia de força atômica das células, coloque o prato no estágio do microscópio de força atômica e centralizar o palco de zero a zero. Quando o palco estiver centrado, mova a placa para o suporte da placa de Petri do microscópio e alinhe a borda do selo para que seja perpendicular ao eixo y do suporte da placa de Petri.
Em seguida, coloque a força do microscópio atômico de cabeça para o palco, tomando cuidado para que os motores do estepe sejam suficientemente estendidos para evitar que a ponta caia sobre o selo. Para imagens, use os botões do microscópio para centralizar a ponta do microscópio de força atômica sobre o canto esquerdo dos poços de micrometro quadrado 4,5 por 4,5 e selecione o modo de mapeamento de força no software do microscópio. Para definir um mapa de força de 64 por 64 sobre uma área de 100 por 100 micrômetros, ajuste o ponto de ajuste relativo para três a cinco nano Newtons, o comprimento Z para quatro micrômetros, o movimento Z para a duração constante, o tempo de extensão para 0,01 segundos, o atraso de extensão a zero, o atraso para zero, o modo de atraso para a força constante , a taxa amostral para 2048 Hertz.
Desmarque o laço fechado Z e verifique a imagem quadrada. Defina o acesso rápido a 100 micrômetros, o eixo lento para 100 micrômetros, o X deslocado para zero micrômetros, o Y deslocado para zero micrômetros, o ângulo da grade para zero graus, os pixels para 64 por 64, e a proporção de pixels para um para um. Em seguida, abra o software de automação.
Na janela pop-up, selecione o caminho para o arquivo de script. Digite a coordenada W1 na linha variável P1 239 da seção caixa de entradas do script gyfon e o valor de coordenada W2 na linha variável P2 241. Atribua o valor do tom à linha variável de tom 245 do script e insira a dimensão do poço, que pode ser determinada a partir do desenho dos padrões do poço para a linha variável W-S 248.
Escreva caminho para o diretório de salvamento na linha 251 para salvar os dados no local desejado e definir a linha variável de área total 254 para o desejo de várias extremidades dos 100 micrômetros. Em seguida, defina a linha de matriz das curvas de força e a coluna registradas por poço na linha variável 257 e clique em execução para iniciar o programa. Para analisar os dados, use o software de código do estúdio de vídeo para abrir o script Python e executar os arquivos de cópia do script Python para organizar os arquivos de curva de força em uma pasta.
Insira o caminho para a pasta geral onde os dados serão armazenados. para analisar as curvas de força, abrir o software de processamento de dados do fabricante de microscópio de força atômica. No menu de arquivos, selecione o lote de curvas de espectroscopia.
Selecione o processo de arquivo e carga e selecione o processo de rigidez. Selecione a última etapa do processo e clique em manter e aplicar a todos para que todas as curvas de força recebam o mesmo tratamento. Para abrir o script R, carregue os arquivos contendo as informações extraídas com o software de processamento de dados no software do estúdio R.
Na janela do ambiente, clique em importar conjunto de dados e, do leitor de texto na janela pop-up, clique em procurar para localizar o arquivo ponto TSV. Uma vez que o arquivo tenha carregado, selecione a região de execução de código e execute tudo para executar todo o código. Aqui, histogramas típicos obtidos usando o protocolo como demonstrado são mostrados.
Nesta análise, a repartição da rigidez foi registrada em 957 células nativas, enquanto nesta análise, foi medida a rigidez de 574 células tratadas caspofungin. Saiba que o uso de centenas de células permite que uma distribuição bimodal dos valores seja observada. Em amostras menores, uma única distribuição é tipicamente observada e pode resultar em falta de observação da heterogeneidade populacional.
Uma comparação das duas condições destaca os efeitos do Caspofungin na redução da rigidez celular. Reveladas pela comparação ANOVA das células nativas e tratadas, as duas condições apresentam rigidezs altamente, significativamente diferentes. Esse valor foi alcançado devido ao grande número de células analisadas, proporcionando maior confiança nos resultados obtidos.
Adicionar o supernante ao selo PDMS antes de jogar repetidamente as células nos poços até que o selo esteja cheio, é fundamental para o sucesso da análise. Nesta prova de conceito, foram analisadas células de candida albicans, mas o protocolo pode ser aplicado a qualquer grupo de células padrão, moléculas ou materiais.
