We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

1. lithographie optique de maîtrise de l&#39;appareil <ol><li> Déshydrater plaquettes de silicium propres sur une plaque chaude à ~ 250 ° C pendant au moins 1 h. NOTE: Il est recommandé d&#39;utiliser plus d&#39;une plaquette lors de la préparation d&#39;un maître, en cas d&#39;erreur de l&#39;utilisateur. </li><li> Préparer des aliquots de photoresist. Préparer des aliquotes de deux SU-8 2015 photorésist et une dilution de SU-8 2015 photorésist en rapport 2: 1 en utilisant SU-8 diluant comme diluant. REMARQUE: Environ 1 ml de résine photosensible est nécessaire pour spin-coating une plaquette. </li><li> Préparer trois motifs de masque pour produire ces maîtres. Pour la membrane principale, deux masques: préparer une structuration des canaux de membrane et l&#39;autre motif des chambres de réaction. Pour le maître Control Valve, préparer un seul motif de masque. NOTE: Pour plus de détails sur les techniques lithographiques, y compris les motifs masque, voir Ito et Okazaki, 2000. 36 Voir Fowlkes et Collier, 2013 pour une description plus détaillée de la conception de l&#39;appareil 37. </li><li> Préparer le Maître Membrane <ol><li> Spin-coat 2: 1 SU-8 2015 résine photosensible dilution sur des plaquettes à 1000 tours par minute pendant 45 secondes. </li><li> Plaquettes de cuisson douce à 95 ° C pendant 2 min. L&#39;utilisation d&#39;un dispositif d&#39;alignement de contact, d&#39;exposer plaquettes avec motif de canal de la membrane pendant 10 sec, et d&#39;effectuer une cuisson post-exposition pendant 2 min à 95 ° C. </li><li> Développer plaquettes dans SU-8 développeur pendant 1 min, ou jusqu&#39;à ce que les résidus de photorésist est enlevé. Rincer plaquette avec de l&#39;isopropanol, se déplaçant de haut en bas. Plaquette à sec avec de l&#39;azote, se déplaçant à nouveau de haut en bas. Plaquettes Cuire au four à 180 ° C pendant 4 min. </li><li> Spin-manteau à motifs plaquettes nouveau avec 2: 1 SU-8 dilution à 2000 tours par minute pendant 45 secondes. </li><li> Cuisson douce modelé plaquettes pendant 2 min à 95 ° C. Par contact d&#39;alignement, alignez plaquettes à motifs avec motif de la chambre de réaction, et d&#39;exposer pendant 10 sec. Effectuer post-exposition cuire pendant 2 min à 95 ° C. </li><li> Développer plaquettes comme décrit à l&#39;étape 1.4.3. Après le développement et séchage des plaquettes, plaquettes Cuire au four à 180 ° C pendant 4 min. REMARQUE: Les plaquettes peuvent être développés dans le même promoteur qui a été utilisé dans l&#39;étape précédente. </li></ol></li><li> Préparer le contrôle vanne principale <ol><li> Spin-couche non diluée SU-8 sur des plaquettes propres à 2000 tpm pendant 45 sec. </li><li> Doux tranche de cuire au four à 95 ° C pendant 6 min. L&#39;utilisation d&#39;un dispositif d&#39;alignement de contact, d&#39;exposer plaquettes avec motif de soupape de commande pendant 10 sec. Effectuez une cuisson post-exposition à 95 ° C pendant 6 min. </li><li> Développer plaquettes dans SU-8 Developer pendant 2 minutes, ou jusqu&#39;à ce que les résidus soient retirés. Rincez avec de l&#39;isopropanol, se déplaçant de haut en bas. Plaquette à sec avec de l&#39;azote et cuire au four à 180 ° C pendant 4 min. </li></ol></li></ol> 2. PDMS de fabrication de périphériques <ol><li> Silaniser tous les maîtres avec ~ 0,2 ml triméthylchlorosilane par dépôt en phase vapeur. <ol><li> Joindre rapidement le maître dans un récipient hermétique à température ambiante avec quelques gouttes de l&#39;agent de silanisation. NOTE:. Autres protocoles silanisants peuvent être acceptables 38 Si properl effectuéy, le PDMS sera facile à enlever. </li></ol></li><li> Mélanger un poly commerciale (diméthylsiloxane) (PDMS) de base et le durcisseur dans des proportions différentes pour les deux couches de membrane de soupape et de contrôle de l&#39;appareil, comme cela a été démontré dans la vanne 39 multicouche semblable dessins. Utilisez 20: 1 et 5: 1 ratios de la base: agent de durcissement pour les moules membrane et la vanne de contrôle, respectivement. <ol><li> Pour le moule à membrane, mélanger 10 g de base avec 0,5 g d&#39;agent de durcissement. NOTE: Ce volume sera spin-enduite sur le maître de la membrane. </li><li> Pour le moule de soupape de commande, mélanger la base et l&#39;agent de durcissement dans un rapport de 5: 1. La quantité de PDMS nécessaires pour mouler la vanne de régulation dépend du récipient utilisé pour contenir le maître de soupape de commande; remplir le récipient tels que le capitaine est revêtue d&#39;~ 1 cm de PDMS. </li></ol></li><li> Bien mélanger les deux préparations, PDMS et dégazer les dans une chambre à vide jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune bulle d&#39;air sont visibles. Placez le maître de la vanne de commande dans un résistant à la chaleur-récipient, tel qu&#39;un récipient en verre. Versez délicatement Ratio 5: 1 PDMS plus le maître, et dégazer le récipient un deuxième temps. </li><li> Alors que le conteneur contrôle de PDMS de soupape est dégazé, spin-enrober les 20: 1 PDMS sur le maître de la membrane en versant avec précaution le mélange PDMS sur le maître de la membrane pour minimiser la formation de bulles d&#39;air, puis spin-coating le maître à 1000 rpm 45 sec. </li><li> Durcir partiellement les deux maîtres dans un four à 80 ° C pendant 6 min pour le maître de la membrane et 15 min pour le maître de la vanne de commande. REMARQUE: Lorsque partiellement durci, les PDMS devrait tenir sa forme, mais le matériel sera légèrement collante. Si PDMS ne est pas encore guéri, cuire à nouveau par incréments de quelques minutes à la fois jusqu&#39;à ce que le matériau conserve sa forme lorsqu&#39;il est pressé. </li><li> Couper PDMS rectangulaires moules de maître de soupape de commande, le pelage des moules éloigner doucement. Percez des trous d&#39;entrée à travers la pièce moulée en utilisant une perforatrice de 0,75 mm. REMARQUE: Le trou peut être nettoyé en insérant un Blun de calibre 23aiguille de pointe de t, et l&#39;extérieur du moule peuvent être nettoyées avec du ruban adhésif, si nécessaire. </li><li> Utilisation d&#39;un microscope optique à localiser les chambres de réaction sur le maître de la membrane, aligner le composant de moule de soupape de commande avec les caractéristiques de la membrane de la chambre de réaction et placer le composant de soupape de commande directement au-dessus du maître de la membrane. Orientez l&#39;entrée de la vanne de commande dans le coin inférieur gauche de l&#39;appareil, et de veiller à ce que les chambres de réaction et le canal du maître de la membrane sont visibles à l&#39;intérieur de la vanne de commande rectangulaire. </li><li> Faire cuire au four les composants de moule alignées à 80 ° C pendant 2 heures. REMARQUE: Les membranes et de contrôle des moules de soupape vont maintenant être scellées ensemble, et manipulés comme une moule. </li><li> Couper le moule PDMS couches loin de le maître de la membrane, peeling le moule loin de maître très doucement afin de ne pas perforer la membrane. </li><li> Percez entrée et de sortie des trous pour l&#39;entrée de l&#39;extrait de cellule en utilisant une perforatrice de 0,75 mm. Percez des trous à travers les deux couches,et les nettoyer de la même manière que celle décrite dans l&#39;étape 2.6. </li><li> En utilisant un nettoyeur plasma à couplage inductif, régal de plasma à la fois le moule (côté membrane vers le haut) et un verre lamelle n ° 0 à 10,5 W pendant 20 sec. Retirer immédiatement la lamelle et le moule de la nettoyeur à plasma et la couche des composants, côté de la membrane vers le verre, en essayant de réduire les poches d&#39;air entre le verre et le moule. Ne pas appuyer directement sur le canal d&#39;entrée de la membrane, ou la membrane peut se anneler à la vitre, ce qui rend difficile de remplir le canal avec des réactifs. <ol><li> Faites attention lorsque vous manipulez les dispositifs assemblés pour éviter de casser la couche de verre. Utilisez minces lamelles de verre que l&#39;appareil doit être imagé par la lamelle de verre à l&#39;aide fort grossissement objectifs huile immersion - si le verre est trop épaisse, les fonctions de l&#39;appareil peuvent ne pas être visible. </li></ol></li><li> Enfin, guérir les appareils remplis à 80 ° C pendant 2 heures. </li></ol> 3. Installation expérimentale for protéines acellulaire réaction de synthèse <ol><li> Hydrater un dispositif en le faisant bouillir dans de l&#39;eau déminéralisée pendant 1 heure. REMARQUE: périphérique devrait avoir un aspect trouble quand il est complètement hydraté. Dispositif peut également être laissé O / N dans l&#39;eau stérile à température ambiante afin d&#39;hydrater. </li><li> En utilisant un microscope inversé avec une chambre d&#39;incubation, régler la température ambiante à 30 ° C. REMARQUE: Cette température a été choisie pour optimiser l&#39;expression de la GFP avec un promoteur de T7, si les températures optimales pour d&#39;autres réactions 40 peuvent varier. </li><li> Monter l&#39;appareil au microscope titulaire de scène avec du ruban adhésif et envelopper bords du dispositif avec du papier absorbant humide pour maintenir l&#39;hydratation locale. </li><li> Utiliser deux transducteurs en boucle fermée de tension de pression de haute précision pour moduler la pression du gaz d&#39;azote pendant l&#39;actionnement de soupape de commande et l&#39;entrée de réactif. NOTE: Ce protocole a été testé uniquement avec une faible pureté azote, bien que d&#39;autres gaz inertes peuvent être utilisés. <ol><li> Connectez le premier transducteur parCalibre 24 PTFE tube à un réservoir d&#39;eau contenue dans un flacon en verre de 4 ml muni d&#39;un couvercle de septum. Connectez le réservoir à l&#39;entrée de la vanne de commande en utilisant un second tube terminé par une aiguille de pointe émoussée de calibre 23. REMARQUE: Les deux tubes pénètrent le septum du réservoir avec deux tranchants 23 aiguilles de calibre. </li><li> Branchez le second transducteur par calibre 24 tubes de PTFE connecté à un male male-to-luer-lok connecteur. Attachez ce à une aiguille de calibre 23 Luer-lok relié par un tube avec une autre aiguille pointe émoussée de calibre 23, qui est assemblé individuellement pour chaque appareil. Cette aiguille se connecte au canal de réaction de la membrane; l&#39;utiliser pour vidanger l&#39;eau du canal de réaction et les réactifs d&#39;entrée. </li></ol></li><li> En utilisant un système d&#39;expression de protéine sans cellule, assembler les composants pour la réaction de CFPS sur de la glace, selon les instructions du fabricant. Minimisez le temps passé contenir des réactifs de CFPS sur la glace et placez la réaction dans le dispositif immédiatement après assemblage. REMARQUE: Cet appareil a étéutilisé avec un E. commerciale coli extraire kit d&#39;expression de protéine et un plasmide exprimant de manière constitutive la GFP. Le volume réactionnel total a été réduit à 25 ul - il peut être possible d&#39;utiliser un volume encore plus faible pour les réactifs, si on le souhaite. Comme réactifs CFPS ont tendance à être sensibles aux cycles gel-dégel, il peut être utile de faire des aliquotes des réactifs au volume approprié avant l&#39;expérience. D&#39;autres réactifs peuvent être ajoutés au mélange de réaction, mais la réaction doit être entièrement assemblé avant d&#39;être appliqué au dispositif. <ol><li> Assemblez la réaction, en ajoutant l&#39;entrée d&#39;ADN dernière. NOTE: Une fois assemblé dans un tube Eppendorf, la réaction de CFPS commencera sinon tenue sur la glace. Depuis le temps nécessaire pour appliquer les réactifs à l&#39;appareil et commencer l&#39;expérience peut varier, il est utile de commencer une minuterie une fois la réaction est assemblé et mélangé - cela permet de garder le délai entre les expériences cohérentes, et de l&#39;aide au dépannage. </li></ol></li><li> Utilisation de laConnecteur de tube et l&#39;aiguille décrit dans l&#39;étape 3.4.2, retirer la réaction assemblé dans le tube en utilisant une seringue de 1 ml. Insérez l&#39;aiguille de pointe émoussée dans l&#39;entrée de la chambre de réaction. Détachez le connecteur de l&#39;aiguille de la seringue et l&#39;attacher au connecteur mâle-mâle utilisé pour le capteur de la chambre de réaction. </li><li> Appliquer une pression (&lt;10 psi) pour les réactifs CFPS pour remplir le canal. Retirer l&#39;aiguille lorsque la réaction est rempli. </li><li> Insérer le tube émoussée de l&#39;autre transducteur dans l&#39;entrée de la vanne de commande. Ne pas pressuriser encore la vanne de commande. </li><li> Placez le dispositif monté sur la scène. En utilisant l&#39;imagerie en fond clair, localiser les chambres de réaction avec un objectif à immersion 100X. </li><li> Actionner la soupape de commande de mise sous pression par le transducteur de soupape de commande à 20 psi; un changement visible dans la membrane sera évident lorsque la soupape de commande est actionnée. Focus sur les fonds des chambres de réaction. </li><li> Commencez l&#39;acquisition d&#39;image; la croissance de la fluorescence wmal visible à l&#39;intérieur et autour de l&#39;extérieur des chambres de réaction, mais il ne sera probablement pas évidente dans les premiers stades de la réaction. Capturez des images toutes les 1-3 min jusqu&#39;à ce que la réaction atteint une fluorescence d&#39;état stable. Si une étape mettant automatiquement ne est pas disponible, recentrer brièvement chaque image avant de les images prises. REMARQUE: Alors que certains photoblanchiment se produira, les effets sur la fluorescence relative en raison de photoblanchiment peuvent être comptabilisées pour aussi longtemps que le taux de photoblanchiment est connue. Ce taux de photoblanchiment peut être estimée par l&#39;exposition d&#39;un étalon fluorescent, par exemple une concentration connue de la GFP ou un mélange de fluorophore, de photoblanchiment constante sur une période de temps. </li><li> Enregistrer le temps écoulé à partir de l&#39;ensemble de réaction pour la première image acquise. NOTE: Cela prend généralement 4-5 min. </li></ol> Analyse 4. Image et traitement de données <ol><li> En utilisant un logiciel d&#39;analyse d&#39;image tels que ImageJ, sélectionnez leintérieur des chambres de réaction comme un retour sur investissement. Acquérir la valeur moyenne de la ROI pour toutes les images d&#39;intensité de fluorescence. NOTE: Ce est la trace d&#39;intensité de fluorescence brute. <ol><li> Effectuer cette tâche dans ImageJ utilisant les plugins Time Series Analyzer et ROI Manager - Utilisation Time Series Analyzer de choisir des régions d&#39;intérêt autour de l&#39;intérieur de chaque chambre de réaction. Réglez &quot;AutoROIProperties&quot; à une zone qui correspond à l&#39;intérieur de chaque chambre de réaction, cochez la case &quot;Add On Cliquez&quot;, et sélectionnez chaque chambre. NOTE: Cette étape peut également être fait en utilisant l&#39;outil d&#39;ellipse de tirer un retour sur investissement autour de la chambre fluorescent. Cette taille de ROI correspond habituellement à une ellipse de 30 x 30 pixels pour une chambre de 10 um de diamètre vu avec un objectif 100X. </li><li> Mettez en surbrillance toutes les régions d&#39;intérêt dans le Gestionnaire de ROI. Utilisez la fonction &quot;Multi Mesure&quot; pour déterminer la moyenne de l&#39;intensité de fluorescence de chaque ROI à travers toute la pile d&#39;images. REMARQUE: Un plugin nom de StackReg peut être utilisé pour aligner la pile d&#39;images, si nécessaire. </li></ol></li><li> Après avoir acquis les traces d&#39;intensité de fluorescence pour tous les premières chambres dans une expérience, déterminer la composante déterministe de la réaction en prenant une moyenne inter-expérimental à travers toutes les traces, et en soustrayant la moyenne de premières traces individuelles. Utiliser un logiciel d&#39;analyse de données telles que IGOR ou MS Excel pour cette analyse. NOTE: Cette offre bruit retrace pour chaque chambre de réaction. </li><li> Analyser le bruit de l&#39;expression des gènes de ces chambres de réaction en utilisant les mêmes méthodes utilisées pour analyser le bruit de l&#39;expression des gènes provenant de cellules 25. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;expression des gènes dans les cellules est intrinsèquement bruyant à cause de petits volumes cellulaires et faible nombre de copies de réactifs importants. Bruit biologie se concentre souvent sur ​​les sources, le traitement, et les conséquences biologiques des fluctuations dans les populations, les concentrations, les positions, ou des états de molécules qui contrôlent les circuits et les réseaux 44 gènes. La grande majorité de ce travail a été effectué dans les systèmes cellulaires, ce qui a l&#39;avantage de voir le bruit d&#39;un circuit de gène dans le contexte naturel des réseaux génétiques dans la cellule. Cependant, les systèmes exempts de cellules permettent la caractérisation des fluctuations intrinsèques d&#39;un circuit de gène individuel sans les effets extrinsèques de confusion 18 qui ne peuvent pas être évités dans les systèmes cellulaires. Analyse du bruit peut donner des indications physiques importantes sur la façon dont sont structurés génétique circuits et comment ils fonctionnent, et a été utilisé dans les systèmes cellulaires pour caractériser négative et positive 25 <sup&gt; 27 autorégulation, extrinsèques et intrinsèques contributions au bruit d&#39;expression 18, et la transcription éclatement 45,46. Nous décrivons ici l&#39;étude d&#39;un système d&#39;expression acellulaire dans des dispositifs microfluidiques qui permettent le contrôle simultané de la taille du réacteur et initiation de temps de réaction, afin de mieux comprendre les rôles que l&#39;isolement et l&#39;encombrement 47,48 ont sur ​​le bruit de l&#39;expression des protéines intrinsèque sans les complications associées à des cellules vivantes. La caractéristique essentielle de la conception favorable est l&#39;intégration de réseaux de femtolitre-volume (échelle du micron) des chambres de réaction utilisées pour confiner les réactifs d&#39;un système d&#39;expression de protéine sans cellule, avec une «soupape de commande» membrane élastomère dans PDMS qui emprisonne le réactifs à une, &quot;temps zéro&quot; bien définie pour l&#39;initiation de réaction (figure 1). Ce contrôle permet la cinétique des réactions mises en jeu dans la synthèse des protéines à SSdû en temps réel avec une grande précision. En tant que tel, il est important de gérer réactifs exempts de cellules de sorte que la variabilité inter-expérimental est minimisée autant que possible. Ce contrôle permet d&#39;évaluer le bruit de structure de circuits génétiques exempts de cellules d&#39;une manière qui est analogue aux techniques précédemment utilisées pour évaluer l&#39;expression du gène dans des cellules vivantes. Comme réactifs utilisés dans les systèmes de CFPS peuvent être sensibles à cycles gel-dégel, il est important de garder les réactifs froid et minimiser le temps les réactifs passent décongélation sur de la glace. Il est recommandé de tester périodiquement l&#39;expression du système CFPS en vrac afin d&#39;identifier les changements dans les niveaux d&#39;expression au fil du temps - cela peut être fait dans une réaction de 10 à 15 pi dans un tube Eppendorf, ou dans un appareil comme un lecteur de microplaques , qui effectue plusieurs lectures au fil du temps pour capturer cinétique de réaction. Notant les temps de l&#39;âge et dégel des réactifs pour chaque expérience aidera lors du dépannage faible expression lNIVEAUXATTEINTSPARLEP ASSE. En outre, lors de l&#39;assemblage des réactifs de CFPS, il est important de noter que la réaction commence une fois qu&#39;il est complètement monté et retiré de la glace. Afin de maintenir un &quot;temps zéro&quot; compatibles, il est utile d&#39;enregistrer le temps suivant l&#39;initiation de la réaction de CFPS après l&#39;addition finale de l&#39;entrée de l&#39;ADN, et la réaction d&#39;appliquer le plus rapidement possible pour le dispositif incubé. Ce processus devrait prendre environ 4-5 min, et la fluorescence ne doit pas encore être visible dans les chambres de réaction. Ce contrôle assure que le temps disponible pour visualiser la partie de croissance de la courbe de réaction est maximisée. Avant d&#39;exécuter des réactions de CFPS sur l&#39;appareil, il est conseillé d&#39;effectuer des tests de contrôle de qualité afin de vérifier l&#39;absence de fuite dans les chambres. Un test peut être effectué FRAP (comme sur la figure 2D) par application d&#39;un fluorophore à l&#39;appareil et l&#39;exposition d&#39;un puits individuel jusqu&#39;à ce que le puits est entièrement blanchie. Si les chambres sontbien scellé, pas de reprise devrait être visible à l&#39;intérieur du puits - il devrait y avoir un contraste frappant entre les parois du compartiment et les espaces intérieurs et extérieurs. Si la récupération de fluorescence ressort ou les parois de la chambre de réaction ne est pas bien définie, la pression sur la vanne de commande doit être augmentée ou le dispositif doit être vérifiée pour les fuites ou la délamination de la lame de verre. Ce protocole a été testé avec des réactifs de CFPS d&#39;un E. commerciale Kit coli acellulaire expression de la protéine (à l&#39;échelle de 25 ul), bien que d&#39;autres systèmes de CFPS solide peuvent être utilisés. Il est possible d&#39;utiliser des volumes beaucoup plus bas que 25 pi lors de l&#39;application des réactions à l&#39;appareil, ce qui peut être utile lorsque le coût de réactif est un facteur limitant dans les expériences. Une fois que les réactifs sont ajoutés dans le dispositif et les chambres de réaction sont scellées, il ne est pas possible d&#39;ajouter des réactifs à la solution sans actionnement de la soupape de commande - par conséquent ce dispositif ne est pas suitable pour les réactions qui nécessitent l&#39;addition de réactifs au cours de la réaction. Ce dispositif est également pas optimisé pour l&#39;observation des réactions CFPS qui peut exécuter plus de trois heures - les effets de la déshydratation et le séchage de l&#39;appareil après cette période ne ont pas été évalués. Si de plus longues durées de réaction sont souhaités, ces effets peuvent être atténués par le dispositif d&#39;étanchéité pour éviter l&#39;évaporation, à modifier la température d&#39;incubation, ou en utilisant une chambre d&#39;humidité. Les modifications apportées à la conception de l&#39;appareil, telles que les structures nanoporeux dans les parois de la chambre 49,50 ou l&#39;inclusion d&#39;une couche de membrane poreuse, représentent quelques méthodes qui pourraient permettre l&#39;échange de réactifs et donc allonger les délais de réaction. Compartiments de réaction microfabriqués volume uniforme sont précieux pour le maintien des dimensions cohérentes à l&#39;échelle des expériences et très approprié pour enquête sur &quot;les réactions secondaires&quot; avec les parois du compartiment. Contrairement aux méthodes qui ne utilisent pastechniques n-usinée, ces réactions doivent être évalués en petit nombre, et ne fournissent pas la souplesse dimensionnelle lors des expériences. Cependant, la conception contrôlable pour ces chambres de réaction est très approprié pour la microscopie time-lapse, et peut être un complément d&#39;éclairage à une méthode à haut débit de l&#39;accouchement.

Systèmes exempts de cellules offrent une plate-forme simplifiée et flexible pour la visualisation des réactions biologiques exempt de facteurs de complication tels que le fitness, la division, et la mutation qui sont inévitables dans l&#39;étude des cellules vivantes. Ces approches ont été utilisées pour étudier des systèmes cellulaires, y compris la caractérisation de protéines de la membrane 1, le palpage de deux interactions de protéines, et l&#39;exploration des aspects fondamentaux de la traduction 7.3. Récemment systèmes exempts de cellules ont commencé à se implanter comme plates-formes viables pour la biologie synthétique 8-10. L&#39;appel de ces approches est qu&#39;elles libèrent la biologie synthétique du partage des ressources et «bruit extrinsèque» qui affecte la dynamique des réactions dans les cellules vivantes. Cependant des questions subsistent quant à la façon dont l&#39;environnement physique dans lequel les réactions sans cellules sont intégrées affecte la progression et les résultats de la réaction. Environnements de réaction sans cellules - environnem particulièrement limitéeparents qui se approchent volumes cellulaires pertinents - restent mal caractérisés. protéine cellulaire sans Synthèse (CFPS) est pensée conventionnelle comme étant &#39;échelle libre,&#39; présentant une cinétique équivalentes à travers une gamme de microlitre à des volumes de réaction litre échelle 11. Néanmoins, il a été démontré réactions de confinement à des volumes de l&#39;échelle cellulaire à affecter de manière significative les taux d&#39;expression de protéines 12. La nature stochastique de réactions sans cellules - d&#39;autant plus que ceux-ci approche systémique ou même aller au-dessous femtolitre volumes - peuvent être d&#39;une importance particulière. Le bruit dans l&#39;expression des gènes est un établissement fortement influencé par confinement que les volumes de petites cellules et de fortes densités de composants forcer un grand nombre de molécules importantes à des niveaux de population très faibles - par exemple, Escherichia coli limites dans un volume de 1 fl jusqu&#39;à 4300 polypeptides différents sous le contrôle inductible de plusieurs centaines de promoteurs différents 13. Ce bruit inhérent a été impliquée en tant que force d&#39;entraînement central dans de nombreux processus biologiques, y compris la chimiotaxie 14, la décision du VIH entre réplication active et la latence 15, la décision λ de phages entre la lyse et la lysogénie 16,17, et la décision de Bacillus subtillus entre compétence 17 et la sporulation. La biologie synthétique acellulaire fournit alors à la fois l&#39;occasion d&#39;explorer les propriétés stochastiques de circuits et de réseaux de gènes cellulaires, et manipuler ces comportements pour atteindre les objectifs technologiques spécifiques. Bien que le comportement de bruit des systèmes cellulaires a été bien étudié 18-27, il ya eu peu d&#39;exploration du comportement de bruit fondamentale des systèmes sans cellules 8, en particulier à l&#39;échelle cellulaire. Ici, nous présentons une plate-forme pour l&#39;étude des effets stochastiques dans la biologie synthétique acellulaire. Cette plate-forme contient microfabriquée réaction femtolitre échelle chambers qui peut être rapidement effectué la transition entre ouverte (diffusion libre dans et hors de la chambre) et fermées (réactifs confinés dans la chambre) états. Dans l&#39;état fermé, nous limitons la synthèse des protéines (CFPS) réactifs cellulaires sans exprimant une protéine fluorescente verte (GFP), et de suivre l&#39;expression des gènes en utilisant time-lapse microscopie de fluorescence 28 (Figure 1). Nous caractérisons cette environnement exempt de cellules en mesurant la structure des fluctuations stochastiques de l&#39;expression génique d&#39;une manière directement analogue à ceux utilisés pour caractériser des cellules 25. Les méthodes non-microfabrication pour confiner réactions acellulaires comprennent des vésicules et des liposomes 29-32, émulsions eau-dans-huile, 12 et 33 milieux poreux. Cependant, alors que ces méthodes peuvent fournir un contrôle sur la distribution de la taille des volumes confinés 34, les méthodes de microfabrication créent fonctionnalités très reproductibles avec des dimensions étroitement définis, même à l&#39;échelle nanométrique.En outre, ces structures rigides peuvent être facilement suivis dans le temps sans être sensibles à l&#39;évaporation ou des changements dans l&#39;environnement externe. Conceptions de conteneurs utilisés dans microfabriqués précédente 8,35 de travail ne peut pas sceller rapidement les chambres de réaction suite à l&#39;initiation de la réaction, ce qui complique l&#39;attribution claire de l&#39;époque où la réaction a été lancé (temps zéro). Utilisation de la méthode présentée ici, seulement 4 à 5 min est nécessaire entre le début et la visualisation de la réaction de l&#39;appareil, fournissant ainsi un «temps zéro» bien définie. Les protocoles suivants décrivent les procédés de fabrication et de tester cet appareil, y compris la lithographie optique, l&#39;assemblage de l&#39;appareil, les tests de l&#39;appareil, et les méthodes pour l&#39;analyse d&#39;image.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="526">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:151px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:107px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Thinner</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360 FLUKA</td>
			<td>Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm hole-puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15072</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">23 ga needles blunt tip</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-231PL-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#0 glass coverslip</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>260366</td>
			<td>Gold Seal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse TE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD camera</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>CoolSNAP-HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shutter</td>
			<td>Shutter Insturment</td>
			<td>Lambda SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Color Filters</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td colspan="2">ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x oil-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N.A. 1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Regulator</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>H201-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph</td>
			<td>Universal Imaging Corp.</td>
			<td>Version 7.8.3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marsh Bellofram transducers</td>
			<td>Marsh Bellofram</td>
			<td>T2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 gauge PTFE tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/SWTT-24-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Septum vials</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>C4015- 17W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power Supply</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td colspan="2">6205B Dual DC Power Supply</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sharp 23 ga needles</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Male-to-male luer lock adapters</td>
			<td>Qosina</td>
			<td>20024</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga.</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-232PL-5C</td>
			<td>Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S30 E coli protein expression system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pet3a-GFP vector/protein</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69418-3</td>
			<td>Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#732-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 555</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>AF555</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.46r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: Time Series Analyzer</td>
			<td>Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>Version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: StackReg/TurboReg</td>
			<td>Ecole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne Biomedical Imaging Group</td>
			<td>Distribution is dated July 7, 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: ROI Manager Tools</td>
			<td>Tiago Ferreira</td>
			<td>12/15/2013 Version</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology

Systèmes exempts de cellules fournissent une plate-forme flexible pour sonder des réseaux spécifiques de réactions biologiques isolés du partage des ressources complexe (par exemple, l&#39;expression globale des gènes, la division cellulaire) rencontré dans les cellules vivantes. Cependant, de tels systèmes, utilisés dans les réacteurs classiques en vrac macro-échelle, omettent souvent de présenter les comportements dynamiques et efficacité caractéristiques de leurs homologues de vie micro-échelle. Comprendre l&#39;impact de la structure interne de la cellule et l&#39;échelle sur la dynamique de réaction est cruciale pour comprendre les réseaux complexes de gènes. Nous rapportons ici un dispositif microfabriqué qui confine réactions acellulaires des volumes à l&#39;échelle cellulaire tout en permettant la caractérisation flexible du système moléculaire clos. Ce poly multi-couche (diméthylsiloxane) (PDMS) contient dispositif chambres de réaction femtolitre échelle sur une membrane élastomère pouvant être actionné (ouverte et fermée). Lorsqu&#39;il est actionné, les chambres confinent protéine cellulaire sans synthèse (CFPS) réactionsexprimant une protéine fluorescente, ce qui permet la visualisation de la cinétique de réaction au cours du temps en utilisant la microscopie time-lapse fluorescente. Ici, nous montrons comment ce dispositif peut être utilisé pour mesurer la structure de bruit de réactions CFPS d&#39;une manière qui est directement analogue à ceux utilisés pour caractériser des systèmes cellulaires, ce qui permet l&#39;utilisation de techniques bruit de biologie utilisés dans les systèmes cellulaires de caractériser circuits de gènes CFPS et leurs interactions avec l&#39;environnement exempt de cellules.

L&#39;avantage de cette plate-forme est microfabriqué à l&#39;application commandée de l&#39;élastomère &quot;soupape de commande&quot; qui est actionné de manière indépendante afin de limiter les réactions CFPS (Figure 2A). Lorsque le dispositif est actionné, les chambres à membrane sont pressées contre la lame de verre pour confiner réactifs fluorescents dans un réseau de chambres de réaction (figure 2C). Afin de vérifier que les chambres limitent de manière fiable la réaction pendant toute la durée de l&#39;expérience, une base FRAP (Fluorescence Recovery après photoblanchiment) test a été effectué 37. Un fluorophore (AF 555) a été appliqué au dispositif, et la soupape de commande a été actionné; en utilisant l&#39;ouverture de l&#39;obturateur du microscope, un seul puits confiner le fluorophore a été isolé et décolorées individuellement (figure 2D). Le bien choisi est devenu sombre et ne pas récupérer la luminosité jusqu&#39;à ce que la vanne de commande a été dépressurisé 20 min60, plus tard, libérant la chambre de la vitre. Ce test vérifie que ces chambres de réaction restent bien fermés pendant la durée de l&#39;expérience. Dans des conditions optimales, une réaction de CFPS exprimant une protéine facile à visualiser (comme la GFP ou luciférase) exprime la protéine détectable en quelques minutes après avoir été appliqué à ce dispositif. Pendant la durée de la réaction, la synthèse des protéines à l&#39;intérieur et l&#39;extérieur des chambres de réaction est imagée et quantifiée par des unités de mesure de l&#39;intensité de fluorescence à l&#39;intérieur de chaque chambre (Figure 3A). L&#39;intensité de fluorescence, correspondant à la concentration en protéine, peut être mise en correspondance avec le temps de chaque chambre de réaction (figure 3D). L&#39;expression des gènes est un processus intrinsèquement stochastique qui introduit fluctuations (bruit) à chaque étape moléculaire (synthèse, la dégradation, la protéine de liaison ADN, etc.) 20. Une branche de la biologie se concentre sur le bruitla valeur probante de gène bruit de circuit 41. L&#39;expression dans des systèmes exempts de cellule aura des effets de bruit extrinsèques qui découlent des interactions entre le mécanisme moléculaire d&#39;expression et les surfaces qui définissent les limites des récipients de réaction. Ces effets extrinsèques deviendront probablement plus prononcé que les réactions sans cellules sont confinées en plus petits chambres de réaction. La possibilité d&#39;effectuer imagerie time-lapse de multiples réactions de CFPS confinés permet ensuite l&#39;analyse minutieuse de la structure de bruit (ampleur et la dynamique) dans les systèmes exempts de cellules confinés d&#39;une manière directement analogue à des méthodes qui ont été rapportés pour les systèmes cellulaires 25. Figure 3C et 3D montrent les cours à temps de l&#39;expression de GFP constitutive d&#39;un promoteur T7 dans une microplaque 384 puits standard avec un volume de puits de 15 ul, par rapport au PDMS chambres de réaction 10 um de diamètre, correspondant à des volumes de seulement environ 300 fl, à propos de sept pours de grandeur moins. La variabilité des taux d&#39;expression de protéines dans les 10 um chambres de réaction est beaucoup plus élevé que dans les mesures de plaques à puits, se approchant de celles observées dans les cellules. Réactions multiplexées effectuées sur le dispositif présentent une cinétique similaire de réactions CFPS effectuées en vrac sur un lecteur de microplaques (figure 3B), où il ya une augmentation rapide de la fluorescence qui plateaux, souvent supposés être causée par la limitation des ressources dans le volume de réaction 42,43 . Ce comportement de croissance déterministe, bien que fluctuant, est généralement uniforme chambres de réaction, et entre les expériences - en faisant la moyenne des traces entre les chambres à travers des expériences, la tendance déterministe peut être soustrait les valeurs de trace, ne laissant que les composantes de bruit de la réaction (figure 4A) . La figure 4B montre le bruit de l&#39;expression de GFP après élimination du composant transitoire déterministe (en haut), Et l&#39;autocorrélation du bruit (en bas), tandis que la figure 4A montre les traces correspondantes dans les 10 chambres de réaction um. La distribution dans les demi-vies des traces d&#39;autocorrélation donne la dépendance de fréquence du bruit de zéro alors que le temps de latence des traces d&#39;autocorrélation donne les amplitudes du bruit, comme la variance. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig1.jpg" /> Figure 1. réactifs synthèse des protéines cellulaires-gratuit sont confinés dans femtolitre chambres de réaction à grande échelle dans le but de mesurer le bruit de l&#39;expression des gènes. Réactifs à partir d&#39;un système d&#39;expression de protéines sans cellule commerciale sont utilisés pour expriment constitutivement GFP intérieur confiné PDMS chambres de réaction. Un tableau de ces chambres peut être visualisée avec time-lapse microscopie à fluorescence pour caractériser l&#39;expression des protéines et le bruit de l&#39;expression des gènes. L&#39;intensité de fluorescence of chaque chambre de réaction dans le temps peut être tracé comme une trace individuelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig2.jpg" /> Figure 2. Fabrication de deux couches dispositif microfluidique avec les chambres femtolitre échelle refermable. (A) Mise en page et vue éclatée de couches de dispositif. Le dispositif est composé de deux couches de PDMS et d&#39;une lamelle de verre. La membrane PDMS, scellée entre les couches de verre et de vanne de contrôle, contenant les chambres de réaction. (B) image MEB de la chambre de réaction PDMS. Le diamètre intérieur est de 10 um. (C) Schéma de canaux d&#39;entrée dans l&#39;appareil. protéine cellulaire sans Synthèse (CFPS) réactifs sont transportés à travers le canal de réaction. L&#39;eau est sous pression dans le contrôlevanne pour comprimer les chambres de réaction contre la lame de verre, l&#39;étanchéité des chambres 37. Reproduit de Réf. 37 avec la permission du Royal Society of Chemistry. (D) Récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) test sur ​​un seul puits en utilisant FITC indique chambre est bien scellé contre l&#39;environnement externe. Le fluorophore a été capturé dans les chambres (image supérieure) et un seul puits a été décolorées (image du bas). Aucune récupération de fluorescence a été observée dans la chambre décolorées jusqu&#39;à la vanne de commande a été libéré. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig2large.jpg" target="_blank">​​Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig3.jpg" /> Figure 3. EGFP expression dans confiné Reaction Cell-gratuit. (A) des images de fluorescence de réaction scellée c<html> HAMBERS à des moments choisis dans la réaction. La production de protéines peut être considérée à la fois à l&#39;intérieur des chambres de réaction et à l&#39;extérieur des chambres dans le canal principal. (B) de l&#39;EGFP a été clone dans un vecteur pET3a, fournissant un promoteur de polymerase de T7 et le terminateur et un site de liaison forte de ribosome (RBS). (C) des mesures de fluorescence normalisée de l&#39;expression constitutive de la EGFP dans une réaction acellulaire vrac effectuée dans un lecteur de microplaques. CFPS réactions produisent habituellement des protéines rapidement avant de ralentir à une fluorescence &#39;état stable&#39; - ceci est associé à la limitation des ressources 43. Tirets noirs indiquent la trace moyenne. (D) de fluorescence normalisée de traces 51 d&#39;intensité de fluorescence brutes lues à partir de 51 chambres de réaction au cours de plusieurs expériences. Tirets noirs indiquent la trace moyenne sur plusieurs expériences qui illustrent la composante déterministe de l&#39;expression de la protéine./52616/52616fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig4.jpg" /> Figure 4. Traces individuelles de bruit et le bruit Autocorrelation d&#39;un système cellulaire et cellulaire gratuit. (A) From Austin et al., 2006. bruit dans l&#39;expression de la GFP (en haut) et les fonctions d&#39;auto-corrélation normalisés (en bas) acquis auprès de suivi de la production de la GFP dans les bactéries 25 vivre. Reproduit avec la permission de Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), le droit d&#39;auteur (2006). (B) Le bruit dans l&#39;expression de la GFP (en haut) et les fonctions d&#39;auto-corrélation normalisés (en bas) acquises de la production de la GFP dans le système acellulaire, suivi dans microfluidiques chambres de réaction de l&#39;appareil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig4highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît, cliquez ici</a>pour voir une version plus grande de cette figure.

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Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Tableaux Scellable femtolitre Chambre pour la biologie acellulaire

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

sealable-femtoliter-chamber-arrays-for-cell-free-biology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K vues.  University of Tennessee, Knoxville. A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Vidéo: Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

L&#39;encapsulation de transcription cellulaire et sans traduction machines dans des vésicules pour la construction de Mimics cellulaires

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Recherche

Bio-ingénierie

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A general protocol is described for the preparation of V. natriegens crude cell extracts using common laboratory equipment. This high yielding protocol has been specifically optimized for user accessibility and reduced cost. Cell-free protein synthesis (CFPS) can be carried out in small scale 10 &#956;L batch reactions in either a 96- or 384-well format and reproducibly yields concentrations of &#62; 260 &#956;g/mL super folder GFP (sfGFP) within 3 h. Overall, crude cell extract preparation and CFPS can be achieved in 1&#8722;2 full days by a single user. This protocol can be easily integrated into existing protein synthesis pipelines to facilitate advances in bio-production and synthetic biology applications.

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free expression systems are powerful and cost-efficient tools for the high-throughput synthesis and screening of important proteins. Here, we describe the preparation of cell-free protein expression system using Vibrio natriegens for the rapid protein production using plasmid DNA, linear DNA, and mRNA template.

Acellulaire Protein Expression utilisant la rapide croissance bactérie Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Une plate-forme microfluidique multicouche pour la conduite d'une expression génique prolongée sans cellules

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

OnePot PURE Cell-Free System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic biology. Unfortunately, commercially available systems are costly, and their tunability is limited. In comparison, a home-made approach can be customized based on user needs. However, the preparation of home-made systems is time-consuming and arduous due to the need for ribosomes as well as 36 medium scale protein purifications. Streamlining protein purification by coculturing and co-purification allows for minimizing time and labor requirements. Here, we present an easy, adjustable, time- and cost-effective method to produce all PURE system components within 1 week, using standard laboratory equipment. Moreover, the performance of the OnePot PURE is comparable to commercially available systems. The OnePot PURE preparation method expands the accessibility of the PURE system to more laboratories due to its simplicity and cost-effectiveness.

We present a fast and cost-effective method to produce the recombinant PURE cell-free TX-TL system using standard laboratory equipment.

Système onePot PURE sans cellule

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Méthodes enzymatiques rapides pour l’amplification de modèles linéaires minimaux pour le prototypage de protéines à l’aide de systèmes sans cellules

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the fine-tuning of genetic circuits, such that their function results in predictable outcomes. With the growth of synthetic biology as a field, there has been an explosion of genetic circuits that have been implemented in microbes to execute functions pertaining to sensing, metabolic alteration, and cellular computing. Here, we show a rapid and cost-effective method for characterizing genetic parts. Our method utilizes cell-free lysate, prepared in-house as a medium to evaluate parts via the expression of a reporter protein. Template DNA is prepared by PCR amplification using inexpensive primers to add variant parts to the reporter gene, and the template is added to the reaction as linear DNA without cloning. Parts that can be added in this way include promoters, operators, ribosome binding sites, insulators, and terminators. This approach, combined with the incorporation of an acoustic liquid handler and 384-well plates, allows the user to carry out high-throughput evaluations of genetic parts in a single day. By comparison, cell-based screening approaches require time-consuming cloning and have longer testing times due to overnight culture and culture density normalization steps. Further, working in cell-free lysate allows the user to exact tighter control over the expression conditions through the addition of exogenous components and DNA at precise concentrations. Results obtained from cell-free screening can be used directly in applications of cell-free systems or, in some cases, as a way to predict function in whole cells.

Well-characterized genetic parts are necessary for the design of novel genetic circuits. Here we describe a cost-effective, high-throughput method for rapidly characterizing genetic parts. Our method reduces cost and time by combining cell-free lysates, linear DNA to avoid cloning, and acoustic liquid handling to increase throughput and reduce reaction volumes.

Caractérisation rapide de parties génétiques avec des systèmes acellulaires

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.