We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

1. litografia óptica de Mestres do Dispositivo <ol><li> Desidratar bolachas de silício limpas em uma placa quente a ~ 250 ° C durante pelo menos 1 hr. NOTA: É uma boa prática para usar mais de um wafer ao preparar um mestre, em caso de erro do usuário. </li><li> Preparar alíquotas fotossensíveis. Preparar alíquotas de ambos SU-8 2015 fotorresistente e uma diluição de SU-8 2015 fotorresistente na proporção 2: 1 utilizando SU-8 mais fino como diluente. NOTA: Cerca de 1 ml de material fotosensitivo é necessária para revestimento por rotação uma bolacha. </li><li> Prepare três padrões de máscara para a produção destes mestres. Para a membrana Mestre, preparar duas máscaras: uma padronização do canal de membrana e o outro padronização das câmaras de reacção. Para o mestre válvula de controle, preparar apenas um padrão de máscara. NOTA: Para mais detalhes sobre técnicas de litografia, incluindo padronização máscara, consulte Ito e Okazaki, 2000. 36 See Fowlkes e Collier, 2013 para uma descrição mais detalhada do projeto do dispositivo 37. </li><li> Preparar a membrana mestre <ol><li> Spin-revestimento 2: 1 SU-8 diluição 2,015 fotorresistente em wafers a 1.000 rpm durante 45 seg. </li><li> Assar bolachas moles a 95 ° C durante 2 min. Usando um alinhador de contacto, expor bolachas com padrão de canal de membrana durante 10 segundos, e realizar um cozimento pós-exposição durante 2 min a 95 ° C. </li><li> Desenvolver bolachas em SU-8 desenvolvedor durante 1 min, ou até que os resíduos fotossensível é removido. Lavar bolacha com isopropanol, movendo-se de cima para baixo. Wafer com azoto seco, mais uma vez em movimento de cima para baixo. Bolachas Cozer a 180 ° C durante 4 min. </li><li> Spin-revestimento modelado bolachas novamente com 2: 1 SU-8 diluição a 2.000 rpm durante 45 seg. </li><li> Assar bolachas modelado suave durante 2 min a 95 ° C. Usando contato alinhador, alinhe wafers modeladas com padrão câmara de reação, e expor por 10 s. Realizar coza pós-exposição durante 2 min a 95 ° C. </li><li> Desenvolver pastilhas como descrito no passo 1.4.3. Depois de desenvolver e secagem wafers, bolachas Asse em forno a 180 ° C por 4 min. NOTA: As bolachas podem ser desenvolvidas no mesmo programador que foi utilizado no passo anterior. </li></ol></li><li> Prepare a Válvula de Controle Mestre <ol><li> Spin-coat não diluído SU-8 photoresist sobre lâminas limpas a 2.000 rpm durante 45 seg. </li><li> Coza bolacha mole a 95 ° C durante 6 min. Usando um alinhador de contato, expor bolachas com padrão de válvula de controle por 10 s. Realize uma assar pós-exposição a 95 ° C por 6 min. </li><li> Desenvolver bolachas em SU-8 Developer durante 2 minutos, ou até que os resíduos sejam removidos. Lavar com isopropanol, movendo-se de cima para baixo. Bolacha a seco com azoto e cozer no forno a 180 ° C durante 4 min. </li></ol></li></ol> 2. PDMS fabricação de dispositivos <ol><li> Silanizar todos os mestres com ~ 0,2 ml trimetilclorosilano via deposição de vapor. <ol><li> Coloque rapidamente o mestre em um recipiente hermético, em temperatura ambiente com algumas gotas de agente de silanização. NOTA:. Outros protocolos silanizar pode ser aceitável 38 Se properl realizaday, o PDMS será fácil de remover. </li></ol></li><li> Misturar um poli comercial (dimetilsiloxano) (PDMS) de base e agente de cura, em diferentes proporções para as camadas tanto da válvula de membrana e de controlo do dispositivo, tal como foi demonstrado em multicamadas válvula semelhante projeta 39. Usar 20: 1 e 5: 1 de rácios de base: agente de cura para os moldes de membrana e de válvulas de controlo, respectivamente. <ol><li> Para o molde de membrana, misturar 10 g de base com 0,5 g de agente de cura. NOTA: Este volume será spin-revestido sobre o mestre membrana. </li><li> Para o molde de válvula de controlo, a mistura de base e agente de cura na proporção de 5: 1. A quantidade de PDMS necessárias para moldar a válvula de controlo irá depender do recipiente utilizado para armazenar a válvula de controlo principal; encher o recipiente de tal modo que o mestre é revestida com ~ 1 cm de PDMS. </li></ol></li><li> Misture bem tanto PDMS preparações, e desgaseificar-los em uma câmara de vácuo até que não haja bolhas de ar são visíveis. Coloque o mestre da válvula de controle em uma resistente ao calorrecipiente, tal como um prato de vidro. Com cuidado, despeje 5: 1 PDMS relação sobre o mestre, e desgaseificar o recipiente uma segunda vez. </li><li> Enquanto o recipiente PDMS válvula de controle está sendo isentos de gases spin-coat as 20: 1 PDMS relação no master membrana deitando, com cuidado a mistura PDMS para o mestre de membrana para minimizar a formação de bolhas de ar, então spin-coating o mestre a 1.000 rpm durante 45 seg. </li><li> Parcialmente curar ambos mestres em um forno a 80 ° C durante 6 minutos para o mestre da membrana e 15 min para o mestre da válvula de controle. NOTA: Quando parcialmente curado, os PDMS deve manter sua forma, mas o material será um pouco brega. Se PDMS ainda não está curada, asse novamente em incrementos de alguns minutos a uma hora até que o material mantém a sua forma quando pressionado. </li><li> Corte PDMS retangulares moldes de mestre válvula de controle, peeling os moldes fora suavemente. Furos de entrada de ar, através da componente moldada usando um furador 0,75 milímetros. NOTA: O buraco pode ser limpo através da inserção de um blun calibre 23t a ponta da agulha, e o exterior do molde pode ser feita com fita celofane, se necessário. </li><li> Usando um microscópio óptico para localizar as câmaras de reacção sobre o mestre membrana, alinhar o componente de molde válvula de controle com as características da membrana câmara de reacção e colocar o componente de válvula de controlo directamente em cima da membrana mestre. Oriente a entrada da válvula de controle para o canto inferior esquerdo do dispositivo, e garantir que as câmaras de reação e canal do mestre membrana são visíveis no interior da válvula de controle rectangular. </li><li> Coza os componentes do molde alinhadas a 80 ° C durante 2 horas. NOTA: Os moldes da válvula de membrana e controle agora serão selados juntos, e manipulado como um molde. </li><li> Cortar o molde PDMS em camadas de distância do mestre membrana, descascando o molde de distância do mestre com muito cuidado para não perfurar a membrana. </li><li> Perfurar orifícios de entrada e saída para a entrada do extracto celular utilizando um furador 0,75 milímetros. Faça furos através de ambas as camadas,e limpá-los na mesma maneira como descrito no passo 2.6. </li><li> Usando um limpador de plasma indutivamente acoplado, deleite plasma tanto o molde (lado membrana para cima) e um No. 0 vidro lamela em 10,5 W por 20 s. Remover imediatamente a lamela e molde do limpador de plasma e camada os componentes, o lado da membrana para o vidro, tentando minimizar bolsas de ar entre o vidro eo molde. Não prima directamente no canal de entrada da membrana, ou a membrana pode emparelhar com o vidro, o que torna difícil preencher o canal com reagentes. <ol><li> Tome especial cuidado ao manusear os dispositivos montados para evitar a quebra da camada de vidro. Use lamelas de vidro finas como o dispositivo deve ser trabalhada através da lamela de vidro usando alta ampliação objetivos de imersão em óleo - se o vidro é muito grosso, os recursos do dispositivo podem não ser visíveis. </li></ol></li><li> Finalmente, os dispositivos de cura completado, a 80 ° C durante 2 horas. </li></ol> 3. Setup Experimental for Protein livre-Cell reação de síntese <ol><li> Hidratar um dispositivo por fervura em água desionizada durante 1 hora. NOTA: O aparelho deve ter uma aparência turva quando completamente hidratado. O dispositivo pode também ser deixado O / N em água estéril à temperatura ambiente para hidratar-lo. </li><li> Utilizando um microscópio invertido com uma câmara de incubação, ajustar a temperatura ambiente até 30 ° C. NOTA: Esta temperatura foi escolhida para optimizar a expressão de GFP com um promotor de T7, de modo que as temperaturas óptimas para outras reacções podem variar de 40. </li><li> Dispositivo Mount para microscópio titular palco com fita adesiva e enrole bordas do dispositivo com lenço de papel molhado, a fim de manter a hidratação local. </li><li> Use duas em circuito fechado transdutores de pressão tensão alta precisão para modular a pressão de gás nitrogênio para acionamento da válvula de controle e entrada de reagente. NOTA: Este protocolo só foi testado com nitrogênio de baixa pureza, embora possam ser utilizados outros gases inertes. <ol><li> Ligue o primeiro transdutor por24 gauge tubagem de PTFE para um reservatório de água realizado em um frasco de vidro de 4 ml com uma tampa de septo. Ligue o reservatório para a entrada da válvula de controlo utilizando um segundo tubo terminado por uma ponta romba de calibre 23 de agulha. NOTA: Ambos os tubos penetrar no septo reservatório com duas afiadas 23 agulhas de calibre. </li><li> Conecte o segundo transdutor por tubulação PTFE 24 de calibre conectado a um macho macho-conector Luer-lok. Anexar a um Luer-lok agulha de calibre 23 ligada a um tubo com outro calibre 23 agulha ponta romba, que é montado individualmente para cada dispositivo. Esta agulha liga-se ao canal de reacção, da membrana; usá-lo para limpar água a partir do canal de reacção, e os reagentes de entrada. </li></ol></li><li> Utilizando um sistema de expressão de proteína isenta de células, para montar os componentes da reacção CFPS em gelo, de acordo com as instruções do fabricante. Minimizar o tempo gasto segurando reagentes CFPS em gelo e colocar a mistura reaccional para o dispositivo imediatamente após a montagem. NOTA: Este dispositivo tem sidousado com um E. comercial coli extrair kit de expressão da proteína e um plasmídeo que expressa constitutivamente GFP. O volume total da reacção foi reduzida para 25 ul -, pode ser possível utilizar um volume menor até mesmo para os reagentes, se desejado. Como reagentes CFPS tendem a ser sensíveis a ciclos de congelação-descongelação, pode ser útil fazer alíquotas dos reagentes no volume apropriado antes da experiência. Outros reagentes podem ser adicionados à mistura de reacção, mas a reacção tem que ser completamente montado antes de ser aplicada ao dispositivo. <ol><li> Montar a reação, adicionando a entrada DNA passado. Observação: Uma vez montada num tubo de Eppendorf, a reacção começará CFPS se não mantida em gelo. Uma vez que o tempo necessário para aplicar os reagentes para o dispositivo e começar a experiência pode variar, é útil para iniciar um temporizador quando a reacção é montado e misturados - isto irá manter a escala de tempo entre experiências consistentes, e ajuda na solução de problemas. </li></ol></li><li> Usando oligador de tubagem e agulha descrito no Passo 3.4.2, retirar a reacção montados no interior do tubo utilizando uma seringa de 1 ml. Insira a agulha de ponta romba para a entrada de câmara de reação. Retire o conector da agulha da seringa e anexá-lo ao conector macho-macho utilizado para o transdutor câmara de reação. </li><li> Aplicar pressão (&lt;10 psi) para os reagentes CFPS para preencher o canal. Remover a agulha, quando a reacção está cheio. </li><li> Inserir o tubo romba do outro transdutor na entrada da válvula de controlo. Não pressurizar a válvula de controle ainda. </li><li> Coloque o dispositivo montado no palco. Utilizando imagens de campo claro, localizar as câmaras de reação com um objetivo de imersão em óleo 100X. </li><li> Accionar a válvula de controle através da pressurização do transdutor válvula de controle para 20 psi; uma mudança visível na membrana é evidente, quando a válvula de controlo é actuada. Concentre-se no fundo das câmaras de reação. </li><li> Comece a aquisição de imagens; crescimento em fluorescência wdoente ser visível no interior e em torno do exterior das câmaras de reacção, embora provavelmente não será evidente nas primeiras fases da reacção. Captar imagens a cada 1-3 minutos até que a reacção atinja um estado estacionário de fluorescência. Se um estágio com foco automaticamente não estiver disponível, reorientar brevemente cada imagem antes de as imagens que estão sendo tomadas. NOTA: Enquanto alguns fotobranqueamento vai ocorrer, os efeitos sobre a fluorescência relativa, devido a foto-branqueamento pode ser contabilizada, contanto que a taxa de fotobranqueamento é conhecido. Esta taxa de fotobranqueamento pode ser estimada através da exposição de um padrão de fluorescência, tal como uma concentração conhecida de GFP ou uma mistura fluoróforo, a fotobranqueamento constante ao longo de um período de tempo. </li><li> Anote o tempo decorrido a partir da montagem de reação para a primeira imagem adquirida. NOTA: Isso normalmente leva 4-5 min. </li></ol> Análise 4. Imagem e Processamento de Dados <ol><li> Usando um software de análise de imagens, como o ImageJ, selecione ointerior das câmaras de reacção como uma ROI. Adquirir o valor de intensidade de fluorescência média do ROI para todas as imagens. NOTA: Este é o traço intensidade de fluorescência em bruto. <ol><li> Executar esta tarefa no ImageJ usando os plugins Time Series Analyzer e ROI Gestor - Use Time Series Analyzer a escolher as regiões de interesse em torno do interior de cada câmara de reação. Defina &quot;AutoROIProperties&quot; para uma área que corresponde ao interior de cada câmara de reação, marque a opção &quot;Add On Click&quot; e selecione cada uma das câmaras. Nota: Esta etapa também pode ser feito usando a ferramenta elipse para desenhar um ROI em torno da câmara fluorescente. Este tamanho do ROI geralmente corresponde a uma elipse 30 x 30 pixel para uma câmara de 10 um de diâmetro com um objectivo viram 100X. </li><li> Realce todos os ROIs no Gerenciador de ROI. Use a função &quot;Multi Medida&quot; para determinar a média da intensidade de fluorescência de cada ROI através de toda a pilha de imagens. NOTA: Um plugin chamado StackReg pode ser usada para alinhar a pilha de imagens, se necessário. </li></ol></li><li> Depois de adquirir os vestígios de intensidade de fluorescência em bruto para todas as câmaras de uma experiência, determinar o componente determinista da reacção utilizando uma média inter-experimental em todos os vestígios, e subtraindo a média dos vestígios de matérias individuais. Use um software de análise de dados, tais como IGOR ou MS Excel para esta análise. NOTA: Este fornece ruído traça para cada câmara de reação. </li><li> Analisar o ruído de expressão do gene a partir destas câmaras de reacção, utilizando os mesmos métodos utilizados para analisar a expressão do gene de ruído derivada a partir de células 25. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A expressão de genes em células é inerentemente barulhento devido a pequenos volumes celulares e baixos números de cópias de reagentes importantes. Biologia Noise muitas vezes concentra-se nas fontes, processamento e conseqüências biológicas de flutuações nas populações, concentrações, posições, ou estados de moléculas que controlam circuitos de genes e redes 44. A grande maioria deste trabalho foi executado em sistemas celulares, o que tem a vantagem de exibir o ruído de um circuito de genes dentro do contexto natural das redes genéticas dentro da célula. No entanto, os sistemas isentos de células permitem a caracterização das flutuações intrínsecas de um circuito individual do gene sem os efeitos extrínsecos confusão 18 que não podem ser evitadas em sistemas celulares. Análise de ruído pode oferecer importantes percepções físicas em como genética circuitos são estruturados e como eles funcionam, e tem sido usado em sistemas celulares para caracterizar negativo e 25 positivo <sup&gt; 27 de autoregulação, extrínsecos e intrínsecos contribuições ao ruído expressão 18, e transcrição estourando 45,46. Aqui descrevemos o estudo de um sistema de expressão isento de células em microcanais que permitem o controlo simultâneo de tamanho de reactor e de iniciação da reacção de vezes, a fim de melhor compreender o papel que o confinamento e aglomerando 47,48 têm em intrínseca de ruído sem a expressão da proteína complicações associadas com células vivas. A chave permitindo característica do projeto é a integração de matrizes de femtoliter volume (micro-escala) câmaras de reação utilizados para confinar os reagentes de um sistema de expressão de proteína livre de células, com uma membrana elastomérica &quot;válvula de controle&quot; em PDMS que intercepta o reagentes a uma estrutura bem definida, &quot;tempo zero&quot; para iniciação da reacção (Figura 1). Este controlo permite que a cinética das reacções envolvidas na síntese da proteína a ser exerdevidos em tempo real com alta precisão. Como tal, é importante gerir reagentes isentos de células, de modo que a variabilidade inter-experimental é minimizado tanto quanto possível. Este controlo permite-nos avaliar a estrutura dos circuitos de ruído genéticos livre de células de forma que é análoga às técnicas anteriormente usadas para avaliar a expressão do gene em células vivas. Como reagentes utilizados em sistemas CFPS podem ser sensíveis a ciclos de congelação-descongelação, é importante para manter os reagentes frio e minimizar o tempo que os reagentes passam descongelar em gelo. É uma boa prática para testar periodicamente o sistema de expressão do CFPS em grandes quantidades, a fim de identificar as alterações nos níveis de expressão ao longo do tempo - isto pode ser feito em uma reacção de 10-15 ul num tubo de Eppendorf, ou em um dispositivo como um leitor de microplacas , que realiza várias leituras ao longo do tempo para capturar cinética de reação. Observando os tempos de idade e descongelamento dos reagentes para cada experimento vai ajudar ao solucionar baixa expressão levels. Além disso, quando se monta reagentes CFPS, é importante notar que a reacção irá começar uma vez que é totalmente montada e removida do gelo. A fim de manter um &quot;tempo zero&quot; consistente, é útil para gravar o tempo após o início da reacção CFPS após a adição final do ADN de entrada, e para aplicar a reacção tão rapidamente quanto possível para o dispositivo incubadas. Este processo deve levar cerca de 4-5 min, e fluorescência ainda não deve ser visível dentro das câmaras de reação. Esse controlo garante que o tempo disponível para a visualização da porção crescimento da curva da reacção é maximizada. Antes de executar reações CFPS no dispositivo, é aconselhável para executar testes de controle de qualidade para verificar que não haja vazamento das câmaras. Um teste de FRAP pode ser realizada (como na Figura 2D) através da aplicação de um fluoróforo para o dispositivo e expondo uma cavidade individual até que o poço é completamente branqueada. Se as câmaras sãobem fechados, sem a recuperação deve ser visível no interior do poço - deve haver um grande contraste entre as paredes do compartimento e os espaços interiores e exteriores. Se a recuperação de fluorescência é aparente ou as paredes da câmara de reacção não são bem definidas, a pressão sobre a válvula de controlo pode ser aumentado ou o dispositivo deve ser marcada para detecção de fugas ou delaminação da lâmina de vidro. Este protocolo foi testado com os reagentes a partir de uma E. CFPS comercial Kit coli isento de células de expressão da proteína (escala para 25 ul), embora outros sistemas CFPS robusto pode ser utilizado. É possível utilizar quantidades muito menores do que 25 jil quando se aplica a reacções do dispositivo, o que pode ser útil quando o custo do reagente é um factor limitante em experimentos. Uma vez que os reagentes são adicionados ao dispositivo e as câmaras de reacção são seladas, não é possível adicionar reagentes para a solução sem a válvula de comando de accionamento de - assim, este dispositivo não é suitable para reacções que requerem a adição de reagentes durante o decurso da reacção. Este dispositivo também não é optimizada para observar as reacções CFPS que pode executar mais do que 3 horas - os efeitos de desidratação e de secagem do aparelho após este período de tempo não foram avaliadas. Se os tempos de reacção mais longos são desejados, estes efeitos podem ser mitigados por meio de selagem do dispositivo para evitar a evaporação, mudando a temperatura de incubação, ou utilizando uma câmara de humidade. As alterações ao projecto dispositivo, tais como estruturas nanoporosos nas paredes da câmara de 49,50 ou a inclusão de uma camada de membrana porosa, representar alguns métodos que podem permitir a troca de reagentes e, assim, alongar prazos de reacção. Compartimentos de reação microfabricados de volume de uniforme são valiosos para a manutenção de dimensões consistentes em experimentos e altamente adequado para investigação das &quot;reações colaterais&quot; com as paredes do compartimento. Ao contrário dos métodos que não utilizam nenhumtécnicas de n-microfabricados, essas reações devem ser avaliadas em pequenas quantidades, e não fornecem flexibilidade dimensional durante as experiências. No entanto, o desenho controlável para estas câmaras de reacção é altamente apropriado para a microscopia de lapso de tempo, e pode ser um complemento de iluminação para um método de alto rendimento de confinamento.

Sistemas livres de células oferecer uma plataforma simplificada e flexível que permite visualizar reações biológicas livre de fatores complicadores, como fitness, divisão e mutação que são inevitáveis ​​no estudo de células vivas. Essas abordagens têm sido utilizados para estudar os sistemas celulares, incluindo a caracterização de proteínas de membrana 1, a sondagem de interações protéicas 2, e a exploração de aspectos fundamentais da tradução 3-7. Recentemente sistemas livres de células começaram a ganhar uma posição como plataformas viáveis ​​para a biologia sintética 8-10. O apelo de tais abordagens é que eles liberar a biologia sintética a partir do compartilhamento de recursos e &quot;ruído extrínseco&quot; que afeta a dinâmica de reação em células vivas. No entanto questões permanecem sobre a forma como o ambiente físico no qual as reacções de células livres são incorporados afecta a progressão e resultado da reacção. Ambientes de reação sem células - environm particularmente confinadoentos que abordam volumes de células relevante - permanecem pouco caracterizados. Proteína-Free Cell Synthesis (CFPS) é o pensamento convencional como sendo &quot;livre de escala&quot;, exibindo cinética equivalentes em toda uma gama de microlitro para volumes de reação litro escala 11. No entanto, as reações confinantes para volumes escala celulares foi mostrado para afetar significativamente as taxas de expressão de proteínas 12. A natureza estocástica de reações livres de células - especialmente como estes abordagem de sistemas ou até mesmo ir abaixo femtoliter volumes - pode ser de particular importância. O ruído na expressão de genes é uma propriedade muito influenciado por confinamento como volumes de células pequenas e elevadas densidades de componentes forçar muitas das moléculas importantes para os níveis populacionais muito baixas - por exemplo, de Escherichia coli dentro de limites num volume de 1 fl até 4.300 polipéptidos diferentes sob o controlo indutivel de várias centenas de diferentes promotores 13. Este ruído inerente tem sido apontada como uma força motriz central em numerosos processos biológicos, incluindo a quimiotaxia 14, a decisão HIV entre replicação ativa e latência de 15, a decisão λ fago entre lise e lysogeny 16,17, ea decisão Bacillus subtillus entre competência e esporulação 17. Biologia sintética livre de células, em seguida, fornece uma oportunidade para explorar as propriedades estocásticos de circuitos de genes celulares e redes, e manipular esses comportamentos para atingir as metas tecnológicas específicas. Embora o comportamento de ruído de sistemas celulares tem sido bem estudado 18-27, tem havido pouca exploração do comportamento de ruído fundamental de sistemas isentos de células, 8, particularmente à escala celular. Aqui apresenta-se uma plataforma para o estudo dos efeitos estocásticos em biologia sintética livre de células. Esta plataforma microfabricated contém femtoliter escala reação cHambers que podem ser rapidamente transitaram entre aberto (livre difusão dentro e para fora da câmara) e fechados (reagentes confinados dentro da câmara) estados. No estado fechado, nós confinar da síntese da proteína (CFPS) reagentes-Free Cell que expressam uma proteína verde fluorescente (GFP), e siga a expressão do gene usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de 28 (Figura 1). Nós caracterizar este ambiente isento de células, medindo a estrutura das flutuações estocásticos na expressão do gene de uma forma directamente análoga à utilizada para caracterizar as células 25. Os métodos não-microfabricação para confinar reações livres de células incluem vesículas e lipossomas 29-32, emulsões água-em-óleo 12 e 33 meios porosos. No entanto, enquanto estes métodos podem proporcionar um controlo sobre a distribuição do tamanho dos volumes confinados 34, os métodos de microfabricação criar características altamente reprodutíveis com dimensões especificadas firmemente, mesmo em nanoescala.Além disso, estas estruturas rígidas podem ser facilmente controladas ao longo do tempo sem ser susceptível de evaporação ou alterações no ambiente externo. Modelos de recipientes utilizados em microfabricados 8,35 trabalho anterior não pode selar rapidamente as câmaras de reacção após o início da reacção, o que complica a atribuição clara do momento em que a reacção foi iniciada (tempo zero). Usando o método aqui apresentado, são necessários apenas 4-5 min entre a iniciação e a visualização da reacção sobre o dispositivo, proporcionando assim uma estrutura bem definida &quot;tempo zero&quot;. Os seguintes protocolos de descrever os métodos para fabricar e testar este dispositivo, incluindo a litografia óptica, a montagem do dispositivo, o teste do dispositivo, e métodos para análise de imagem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="526">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:151px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:107px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Thinner</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360 FLUKA</td>
			<td>Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm hole-puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15072</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">23 ga needles blunt tip</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-231PL-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#0 glass coverslip</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>260366</td>
			<td>Gold Seal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse TE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD camera</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>CoolSNAP-HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shutter</td>
			<td>Shutter Insturment</td>
			<td>Lambda SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Color Filters</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td colspan="2">ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x oil-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N.A. 1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Regulator</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>H201-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph</td>
			<td>Universal Imaging Corp.</td>
			<td>Version 7.8.3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marsh Bellofram transducers</td>
			<td>Marsh Bellofram</td>
			<td>T2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 gauge PTFE tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/SWTT-24-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Septum vials</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>C4015- 17W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power Supply</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td colspan="2">6205B Dual DC Power Supply</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sharp 23 ga needles</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Male-to-male luer lock adapters</td>
			<td>Qosina</td>
			<td>20024</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga.</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-232PL-5C</td>
			<td>Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S30 E coli protein expression system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pet3a-GFP vector/protein</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69418-3</td>
			<td>Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#732-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 555</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>AF555</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.46r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: Time Series Analyzer</td>
			<td>Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>Version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: StackReg/TurboReg</td>
			<td>Ecole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne Biomedical Imaging Group</td>
			<td>Distribution is dated July 7, 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: ROI Manager Tools</td>
			<td>Tiago Ferreira</td>
			<td>12/15/2013 Version</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology

Sistemas isentos de células, proporcionam uma plataforma flexível para sondar redes específicos de reacções biológicas isoladas a partir do complexo de partilha de recursos (por exemplo, a expressão genética global, a divisão celular) encontradas no interior de células vivas. No entanto, tais sistemas, utilizados em reactores granel macro-escala convencionais, muitas vezes não conseguem demonstrar os comportamentos dinâmicos e eficiências característicos dos seus homólogos em micro-escala de vida. Compreender o impacto da estrutura celular interna e escala na dinâmica de reação é crucial para entender redes de genes complexos. Aqui nós relatamos um dispositivo que limita microfabricated reações livres de células em volumes escala celulares, permitindo a caracterização flexível do sistema molecular fechado. Esta poli multicamadas (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivo contém câmaras de reação femtoliter escala em uma membrana elastomérica que pode ser accionado (aberta e fechada). Quando acionada, as câmaras de confinar Proteína-Free Cell síntese (CFPS) Reacçõesexpressando a proteína fluorescente, permitindo a visualização da cinética de reação ao longo do tempo, através de microscopia fluorescente time-lapse. Aqui demonstramos como este dispositivo pode ser usado para medir o ruído de estrutura reacções CFPS de uma forma que é directamente análoga à usada para caracterizar os sistemas celulares, permitindo assim a utilização de técnicas de biologia ruído utilizados em sistemas celulares para caracterizar circuitos de genes e CFPS suas interações com o meio ambiente livre de células.

A vantagem distinta desta plataforma microfabricado está na aplicação da &quot;válvula de controlo&quot; elastomérico controlável que é accionado de forma independente, a fim de limitar as reacções CFPS (Figura 2A). Quando o dispositivo é accionado, as câmaras de membrana são pressionadas contra a lâmina de vidro para confinar reagentes fluorescentes em uma matriz de câmaras de reacção (Figura 2C). A fim de verificar que as câmaras de confinar a reacção de forma fiável através da duração da experiência, uma base FRAP (Recuperação de fluorescência Após fotodegradação) teste foi realizado 37. Um fluoróforo (AF 555) foi aplicada ao dispositivo, e a válvula de controlo foi accionado; utilizando a abertura do obturador do microscópio, num único poço confinando o fluoróforo foi isolado e Foto-descoloração individualmente (Figura 2D). O escolhido bem tornou-se escuro e não se recuperou em brilho até que a válvula de controle foi despressurizado 20 min60; depois, libertando a câmara a partir do vidro. Este teste verifica-se que estas câmaras de reacção permanecer bem fechado durante a duração da experiência. Em condições óptimas, a reacção CFPS expressar uma proteína facilmente visualizado (tais como GFP ou luciferase) expressa a proteína detectável dentro de poucos minutos de ser aplicado a este dispositivo. Ao longo da duração da reacção, a síntese de proteínas no interior e exterior das câmaras de reacção é representada por imagem e quantificada por unidades de medição da intensidade de fluorescência dentro de cada câmara (Figura 3A). A intensidade de fluorescência, que corresponde a concentração de proteína, pode ser mapeado ao longo do tempo para cada câmara de reacção (Figura 3D). A expressão dos genes é um processo inerentemente estocástica que introduz flutuações (ruído) a cada passo molecular (síntese, degradação, proteína-DNA de ligação, etc.) 20. Um ramo da biologia ruído centra-se nao valor probatório do gene ruído do circuito 41. A expressão em sistemas isentos de células terá efeitos do ruído extrínsecos que surgem de interacções entre a maquinaria molecular de expressão e as superfícies que definem os limites dos vasos de reacção. Estes efeitos extrínsecos provavelmente vai se tornar mais pronunciado como reações de células livres estão confinados em câmaras de reação ainda menores. A capacidade de executar time-lapse de imagens de múltiplas reações CFPS confinados, então, permite a análise cuidadosa da estrutura de ruído (magnitude e dinâmica) em sistemas livres de células confinadas em uma forma directamente análoga a métodos que têm sido relatados para sistemas celulares 25. Figura 3C e 3D mostram a evolução temporal de expressão da GFP constitutivo de um promotor de T7 num padrão de 384 poços de microplacas com um volume de 15 ul bem, em comparação com PDMS em câmaras de reacção de 10 um de diâmetro, correspondendo aos volumes de apenas cerca de 300 fl, sobre ordem de setes de magnitude menos. A variabilidade nas taxas de expressão de proteínas nas câmaras de reacção de 10 mm é muito mais elevada do que nas medições bem-placa, aproximando-se aos observados em células. Multiplexados reacções realizadas no dispositivo apresentar cinética semelhante ao CFPS reacções realizadas em grandes quantidades, num leitor de microplacas (Figura 3B), onde há um rápido aumento na fluorescência que planaltos, geralmente aceite que é causada por uma limitação de recurso no interior do volume de reacção 42,43 . Este comportamento de crescimento determinista, embora flutuante, é geralmente consistente em todas as câmaras de reacção, e entre experiências - fazendo a média entre as câmaras de vestígios de experimentos, a tendência determinista pode ser subtraído a partir de valores de rastreamento, deixando apenas os componentes de ruído da reacção (Figura 4A) . A Figura 4B mostra a expressão da GFP ruído após a remoção do, componente transiente determinista (topo), E a autocorrelação de ruído (parte inferior), enquanto que a figura 4A mostra os traços correspondentes nas câmaras de reacção de 10 ^ m. A distribuição dos tempos de meia-os vestígios de autocorrelação dá a dependência da frequência do ruído, enquanto o atraso de tempo zero os vestígios de autocorrelação dá as magnitudes do ruído, tal como a variância. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig1.jpg" /> Figura 1. reagentes síntese da proteína-Free Cell são confinados em câmaras de reação escala femtoliter com a finalidade de medir a expressão do gene de ruído. Reagentes de um sistema de expressão de proteína livre de células comercial são usados ​​para constitutivamente expressa GFP dentro confinado câmaras de reação PDMS. Uma matriz destas câmaras podem ser visualizados com microscopia de fluorescência de lapso de tempo, a fim de caracterizar a expressão de proteínas e expressão gênica de ruído. A intensidade de fluorescência of cada câmara de reação ao longo do tempo podem ser plotados como um traço individual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig2.jpg" /> Figura 2. Fabricação de duas camadas dispositivo micro com câmaras lacrado femtoliter escala. (A) Layout e vista explodida das camadas do dispositivo. O dispositivo é composto por duas camadas de PDMS e uma lamela de vidro. A membrana de PDMS, selado entre as camadas de vidro e de válvulas de controlo, mantém as câmaras de reacção. (B) imagem SEM de PDMS câmara de reação. O diâmetro interior é de 10 um. (C) Esquema de canais de entrada no dispositivo. Proteína-Free Cell Synthesis (CFPS) reagentes são transportados através do canal de reação. A água é pressurizada no controleválvula para comprimir as câmaras de reação contra a lâmina de vidro, selando as câmaras 37. Reproduzido de Ref. 37 com a permissão da The Royal Society of Chemistry. (D) recuperação de fluorescência Após Fotodegradação de teste (FRAP) em um único poço, utilizando FITC indica câmara é bem vedado contra ambiente externo. O fluorophore foi capturado nas câmaras (imagem superior) e um único poço foi Foto-descoloração (imagem inferior). Nenhuma recuperação de fluorescência foi visto na câmara Foto-descoloração até que a válvula de controle foi lançado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig3.jpg" /> Figura 3. EGFP Expressão em Confinado Reaction-Free Cell. (A) As imagens de fluorescência de selado reação c<html> Hambers em pontos de tempo escolhido na reacção. Produção de proteínas pode ser visto tanto no interior das câmaras de reacção e fora das câmaras do canal principal. (B) EGFP foi clonado num vector pET3a, proporcionando um promotor de polimerase de T7 e terminador e um local de ligação ao ribossoma forte (RBS). (C) As medições de fluorescência normalizados de expressão constitutiva de EGFP em uma reacção isento de células grandes quantidades realizada num leitor de microplacas. Reações CFPS costumam produzir proteína rapidamente, antes de desacelerar para uma fluorescência &quot;estado estacionário&quot; - esta está associada a limitação de recursos 43. Traços pretos indicam o traço médio. (D) fluorescência normalizada de 51 vestígios de intensidade de fluorescência a partir de matérias-li 51 câmaras de reacção ao longo de várias experiências. Traços pretos indicam o traço média ao longo de várias experiências, que ilustram o componente determinístico da expressão da proteína.&quot;Target =&quot; _ /52616/52616fig3large.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig4.jpg" /> Figura 4. Traços de ruído individuais e Noise Autocorrelation de um sistema celular e-Free Cell. (A) A partir de Austin et al., 2006. O ruído na expressão GFP (topo) e funções de autocorrelação normalizados (em baixo) adquiridos de rastreio da produção GFP em bactérias vivendo 25. Reproduzido com permissão da Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), de direitos de autor (2006). (B) O ruído na expressão GFP (topo) e funções de autocorrelação normalizados (em baixo) adquiridos de produção GFP em sistema livre de células, rastreados em câmaras de reação dispositivo microfluídicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui</a>para ver uma versão maior desta figura.

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Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Arrays Sealable Femtoliter Câmara de Biologia livre-Cell

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

sealable-femtoliter-chamber-arrays-for-cell-free-biology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K visualizações.  University of Tennessee, Knoxville. A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

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The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

O encapsulamento de transcrição livre de células e Tradução Máquinas em vesículas para a Construção de Mimics celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Bioengenharia

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Fácil e precisa Mecano-profiling em micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A general protocol is described for the preparation of V. natriegens crude cell extracts using common laboratory equipment. This high yielding protocol has been specifically optimized for user accessibility and reduced cost. Cell-free protein synthesis (CFPS) can be carried out in small scale 10 &#956;L batch reactions in either a 96- or 384-well format and reproducibly yields concentrations of &#62; 260 &#956;g/mL super folder GFP (sfGFP) within 3 h. Overall, crude cell extract preparation and CFPS can be achieved in 1&#8722;2 full days by a single user. This protocol can be easily integrated into existing protein synthesis pipelines to facilitate advances in bio-production and synthetic biology applications.

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free expression systems are powerful and cost-efficient tools for the high-throughput synthesis and screening of important proteins. Here, we describe the preparation of cell-free protein expression system using Vibrio natriegens for the rapid protein production using plasmid DNA, linear DNA, and mRNA template.

Proteína celular livre expressão usando o rapidamente crescendo bactéria Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

OnePot PURE Cell-Free System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic biology. Unfortunately, commercially available systems are costly, and their tunability is limited. In comparison, a home-made approach can be customized based on user needs. However, the preparation of home-made systems is time-consuming and arduous due to the need for ribosomes as well as 36 medium scale protein purifications. Streamlining protein purification by coculturing and co-purification allows for minimizing time and labor requirements. Here, we present an easy, adjustable, time- and cost-effective method to produce all PURE system components within 1 week, using standard laboratory equipment. Moreover, the performance of the OnePot PURE is comparable to commercially available systems. The OnePot PURE preparation method expands the accessibility of the PURE system to more laboratories due to its simplicity and cost-effectiveness.

We present a fast and cost-effective method to produce the recombinant PURE cell-free TX-TL system using standard laboratory equipment.

Sistema sem células OnePot PURE

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the fine-tuning of genetic circuits, such that their function results in predictable outcomes. With the growth of synthetic biology as a field, there has been an explosion of genetic circuits that have been implemented in microbes to execute functions pertaining to sensing, metabolic alteration, and cellular computing. Here, we show a rapid and cost-effective method for characterizing genetic parts. Our method utilizes cell-free lysate, prepared in-house as a medium to evaluate parts via the expression of a reporter protein. Template DNA is prepared by PCR amplification using inexpensive primers to add variant parts to the reporter gene, and the template is added to the reaction as linear DNA without cloning. Parts that can be added in this way include promoters, operators, ribosome binding sites, insulators, and terminators. This approach, combined with the incorporation of an acoustic liquid handler and 384-well plates, allows the user to carry out high-throughput evaluations of genetic parts in a single day. By comparison, cell-based screening approaches require time-consuming cloning and have longer testing times due to overnight culture and culture density normalization steps. Further, working in cell-free lysate allows the user to exact tighter control over the expression conditions through the addition of exogenous components and DNA at precise concentrations. Results obtained from cell-free screening can be used directly in applications of cell-free systems or, in some cases, as a way to predict function in whole cells.

Well-characterized genetic parts are necessary for the design of novel genetic circuits. Here we describe a cost-effective, high-throughput method for rapidly characterizing genetic parts. Our method reduces cost and time by combining cell-free lysates, linear DNA to avoid cloning, and acoustic liquid handling to increase throughput and reduce reaction volumes.

Caracterização Rápida de Partes Genéticas com Sistemas Livres de Células

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.