O objetivo do método é gerar uma sinapse imunológica que é um exemplo de conjugação célula-celular formada por uma célula que apresenta antígeno e um linfócito de T- helper. Nosso objetivo é registrar os primeiros estágios da formação da sinapse imunológica e registrar os eventos de tráfico ocorridos no linfócito de T-helper. Estes eventualmente levarão à secreção polarizada na sinapse imunológica.
A abordagem aqui apresentada envolve conjugação célula-celular, aquisição de lapso de tempo, microscopia de fluorescência de campo largo e processamento subsequente de imagens. Isso melhora a relação sinal-ruído das imagens, aumenta a resolução temporal e permite a aquisição simultânea de várias fluorocromes em conjugados sinalíticos emergentes e diminui o branqueamento da fluorescência. Além disso, o protocolo é compatível com protocolos de fixação de células de ponto final que permitirão a coloração e análise da imunofluorescência.
Este protocolo também é compatível com microscopia fluorescente de varredura a laser e outras técnicas de microscopia de última geração. No processo estarão Ana Bello, estudante de pós-graduação, Alejandro Garrido, técnico, e Solange Moreno, estudante de pós-graduação. Para iniciar este procedimento, adicione 150 microliters de fibronectina a cada poço de um escorregador de câmara de oito microwells e incuba-o a 37 graus Celsius por 30 minutos a uma hora.
Após o período de incubação, aspire a fibronectina e lave cada poço com 200 microliters de PVS por dois minutos com agitação suave. Repita esta lavagem mais uma vez e deixe a segunda lavagem no poço. Transfira 10 mililitros de uma precultura confluente de células Raji para um tubo de fundo V de 15 mililitros.
Centrifugar a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o supernasce e resuspenque suavemente a pelota celular em meio quente e completo a uma concentração de 1 milhão de células por mililitro. Para rotular as células Raji, transfira o número necessário de células em meio de cultura para um tubo de dois mililitros.
Para o slide de câmara de oito microwell, é necessário um total de 1,6 mililitros de suspensão celular. Adicione azul rastreador de células a uma concentração final de 10 micromolar. Resuspend o rastreador de células azul-manchadas e transferir 200 microliters da suspensão celular para cada poço dos slides de câmara revestidos de fibronectina preparados.
Incubar o deslizamento da câmara a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 30 minutos a uma hora. Depois disso, agite suavemente os slides da câmara no microscópio para garantir que as células Raji sejam aderidas. Lave cada um bem cuidadosamente com meio de cultura celular quente e completo para eliminar o excesso de células do rastreador azul.
Certifique-se de que as células Raji são aderidas à parte inferior das placas, e elas exibem lacunas entre si e não são confluentes. 50-60% da confluência celular é apropriada. Primeiro, adicione Enterotoxina Staphylococcal E a uma concentração de um micrograma por mililitro em cada poço.
Certifique-se de que as células Raji são pulsadas com superantígeno caso contrário o receptor de células T das células Jurkat não reconhecerá o SCE e a sinapse não será formada. Incubar o deslizamento da câmara a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por pelo menos 30 minutos. Em seguida, obtenha uma cultura de crescimento anterior das células Jurkat a uma concentração entre 1 e 2 milhões de células por milímetro.
Observe as células sob um microscópio de contraste de fase e, em seguida, transfira as células para um tubo de fundo V de 15 mililitros. Centrifugar a 300 vezes G e à temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o supernasce e resuspenque suavemente as células em meio de cultura quente e completa a uma concentração de 1 milhão de células por mililitro.
Em seguida, mantenha as células Jurkat na cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até estar pronto para usar. Recupere os slides da câmara contendo o rastreador de células com rótulo azul Staphylococcus Enterotoxin E células Raji pulsadas da incubadora. Aspire cuidadosamente o meio de cultura de cada poço um a um com uma pipeta colocada em um canto do poço.
Substitua imediatamente o meio por 200 microlitadores das células Jurkat resuspended no meio da cultura celular. Se um lapso de tempo estiver sendo realizado, siga rapidamente para o microscópio. Localize o slide em câmara no garçom de preparação do microscópio e selecione alguns campos apropriados.
Prepare o microscópio e a câmara de incubação antes da imagem. Depois que as células jurkat foram adicionadas a cada poço contendo as células Raji, localize rapidamente o deslizamento de câmara microwelled na incubadora encenada do microscópio pré-aquecido e selecione algumas posições XY. Se apenas um experimento de ponto final for planejado, incubar o deslizamento de câmara a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas.
Após o período de cultura, verifique se há formação conjugada e, posteriormente, fixar os conjugados conforme descrito no protocolo de texto. Para fixar as células, adicione RPMI quente sem FCS e agite suavemente. Aspire o RMPI e adicione 200 microliters de PFA ou acetona pré-filhada a cada poço.
Incubar o deslizamento da câmara à temperatura ambiente ou no gelo por 20 minutos. Em seguida, lave cada poço duas vezes com PVS e adicione 200 microliters de solução de saciamento. Neste estudo, conjugados de sinapse imunológica jurkat-raji são gerados e os estágios iniciais da formação de sinapse imunológica são devidamente compreendidos.
Esta estratégia induz a formação de sinapse imunológica ao mesmo tempo em que realiza a imagem de lapso de tempo. Os conjugados sinopticos representativos jurkat-raji obtidos a partir desta técnica são mostrados aqui, incluindo uma imagem do canal de transmissão, o canal azul rastreador celular, e ambos os canais fundidos. Alguns conjugados sinápticos podem ser vistos, incluindo aqueles compostos de apenas uma célula jurkat e várias células Raji, que são conjugados complexos.
A diminuição das concentrações celulares contornará a formação de conjugados celulares complexos, mas pode não fornecer conjugados celulares suficientes para a análise subsequente do tráfego polarizado, o que, por sua vez, diminuirá as chances de encontrar e de imagem de conjugados sinápticos emergentes. Uma desconvolução das imagens do canal de fluorescência GFP-CD63 é realizada com um software de desconvolução apropriado usando a opção óptica de campo largo e os parâmetros ópticos adequados. Este canal desconvolucido foi posteriormente fundido ao canal azul-grande do rastreador celular.
Há uma melhora tanto da relação sinal-ruído quanto da nitidez. Uma pilha Z representativa de um conjugado de sinapse imunológica fixa é mostrada aqui. A imunofluorescência é realizada usando phalloidina para visualizar o F-actin, anti-CD63 para visualizar o MVB, e anti-gama-tubulina para visualizar MTOC enquanto o rastreador celular azul rotulou as células Raji.
A transfixação opcional das células Jurkat permitirá a visualização do tráfego dos grânulos secretos em células vivas. Por exemplo, quando o GFP-CD63 é expresso, o movimento das vesículas decoradas GFP-CD63 pode ser gravado. O protocolo é compatível com protocolos de fixação de ponto final que permitirão mais protocolos e análises de coloração de imunofluorescência.
Existem modelos experimentais de produtividade que podem simplificar a imagem na sinapse imunológica, mas esses modelos não emulam a superfície complexa e irregular nas células antigen-apresentadoras que podem produzir interações não fisiológicas na sinapse imunológica. A abordagem descrita aqui é adequada para reproduzir e confirmar algumas complexidades biológicas ocorridas na sinapse imunológica. Superantênio é uma toxina perigosa, então, por favor, certifique-se de usar luvas, e deixe cair a ponta usada na caixa perigosa.
