We thank Emily Mace and Malini Mukherjee for imaging and deconvolution analysis. Work in the Liu laboratory was supported in part by the Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant number AI36211 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, the Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, Texas Children&#8217;s Hospital Pediatric Pilot Research Fund, and the Lymphoma SPORE Developmental Research Program from Baylor College of Medicine and the Methodist Research Institute.

1. Preparação de lipossomas <ol><li> Calcular a quantidade de soluções de reserva de clorofórmio-suspenso de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-biotinil tampa (Biotina-PE) as existências diluídas para a concentração final desejada. Para perfazer concentrações finais de 400 uM e 80 uM de DOPC fosfolípidos Biotina-PE com 10 ml de cada vez, começar por colocar 629 ul de 10 mg / ml de DOPC e 88 uL de 10 mg / ml de biotina-PE em tubos de cromatografia de vidro separados. NOTA: é importante para limpar vidro seringas Hamilton e tubos de cromatografia de vidro por solução (1 L de etanol a 95% e 120 ml de água contendo hidróxido de potássio 60 g, KOH) a limpeza, durante a transferência de solução estoque suspensa-clorofórmio de DOPC e Biotina-PE. </li><li> Seca-se o clorofórmio com uma corrente de árgon no capuz química. Fechar o tubo de cromatografia por parafilm. </li><li> Submeter os lipossomas recentemente secos a alto vácuo num lyophilizer O / N para remover qualquer clorofórmio residual. Para a conclusão do mesmo dia, secar por 60-90 min. </li><li> Enquanto os funcionamentos liofilizador, preparar alguns tampão de diluição. Para este protocolo, preparar 25 ml consistindo em Tris 25 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM; e 2% (em peso) de n-octil-β-D-glucopiranósido (OG) detergente. Misturar os dois primeiros ingredientes juntos em primeiro lugar, em seguida, deslocar o oxigénio com árgon antes de se adicionar o pó seco OG. Após a preparação, filtrar a solução com OG membrana de acetato de celulose de 0,2 micra, e armazenar a 4 ° C. </li><li> Além disso, preparar duas garrafas com tampa de rosca de 1 L de tampão Tris-salino, nas mesmas concentrações, mas sem OG. Colocar uma barra de agitação magnética limpos em água destilada na parte inferior de cada um. Prepare 6 litros adicionais de tampão Tris-salino. Remover o oxigénio a partir de todos os frascos com árgon e colocá-los a 4 ° C, bem. </li><li> Após liofilização, dissolver os lípidos secos no tampão de Tris-OG salina para fazer uma solução 4 mM de cada. Seguindo o exemplovolumes, adicionar 2 ml para o tubo de DOPC e 0,2 ml para o tubo de Biotina-PE. </li><li> Misture os lipídios biotina-PE com os lipídios DOPC. Isto melhora a mobilidade do SLB, como a biotina acoplado pode prejudicar a fluidez dos grupos de cabeça fosfato. Para fazer uma concentração final de 80 uM de biotina-PE, misturar 0,2 mL de 4 mM de biotina-PE e 1 ml de DOPC 4 mM. Em seguida, adicionar 8,8 ml de tampão Tris-salino OG. </li><li> Para uma concentração final de 400 uM de DOPC, simplesmente misturar 1 ml de DOPC 4 mM, com 9 ml de solução salina Tris-OG. </li><li> Encher o sonicador com água gelada. Colocar o tubo de vidro contendo o fosfolípido diluída no centro do sonicador usando uma braçadeira utilidade. Sonicar o fosfolípido diluídos durante 10 min até que a solução se torne clara. NOTA: Adicione o gelo no banho de água sonicador para manter a temperatura baixa, uma vez sonicação irá gerar calor. </li><li> Preencha os tubos com argônio para deslocar o oxigênio do ar acima do líquido, e feche-os com parafilme. </li></ol&gt; 2. Lipossomas de diálise <ol><li> Cortar duas secções de tubo de diálise seca (Peso molecular de corte: 12-14,000, diâmetro: 6,4 milímetros) com o comprimento adequado (neste exemplo, 40 cm), um para cada diluição de fosfolípido, a partir do rolo. </li><li> Re-hidratar as secções de tubos, permitindo-lhes absorver em 200 ml de água destilada numa proveta de vidro durante 2 min. </li><li> Microondas este durante 5 minutos a uma regulação alta, ou, pelo menos, até a água começar a ferver. </li><li> Dê um nó em uma extremidade de cada tubo e lavar o interior com alguns mililitros de tampão Tris-salino-OG. Depois disso, meticulosamente espremer o máximo deste tampão de lavagem possível para minimizar a quantidade de tampão restante no interior. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar, adicionar os fosfolípidos diluído para cada tubo e prender as extremidades abertas com um pequeno fecho do tubo de diálise, de modo a excluir todo o ar. Exclusão completa do ar vai requerer o sacrifício de um pequeno volume da amostra por aperto abaixo do &amp;# 8220; linha de água &quot;. </li><li> Mergulhar as amostras previamente preparadas nas garrafas de tampão Tris-salino, sem OG. Deslocar oxigênio na garrafa com árgon antes de voltar a vedação e lugar para agitar O / N em 4 °. </li><li> Transferir a tubagem para um novo frasco de tampão Tris-salino, sem OG cada 12 horas durante pelo menos 3 vezes. </li><li> Pouco tempo antes da remoção dos lípidos dialisados, preparar um número de pequenos tubos em que a aliquotar os lípidos, preenchendo cada um com árgon para deslocar o oxigénio. </li><li> Após 36 h, tomar as garrafas de diálise para a capela de fluxo laminar e remover os tubos de diálise das garrafas. Tenha uma fralda banco ou copo na mão para recolher o escoamento molhado. </li><li> Corte o tubo de diálise acima do clipe, em seguida, remover o clipe e transferir cuidadosamente a solução lipídica dialisados ​​via pipeta em alíquotas de 1 ml em tubos pré-preparados preenchidos com gás argônio no gelo. </li><li> Alíquota da solução aquosa de lipossomas, usar o fluxo de argônio para deslocar o oxigênio novamente in cada tubo. </li><li> Armazenar os lipossomas a 4 ° C. Não congelar. </li></ol> 3. Determinação da Densidade de anticorpos na bicamada lipídica <ol><li> Prepara-se uma série de diluições de biotinilado, o anticorpo marcado fluorescentemente, 50 uL de volume para cada diluição, nas seguintes concentrações: 0 nM (em branco), 10 nM, 50 nM, 100 nM e 500 nM. (Doravante referida como &quot;série de amostras&quot;). </li><li> Adicionar 1 ml de esferas de sílica em 6 poços de uma placa de 96 poços de fundo em V. Certifique-se de apertar as contas bem antes de pipetagem, como eles tendem a se estabelecer. NOTA: Se o mandante pérolas secas em vez de suspenso, siga as instruções do fabricante para diluir. </li><li> Para estas contas, adicionar 2 mL de DOPC mista: fosfolipídios biotinil na proporção de 1: 1. Faça isso para cada poço. </li><li> Pulso a placa em um agitador em força média 3 vezes por 10 segundos cada para incentivar a interação com as contas e os fosfolipídeos. </li><li> Adicionar 150 ul de 5% casein a cada poço. Misture bem por pipetagem cima e para baixo três vezes. </li><li> Deixe a placa incubar na solução de caseína durante 10 min, em seguida, lavá-lo para fora. Para lavar, encher cada poço para um volume total de 250 ul com solução salina tamponada com HEPES (HBS) com albumina a 1% de soro humano (HSA). Centrifugar a 1000 xg por 2 min. Pipeta e descartar os melhores 200 mL de sobrenadante, e repetir duas vezes para um total de três ciclos de lavagem. </li><li> Adicionar 50 ul de estreptavidina a um 333 ng / ml de concentração. Pulso a placa novamente 3x 10 segundos, e deixe descansar em um shaker para 15 min. Lavar 3x como na etapa 6 para remover estreptavidina não ligado. </li><li> Adicionar 50 ul de anticorpo biotinilado marcado por fluorescência a partir da série de diluições previamente preparadas (ver passo 3.1) em cada poço, e substitui a placa no agitador durante 20-30 min. Lavar 3x como no passo 6 para remover o anticorpo não ligado. </li><li> Após a lavagem final, voltar a suspender as pérolas em 100 ul de HBS / 1% de HSA, e transferir para um tubo de FACS. Repita isso duas vezes paraassegurar a remoção eficiente de todos os cordões do poço, para um total de 300 ul, e fazer isto para cada poço. </li><li> Trazer os tubos resultantes para o citómetro de fluxo. É tempo de lê-los. </li><li> Adicionar uma gota a partir do frasco marcado &quot;B&quot; a partir do kit de calibração grânulo intensidade de fluorescência (FIC) (daqui em diante referido como &quot;série normal&quot;) para um tubo de FACS, e dilui-se com 300 ul de HBS / 1% de HSA. </li><li> Leia este tubo, mas não gravar os dados ainda. Por enquanto, apenas garanta que as esferas em branco estão devidamente zerado. Adicione um histograma que mostra a fluorescência das pérolas medidos no canal apropriado, em seguida, deslocar a tensão do laser de excitação para baixo até que o pico está na extremidade da esquerda do histograma. </li><li> Remover o tubo e adicionar 1 gota de cada um dos outros 4 tubos da série (identificada como 1 a 4) para o mesmo tubo. Agora, colocar o tubo na máquina novamente, e gravar os dados resultantes, que deve aparecer como 5 picos distintos. </li&gt; <li> Leia cada tubo individual a partir da série de amostras. </li><li> Usando o software de análise FACS, desenhe um portão abrangendo toda a largura de cada pico na série histograma normalizada no ponto de metade do valor máximo. Essa é uma porta para cada pico. Faça o mesmo para cada amostra. Nota o MFI (intensidade de fluorescência média) para cada porta. </li><li> Usando um programa de planilha de entrada os valores de MFI medidos no local apropriado. Também a entrada MESF (Moléculas de equivalentes Solúvel Fluorochrome) valores (número médio de moléculas fluorescentes que revestem cada esfera) para cada garrafa na série standard. Esta informação pode ser encontrada seguindo as instruções sobre o plástico jar os tubos entrou. </li><li> Usar a folha de cálculo irá traçar o MFI contra os valores MESF, criando uma correlação linear entre o número de fluoróforos e a intensidade medida. </li><li> Utilizar o módulo de proteínas &#39;&amp;&#39; rótulos no espectrofotómetro micro-volume, para determinar a proporção de corante de prótein em que o anticorpo marcado. </li><li> Introduza a eficiência de marcação da proteína na amostra, o diâmetro médio dos grânulos revestidos com lípidos, e o valor de MFI para cada entrada. A folha de cálculo utiliza automaticamente a fórmula a partir do gráfico gerado linha no passo 3.16 a computar os valores MESF para cada diluição da proteína e a densidade de sementeira de proteína de amostra para cada concentração. </li></ol> 4. isolando e cultivando células NK Humano <ol><li> Alíquota de 15 ml de sangue periférico ou creme leucocitário em um tubo de 50 ml. Dilui-se o sangue com PBS contendo FBS a 1% à razão de 1: 1. </li><li> Adicionar 13 ml de Ficoll suavemente para o fundo do tubo com uma pipeta 10 ml serológico. </li><li> Centrífuga este tubo durante 20 minutos a 1.200 xg com o acelerador e a quebra de fora ou em suas configurações mais baixas. </li><li> Após centrifugação, utilizar uma pipeta serológica para recolher a camada de meio flutuante turvo branco de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), which deve sentar-se e a intersecção entre a camada superior amarela clara e uma camada inferior de cor pálida mais nebuloso, os quais encontram-se acima de uma camada mais baixa de glóbulos vermelhos (hemácias). NOTA Não para recolher quaisquer hemácias na cobrança do PBMC. </li><li> Coloque as PBMCs recolhidos em um novo tubo de 50 ml e perfazer o volume de capacidade com PBS contendo 1% de FBS. Centrifugar novamente, dessa vez com o travão e do acelerador no máximo, durante 5 min a 300 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de PBS contendo 1% de FBS. </li><li> Contar as células enquanto centrifugação mais uma vez com as mesmas configurações como no passo 4.6. </li><li> Descartar o sobrenadante mais uma vez, e voltar a suspender as células em meio R10 a uma densidade de 10 milhões de células / ml. </li><li> Tomar 30 milhões de células num tubo de polistireno de 5 ml, e isolar células NK utilizando um kit de separação magnética, seguindo as instruções do fabricante. Na sequência do isolamento, contar as células mais um e ressuspender a uma densidade de 500,000 células / ml em meio completo R10 (88% de RPMI; 10% de FBS; 1% de HEPES; o piruvato de sódio a 1%) suplementado com IL-2 (100 U / ml). Cultura a 37 ° em uma incubadora de CO 2, e substituir meio 2-3 vezes por semana. </li></ol> 5. Montagem do Glass-suportado Planar Lipid Bilayer <ol><li> Preparar solução piranha 100 ml por mistura de 30% de peróxido de hidrogénio com ácido sulfúrico, a uma proporção de 1: 3 numa proveta. NOTA: Sempre realizar um trabalho com agentes nocivos, como o ácido sulfúrico em um exaustor química corretamente designado. </li><li> Nesta solução, mergulhe 2 retangulares # 1.5 lamelas em solução piranha por 20-30 min. NOTA: É essencial para limpar as lamelas por solução piranha. </li><li> Enquanto as lamelas estão sendo limpos, tomar um tubo de previamente preparado 400 um lipídios DOPC e 1 tubo de previamente preparado 80 um lipídios Biotina-PE. Transportá-los em gelo para o tanque de árgon. </li><li> Deslocar o oxigénio em um novo tubo de microcentrifugação com árgon,em seguida, adicionar o conjunto de DOPC e Biotina-PE a uma proporção de 1: 1. O volume específico varia de acordo com as necessidades experimentais, mas deve ser no mínimo de 2 ul cada. Deslocar o oxigénio no tubo de mistura mais uma vez com árgon gasoso, e os tubos de reagente individuais, bem como, antes de retornar o último para o refrigerador. </li><li> Depois de terminar a limpeza, lave as lamelas com água destilada. Defina as lamelas fora secar ao ar por alguns minutos. </li><li> Retirar 1,5 mL da mistura de lipossomas, preparada no passo 5.4 e aliquotar em que uma única gota em uma das câmaras da pista deslizante câmara. A utilização de duas gotas por pista é típico, mas não é necessário. </li><li> Rápida e eficiente colocar a lamela seca sobre as gotículas. Certifique-se de que as gotas são suficientemente espaçados de modo que eles não se fundem quando a lamela é colocada. Além disso, certifique-se de que as gotas continuam a ser circular e bem definida, sem tocar as bordas das paredes da câmara. Pressione firmementeentre e ao redor de cada pista para garantir uma vedação estanque entre a lamela e slide. </li><li> Marque as posições das gotas usando uma caneta marcador </li><li> Passe 100 ul de solução aquosa a 5% de caseína através da câmara para bloquear a bicamada. Tente certificar-se de que não existem bolhas na câmara de fluxo. </li><li> Injectar 100 ul de estreptavidina a uma concentração de 333 ng / ml em cada pista. Incubar durante 10-15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lavar rodando 3 ml de HBS / 1% de HSA através de cada pista para remover o excesso de estreptavidina. </li><li> Adicionar 100 ul de biotinilado marcado por fluorescência anti-CD16, tais como Alexa Fluor 568, na concentração de proteína previamente determinado ser mais eficaz na secção 3. Incubar no escuro durante 20-30 minutos. Lave novamente executando 3 ml de HBS / 1% de HSA através de cada pista. </li><li> Fluxo 100 ul de D-biotina a uma concentração de 25 nM, através da câmara, a fim de ligar qualquer excesso de estreptavidina e, assim, eliminar a possibilidade de ligação não específica de rreptavidin para as células. </li><li> Contagem de células NK e ressuspender a uma concentração de 500,000 / ml em HBS / 1% de HSA. </li><li> Enquanto centrifugando as células, lava-se a D-biotina para fora da câmara com outro 3 ml de HBS / 1% de HSA por pista. </li><li> Verifique a mobilidade dos ligantes no SLB por recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) em uma fluorescência total interno de reflexão (TIRF) ou microscopia confocal antes de adicionar as células NK. </li><li> Uma vez que as células tenham acabado de fiação e foram novamente suspensas na concentração desejada, adicionar 100 ul de cada pista. </li><li> Coloque a câmara em uma temperatura de 37 ° 5% de CO2 durante 30-60 min. </li><li> Após este período de incubação, fixar as células com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente durante 10-20 min. Lavar executando 3 ml de PBS através de cada pista para remover o paraf ormaldeido. </li><li> Adicionar 400 ul de tampão (5% de soro de burro normal e 0,2% Tritron X-100 em PBS) de bloqueio. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Stain F-actina e perforina por anúncioding 200 ul de diluído faloidina fluorescente marcado (1 unidade / ml faloidina marcada) e fluorescentemente marcado com mAb anti-perforina (500 ng de mAb anti-perforina ml /). Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar executando 3 ml de PBS. A câmara está pronto para a imagiologia. </li></ol> 6. Criação de Imagens do NK Synapse em Lipid Bilayer usando STED <ol><li> Ligue todos os módulos de hardware necessários. </li><li> Inicie o software de análise de imagem. Ativar a varredura de ressonância e módulos STED. Depois de fazer essas seleções, aguarde cerca de 3-5 minutos para o software para iniciar. </li><li> Clique na aba &quot;Configuração&quot;, na parte superior da tela. </li><li> Selecione &quot;Laser Config&quot;, em seguida, ligar a luz branca e lasers STED 592 nm. </li><li> Escolha o objetivo 100x, e alinhar o feixe de laser de excitação com o laser esgotamento 592 nm. </li><li> Selecione o módulo &quot;Laser Config&quot;, desligue o esgotamento 592laser, e por sua vez sobre o laser esgotamento 660 nm. </li><li> Colocar a lâmina sobre o palco, através da lente. Trazer as células ligadas na região demarcada bicamada em foco usando a lâmpada de luz branca e as oculares. </li><li> Retorne à guia &quot;Aquisição&quot;, diretamente à direita do separador &quot;Configuração&quot;. </li><li> Clique na aba &quot;Mudar para Whitelight&quot;, em seguida, vire esse módulo e arraste a linha de laser de excitação para o comprimento de onda apropriado. </li><li> Selecione o detector desejado a partir da lista dos disponíveis, em seguida, defina o intervalo de detecção para abranger o conjunto adequado de comprimentos de onda. Nota: Nunca coloque o intervalo de detecção diretamente abaixo do feixe de excitação. </li><li> Clique no botão &quot;Seqential&quot; na mão esquerda &quot;Adquirir&quot; barra de ferramentas para abrir o diálogo Scanning Sequential na parte inferior da barra de ferramentas do lado esquerdo. Isso permite que o usuário adicione várias seqüências, cadacom um feixe de excitação diferente de uma cor diferente. Clique em &quot;Entre Frames&quot;, e em seguida, defina a frequência de excitação, detector, e alcance de detecção para cada cor adicional como nos passos 6,9 e 6,10. </li><li> Uma vez que todas as configurações são otimizadas, clique em &quot;Start&quot; para iniciar o processo de aquisição. </li><li> Aplique o software livre deconvolution (Huygens), utilizando um cenário projetado para STED deconvolution, como descrito anteriormente 13. </li></ol>

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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells.">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li><li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture.">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A novidade do estudo é que ele combina a técnica SLB com STED estudar sinapses das células NK. Estudos anteriores obtiveram imagens da bicamada lipídica com TIRF para estudar a formação de sinapses células T 8 e tráfico molécula de sinalização da membrana plasmática 6. Outros descreveram STED imagiologia de sinapses nas células NK utilizando lâminas de vidro revestidas com anticorpo 13,14. O método híbrido aqui descrito ainda se baseia esses esforços pela imagem da sinapse das células NK com a maior nitidez proporcionada pelo super-resolução de imagem na superfície bicamada lipídica do que modelos melhores da superfície dinâmico de um APC. Embora SLBS são membranas artificiais falta de citoesqueleto, jangadas lipídicas, e outros ligandos que as células-alvo reais ou APCs possuir, esta técnica pode recapitular características importantes, tais como a mobilidade e orientação dos ligandos. Isto permite que o sistema de SLB para servir como uma abordagem reduzida em dissecar tele contribuição dos receptores individuais e ligantes para formação da IS e da dinâmica do IS. A característica mais importante de SLBS é que os pesquisadores podem combinar esta técnica com abordagens de imagem de alta resolução, como a microscopia confocal e TIRF. A introdução de microscopia STED aumenta ainda mais essa vantagem, fornecendo insights sem precedentes em uma pesquisa e suas aplicações clínicas. Uma crítica potencial deste sistema é que o SLB não mimetizam adequadamente a superfície de uma APC complexo, dando assim origem a características anatómicas potencialmente não-fisiológicos nas sinapses resultantes. Embora seja verdade que o repertório limitado de moléculas de superfície sobre o SLB não recapitular totalmente a superfície heterogeneamente povoada de uma APC, este limite pode também ser vantajoso na medida em que permite que os investigadores a determinar a influência das interacções do receptor e do ligando individuais sobre a formação de sinapses . TAqui estão alguns passos cruciais no processo. Entre o mais crítico é que a oxidação dos lipossomas ser impedido através de um constante com árgon para deslocar o oxigénio do tubo e da solução, tal como nos passos 1.10, 2.6, e 2.11. A oxidação dos lípidos irá resultar numa diminuição da mobilidade lipídica, impedindo, assim, a capacidade de proteínas de superfície de se mover livremente e participar na estruturação sináptica. Da mesma forma, é também crucial para remover todo o clorofórmio no lipossoma por liofilização (passo 1.2). Na determinação da densidade de proteína na bicamada lipídica, é de importância para primeiro dispersar as pérolas de silício em uma suspensão homogénea livre de aglomerados. Se necessário, os grânulos de sonicação pode ser aplicada. Na montagem do SLB, os primeiros passos (5,1-5,8) em que as lamelas são limpos, as gotas são colocadas, e lamela é afixada são vitais. Um erro em qualquer um destes pode necessitar de começar a experiência sobre (a partir do início da secção 5). Por esta razão, éboas práticas para limpar mais lamelas do que será necessário para economizar tempo, em caso de um acidente. Non-agrupamento é a questão mais frequente quando se trabalha com este sistema. Se, ao visualizar as células na etapa final, uma falha de encontrar quaisquer sinapses fluorescentes, existem algumas medidas que podem ser tomadas. Outra mancha para o receptor da superfície celular cognato pode ser adicionada à câmara para verificar que a célula não se formou uma sinapse com a bicamada, Enquanto as células podem aderir de forma não específica à superfície da lamela de vidro ou bicamada, as proteínas de superfície-sinapticamente envolvidos devem aparece como aglomerados distintos no plano da interface célula-bicamada, enquanto que as proteínas de superfície descomprometidos deve aparecer como coloração difusa em torno do perímetro da célula. No caso de este método falhar, deve-se verificar as suas células por citometria de fluxo para garantir que o marcador particular, uma espera para estudar é expressa em abundância adequada na superfície da célula. Certain prote superfícieins são conhecidos por ser regulada para baixo sobre a longo prazo na cultura vivo. Embora este protocolo detalhes especificamente como visualizar a formação de sinapses de células NK, o sistema SLB pode ser utilizado para estudar a formação de sinapses em qualquer imunocï¿½tica imaginável simplesmente por substituição do ligante primário no passo 5.11. Vários ligandos também podem ser adicionados simultaneamente. Um também não é necessário utilizar um sistema de estreptavidina-biotina para fazer aderir as proteínas de superfície na bicamada. Nickel-NTA: interações histidina também são viáveis. No entanto, devido à elevada força e especificidade da estreptavidina: interacção biotina, o nosso laboratório prefere este sistema. Pode-se variar também a concentração de células adicionadas na bicamada da densidade prescrita no passo 5.13, assim como a duração do período de incubação subsequente, a fim de observar as sinapses em diferentes estádios de maturação. Isso pode ser feito até mesmo ao vivo, embora isso, naturalmente, exclui a possibilidade de visualizar str intracelulaructures (a menos que eles já estão marcadas com um marcador fluorescente fundido; nosso laboratório usa algumas dessas linhas de células alteradas). Devido ao alto grau de personalização possível neste protocolo, pode-se usar a técnica básica SLB, juntamente com imagens STED, para tratar de uma gama extremamente diversificada de questões em imunologia, biologia celular e bioquímica, incluindo a dinâmica de lipídios básicas 15, a formação de sinapses 16, de sinalização intracelular 17, e de células tumorais metástase 18.

A sinapse imunológica (IS) encontra-se numa encruzilhada crítica para a ativação e função um celular. É o principal meio pelo qual a apresentação de antigénios e a imunidade mediada por células são realizadas. Os primeiros estudos microscópicos de formação de sinapses utilizado um sistema conjugado de célula-célula 2. A principal limitação desta abordagem é que a maioria dos conjugados será visto &#39;em perfil &quot;, por assim dizer, restringindo, assim, a vista do observador da própria estrutura sináptica. Em 1999, o laboratório Dustin abordou esta limitação, utilizando a bicamada lipídica suportada em vidro (SLB) 3 técnica, que tinha sido anteriormente pioneiro pelo laboratório McConnel 4,5. Esta abordagem eliminados de células apresentadoras de antigénio (APCs) a favor de uma superfície plana de lípidos suportada em vidro, em que proteínas poderiam ser ligados e mover-se livremente em duas dimensões. Usando este método, Dustin e seus colegas foram capazes de perscrutar diretamente para dentro tele sinapse usando microscopia de fluorescência de alta resolução, e pela primeira vez obter uma aparência &quot;face-a-face&quot; na estrutura do IS. Com a utilização do sistema de SLB, o detalhe com que o SI pode ser visualizada foi restringido apenas pelas limitações das técnicas de imagiologia actuais 6-8. Utilizando técnicas padrão de iluminação, a resolução mínima (isto é, a distância mínima entre dois objectos distintos em que eles podem ser distinguidos) foi &lt;200 nm, com base no critério de Rayleigh 9. Este limite impede a imagem de, estruturas muito finas em escala molecular que compõem a sinapse, e até o desenvolvimento de técnicas de imagem de super-resolução 12/10, a visualização destas estruturas foi confinado a imagem de células fixas usando microscopia eletrônica. Com o advento recente de uma variedade de técnicas de super-resolução, tais como microscopia SIM (iluminação estruturada), PALM (microscopia localização fotoactivado), STORM (microscopia óptica reconstrução estocástico), e STED 10-12, os pesquisadores são capazes de estudar essas estruturas sinápticas em detalhes sem precedentes, que tem, por sua vez proporcionou uma compreensão cada vez mais esclarecida da IS. As vantagens de microscopia STED foram descritos antes 13. Aqui descrevemos imagem super-resolução com microscopia STED equipado com o laser de 660 nm esgotamento recém-desenvolvida. Em comparação com o laser de 592 nm depleção convencional, o laser de 660 nm, permite uma ampla selecção de corantes fluorescentes (ver http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), especialmente estes fluoróforos vermelhos. Outras publicações têm descrito a imagiologia STED de sinapses nas células NK em lâminas de vidro revestidas com anticorpo 13,14. Aqui, o sistema é combinado com SLB microscopia STED super-resolução para estudar a sinapse da célula NK. Esta técnica tem a vantagem sobre por anticorposdiapositivos revestidos de ser um mosaico de fluido, em que as proteínas de superfície incorporados podem mover-se livremente em uma superfície plana bidimensional (plano xy). Este imita mais fielmente a superfície orgânica e móvel de uma célula alvo, e consequentemente uma melhor recapitula a formação de uma sinapse imune fisiologicamente relevante. O objetivo deste protocolo é o de proporcionar ao usuário final com uma descrição detalhada de como a imagem da sinapse imunológica das células NK, combinando o sistema SLB e microscopia STED super-resolução. Ele irá fornecer ao usuário final com as medidas necessárias para: preparar os lipossomas, construir bilayers incorporado em proteínas, determinar a densidade de proteína nas bicamadas lipídicas, e adquirir imagens de super-resolução usando microscopia STED. Estas técnicas não são limitados ao campo da imunologia, e pode ser amplamente utilizado em uma variedade de disciplinas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1330">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:256px;">Company</td>
			<td style="width:316px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:475px;">Purpose</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:283px;">18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC) 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">850375C</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:283px;">18:1 Biotinyl Cap PE 
			1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)</td>
			<td style="width:256px;">Avanti&#160;</td>
			<td style="width:316px;">870273C&#160;</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Argon gas, compressed</td>
			<td style="width:256px;">Airgas&#160;</td>
			<td style="width:316px;">UN1006</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A lyophilizer</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">Freezone 7740020</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lyophilizer tubes</td>
			<td style="width:256px;">Labconco&#160;</td>
			<td style="width:316px;">7540200</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Chromatography Columns</td>
			<td style="width:256px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:316px;">sc-205558</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">1 M Tris pH 8.0</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9856</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">5 M NaCl</td>
			<td style="width:256px;">Ambion&#160;</td>
			<td style="width:316px;">AM9759</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Octyl-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">O1008</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:256px;"><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html?LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html;FrName=Spectra%2FPor+RC+Tubing;rtm=Kit;#KIT">Spectrum Labs&#160;</a></td>
			<td style="width:316px;">132676</td>
			<td>Liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">96-well V-bottom polystyrene plate (untreated)</td>
			<td style="width:256px;">Corning</td>
			<td style="width:316px;">3896</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Non-functionalized silica beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:316px;">SS06N</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:316px;">14-959-2A&#160;</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">QuantumTM MESF beads</td>
			<td style="width:256px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:316px;">Variable</td>
			<td>antibody density determination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Casein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">C0875</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">HEPES buffered saline + 1% HSA</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:316px;">434301</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Fluorescently-labeled biotinylated protein&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Homemade</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">80608</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">25x75 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:256px;">ibidi&#160;</td>
			<td style="width:316px;">10812</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Hydrogen peroxide (30%)</td>
			<td style="width:256px;">Fisher Scientic&#160;</td>
			<td style="width:316px;">BP2633</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:256px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:316px;">258105</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">D-Biotin</td>
			<td style="width:256px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:316px;">B20656</td>
			<td>Lipid bilayer preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Lens paper</td>
			<td style="width:256px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:316px;">54826-001</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Type F Immersion Oil</td>
			<td style="width:256px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:316px;">11 513 859</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">A Leica TCS STED microscope</td>
			<td style="width:256px;">Leica</td>
			<td style="width:316px;"></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the natural killer cell immunological synapse on a glass-supported planar lipid bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

A Figura 1 mostra o resultado da densidade anticorpo na bicamada lipídica. O princípio é o de utilizar grânulos padrão para fazer a curva padrão de MFI MESF contra através de citometria de fluxo (A). O MFI do conjunto de amostras, foi convertido em MESF utilizando a curva padrão. A densidade de anticorpos na bicamada lipídica é linearmente correlacionada com a concentração de anticorpos (B). A Figura 2 mostra o triple-color imagem STED de NK sinapse on-suporte de vidro bicamada lipídica planar. O anticorpo anti-CD16 sobre a bicamada lipídica acumula, provocando a formação de F-actina e a polarização de perforina e penetração através da malha de actina F no painel central da sinapse imunológica em células NK. Usando essa abordagem combinada, pode-se observar os limpa microclusters de marcação fluorescente anti-CD16 dentro do SLB, que reflete diretamente a aglomeração de CD16 da célula NK. Em comparação com a imagem confocal convencional, a estrutura de CD16 central cluster é mais facilmente percebido na imagem STED devido à fluorescência ambiente empobrecido. Além disso, a ultra-estrutura do citoesqueleto de actina é visto com resolução melhorada significativamente. Consistente com as observações anteriores 16,17, os grânulos líticos perforina-positivo são vistas posicionado sobre as regiões de baixa densidade de actina F na imagem STED, um detalhe fundamental, que é praticamente perdida na imagem confocal. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> Figura 1. Densidade de anticorpo 3G8 na bicamada lipídica. (A) correlação linear entre MESF e MFI para um conjunto padrão. (B) A correlação linear entre a densidade e concentração de uma série de diluição proteína de amostra de proteína, mostrando o número de monómeros de proteína fluorescente marcado por unidade de área como uma função do aumento da concentração em si revestido por lípidosgrânulos lica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> Figura 2. STED imagiologia de NK sinapse em bicamada lipídica plana. Primária células NK foram estimuladas na SLB contendo biotinilado marcado por fluorescência anti-CD16 (vermelho), fixa, permeabilizadas, e depois coradas com faloidina (azul) e anti-F-actina (verde). Uma célula individual foi fotografada em primeiro lugar sob a configuração confocal normal, e em seguida, a definição STED. Imagens confocal e STED foram deconvoluídos usando software Huygens. Scale bar, 1 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

super-resolution-imaging-natural-killer-cell-immunological-synapse-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.2K visualizações.  Texas Children's Hospital. We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Vídeo: Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

Facilitar a Análise de Dados com Visual imunológicos Técnicas Analíticas

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Imunologia e Infecção

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Preparação e Uso de HIV-1 infectados CD4 + T-Primária células como as células-alvo em Ensaios Natural Killer Celular citotóxicos

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualização do imunológica Synapse por Dual Color Time-fechado Emissão Estimulada Exaustão (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, however, the lateral resolution of super-resolution imaging is only ~100 nm. The low resolution is mainly due to the high autofluorescence background of photosynthetic cells caused by high-intensity lasers that are required for super-resolution imaging, such as stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Here, we describe a photobleaching-assisted STORM method which was developed recently for imaging the marine picocyanobacterium Prochlorococcus. After photobleaching, the autofluorescence of Prochlorococcus is effectively reduced so that STORM can be performed with a lateral resolution of ~10 nm. Using this method, we acquire the in vivo three-dimensional (3-D) organization of the FtsZ protein and characterize four different FtsZ ring morphologies during the cell cycle of Prochlorococcus. The method we describe here might be adopted for the super-resolution imaging of other photosynthetic organisms.

Photobleaching Enables Super-resolution Imaging of the FtsZ Ring in the Cyanobacterium Prochlorococcus

Here we describe a photobleaching method to reduce the autofluorescence of cyanobacteria. After photobleaching, stochastic optical reconstruction microscopy is used to obtain three-dimensional super-resolution images of the cyanobacterial FtsZ ring.

Fotobranqueamento permite Super-resolução imagem do anel FtsZ a associação ficobilinas

Super-resolution microscopy has been widely used to study protein interactions and subcellular structures in many organisms. In photosynthetic organisms, ...