Nosso protocolo fornece métodos alternativos para identificação e caracterização de fatores de acolhimento viral, nucleolar e não nucleolar que mantêm o ciclo infeccioso do HIV-1. Os conceitos utilizados nesta abordagem são aplicáveis a outros modelos virais e de doenças que requerem a caracterização de caminhos subestudados. Técnicas de solução de problemas são descritas para modificação em outros modelos de proteínas.
Demonstrando o procedimento estarão Haitang Li e Pritsana Chomchan, cientistas do Departamento de Biologia Molecular e Celular do Instituto de Pesquisa Beckman na Cidade da Esperança, e Roger Moore, membros do Núcleo de Proteômica da Cidade da Esperança e do Departamento de Imunologia Molecular. Comece cultivando uma cultura de linha celular HeLa em três placas de cultura de 100 milímetros para uma densidade de duas vezes 10 a 6 células por mililitro. Quando as células atingirem a concentração apropriada, misture 20 microgramas de plasmídeo contendo o sinal de localização nucleolar Rev de três primes de interesse com 1,76 mililitros de TE 79/10 em um tubo de 15 mililitros, seguido pela adição de 240 microliters de cloreto de cálcio de dois molares, com mistura completa.
Em seguida, transfira o conteúdo do tubo dropwise para um novo tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de HBS 2x, seguido de mistura em uma máquina de vórtice. Depois de 30 minutos em temperatura ambiente, vórtice a precipitação. Adicione um mililitro da suspensão em gota a cada uma das três placas de cultura HLfB de 100 milímetros enquanto gira suavemente o meio.
Após uma incubação de seis horas na incubadora de cultura celular, substitua a mistura de transfecção por 10 mililitros de meio de cultura fresca, e devolva as células à incubadora por mais 42 horas. 48 horas após a transfecção, coloque cada placa em um leito de gelo dentro de uma capa de cultura de tecido de nível dois. Remova a mídia de cultura celular e enxágue suavemente as células com 10 mililitros de PBS pré-chilled, sem interromper as camadas celulares.
Descarte o PBS depois de enxaguar as células. Em seguida, trate as células com um mililitro de tampão de lise, complementado com coquetel inibidor de protease, por placa. Inclinando as placas para recolher as células em uma piscina, use um raspador de células para interromper manualmente as camadas.
Usando uma micropipette de 1.000 microliter, acumule o lysate de cada placa em um tubo pré-15 mililitro para uma incubação de 15 minutos no gelo, com vórtice a cada cinco minutos. No final da incubação, alíquota os lisatos em três tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro e coleta os lisatos por centrifugação. Transfira o supernante para um novo tubo de 15 mililitros, e obtenha a concentração de proteína viral, como descrito no manuscrito.
Para a coimmunoprecipitação do sinal de localização nucleolar Rev três-prime bandeira, enxágue 25 microliters de contas de gel de afinidade M2 três vezes com 500 microliters de tampão de lise fresca, complementado com coquetel inibidor de protease, por lavagem. Realize essas etapas em uma sala fria ou com os reagentes no gelo. Após a última lavagem, adicione uma concentração de um miligrama por mililitro de proteína viral lysate às contas enxaguadas em um volume final de cinco mililitros de tampão de lise.
Incubar a reação por três horas a quatro graus Celsius com rotação. No final da incubação, pelota as contas de proteína viral conjugadas por centrifugação. Colete o supernante para medição da concentração de proteína de lise pós-imunoprecipitação.
Consulte o manuscrito para obter instruções de armazenamento de amostras. Adicione 750 microliters de tampão de lise ao pellet de contas conjugado de proteína viral, transfira as contas em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro e lave as contas em um rotador por cinco minutos a quatro graus Celsius. Colete as contas por centrifugação para mais duas lavagens no rotador, como apenas demonstrado.
Após a última lavagem, use uma ponta de carregamento de gel beliscada, longa e resistente para remover quaisquer traços de tampão de lise do complexo de moria-coimmununoprecipitação. Resuspenja as contas em 55 microliters de tampão de carregamento 2x. Em seguida, ferva a amostra a 95 graus Celsius por 10 minutos.
Carregue 25 microliters de elunato em um gel de mancha ocidental e um gel de mancha SDS-PAGE de coloração Coomassie. Após a conclusão da eletroforese de gel SDS-PAGE, enxágue o gel três vezes em 25 mililitros de água ultrapura por 15 minutos. Após a última lavagem, adicione 100 mililitros de reagente de mancha coomassie no gel.
Veja o manuscrito para o protocolo completo de coloração. Para a digestão das bandas de gel, primeiro use uma lâmina de barbear limpa para cortar as faixas de gel de toda a faixa do gel, representando cada mutação, em cubos de aproximadamente cinco milímetros. Coloque cada banda em um tubo de microcentrífuga limpo de 0,5 mililitro.
Cubra as bandas duas vezes com bicarbonato de amônio de 100 milimônios em uma solução de acetonitrilo-água de um para um a temperatura ambiente por 15 minutos por lavagem. Em seguida, seque as peças de gel por cinco minutos em uma centrífuga a vácuo. Para reduzir as proteínas, cubra as peças de gel seco com dithiothiothreitol de 10 milimônio em 100 milimolar de amônio bicarbonato para uma incubação de uma hora a 56 graus Celsius, seguido de alquilação em iodoacetamida de 100 milimolares na água por uma hora à temperatura ambiente no escuro.
Em seguida, encolher e reswell as peças de gel duas vezes com acetonitrilo, seguido por 100 milimônios bicarbonato de amônio, ambos com agitação suave à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a segunda reswelling, seque as peças de gel por cinco minutos em uma centrífuga a vácuo. Inchar as peças de gel com 50 nanogramas por microliter de trippsina modificada de grau sequenciamento em 100 milimônios bicarbonato.
Após cinco minutos, cubra as peças de gel com bicarbonato de amônio de 100 mililitros, e permita que elas recuem completamente, adicionando bicarbonato adicional de amônio de 100 mililamlares para que as peças de gel inchadas estejam completamente cobertas. Em seguida, incubar as peças de gel durante a noite a 37 graus Celsius, parando a reação com 1/10 do volume das amostras com ácido 10% fórmico na água na manhã seguinte, e coletar o sobrenante de cada tubo. O sinal de localização nucleolar rev de três primes é detectável sob três condições diferentes de tampão de lise contendo várias concentrações de cloreto de sódio.
B23 também é detectável no tampão de lise contendo a menor concentração de sal, mal detectável no tampão de lise contendo a concentração média de sal, e indetectável no tampão de lise contendo uma alta concentração de sal. A detecção de B23 é ótima no tampão de lise contendo a baixa concentração de cloreto de sódio com bandeira de três primes rev tipo selvagem e perde afinidade com o sinal de localização nucleolar Rev M1 de três primes. A afinidade B23 com a bandeira de três primes rev tipo selvagem também diminui com uma maior concentração de sal, e o controle negativo do PCDNA não produz imunodeseção inespecífica após a imunoprecipitação em ambas as condições de tampão de lise.
O sinal de localização nucleolar rev três prime é mais detectável após a elução através da ebulição em buffer de carregamento de amostra de 2x, enquanto b23 é detectável sob as condições de incubação de buffer de amostra Celsius de 37 e 95 graus. Após a imunoprecipitação e a coloração de prata, como demonstrado, os sinais de localização nucleolar do tipo selvagem Rev e Rev M2, M6 e M9 são detectáveis a 18 kilodaltons. Bandas correspondentes à proteína B23 também são observadas no marcador de 37 quilodalton.
A coloração com reagente Coomassie demonstra ainda mais a detectabilidade do sinal de localização nucleolar Rev de três primes na presença e ausência de mutações em 18 kilodaltons. Use quantos controles, positivos e negativos, necessários para referências relativas ao seu modelo de doença durante o processo de solução de problemas e triagem para potenciais fatores de ligação. Toda a exclusão e mutações de ponto único podem ser examinadas para atividade dominante-negativa através da multimerização com rev tipo selvagem e utilizadas na prisão da replicação do HIV-1.
