We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Cihaz Masters 1. Optik Litografi <ol><li> En az 1 saat ~ 250 ° C&#39;de sıcak plaka temiz silikon gofret kurutmak. NOT: Bu kullanıcı hatası durumunda, master hazırlarken birden fazla gofretin kullanmak iyi bir uygulamadır. </li><li> Fotodirenç alikotları hazırlayın. Kullanarak 1 oranında seyreltici olarak SU-8 tiner: 2015 SU-8 ışığa ve 2 SU-8 2015 fotorezist bir seyreltme hem hacimde hazırlayın. Not: Yaklaşık fotodirenç 1 mi spin kaplama, bir çok ince bisküvi için gereklidir. </li><li> Bu ustalar üretilmesi için üç maskelenmesi hazırlayın. Bir desenlendirme membran kanal ve diğer desenlendirme reaksiyon odaları: Membran Master, iki maske hazırlayın. Kontrol Vanası master, tek bir maske deseni hazırlamak. NOT: Maske desenleme dahil taşbaskı teknikleri hakkında daha fazla bilgi için, cihaz tasarımı daha ayrıntılı bilgi için Ito ve Okazaki, 2000. 36 Bkz Fowlkes ve Collier, 2013 bakınız 37. </li><li> Membran Usta hazırlayın <ol><li> Spin-kat 2: 45 saniye boyunca 1.000 rpm&#39;de gofret 1 SU-8 2015 fotorezist seyreltme. </li><li> 2 dakika boyunca 95 ° C &#39;de yumuşak fırında gofret. Bir kişi hizalama kullanılarak, 10 saniye süre ile membran kanal desenli gofret maruz ve 95 ° C&#39;de 2 dakika boyunca bir maruziyet sonrası fırında gerçekleştirin. </li><li> 1 dakika için SU-8 geliştirici gofret geliştirin, ya fotodirenç kalıntı kaldırılıncaya kadar. Yukarıdan aşağıya doğru hareket, izopropanol ile gofret durulayın. Tekrar yukarıdan aşağıya hareket eden azot ile kuru gofret,. 4 dakika boyunca 180 ° C&#39;de fırında gofret. </li><li> 45 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de 1 SU-8 seyreltme spin-kat 2 ile tekrar gofret desenli. </li><li> Yumuşak fırında 95 ° C&#39;de 2 dakika boyunca gofret desenli. Iletişim hizalama kullanarak, tepkime haznesi desenli desenli gofret uyum ve 10 saniye maruz kalmaktadır. 95 ° C&#39;de 2 dakika süreyle maruz kalma sonrası fırında yapın. </li><li> Aşama 1.4.3 tarif edildiği gibi gofret geliştirir. 4 dakika boyunca 180 ° C &#39;de gofret, fırında gofret geliştirilmesi ve kurutma sonrasında. NOT: gofret önceki aşamada kullanılan aynı geliştirici geliştirilebilir. </li></ol></li><li> Kontrol Vanası Usta hazırlayın <ol><li> Spin-kat 45 saniye boyunca 2.000 rpm&#39;de temiz gofret üzerine SU-8 fotorezist inceltilmiş. </li><li> 6 dakika boyunca 95 ° C &#39;de yumuşak fırında gofret. Bir kişi hizalama kullanarak, 10 saniye boyunca kontrol vanası desenli gofret maruz. 6 dakika boyunca 95 ° C &#39;de bir maruziyet sonrası fırında yapın. </li><li> 2 dakika için SU-8 Developer gofret geliştirin, ya da artık kaldırılıncaya kadar. Yukarıdan aşağıya doğru hareket, izopropanol ile durulayın. 4 dakika boyunca 180 ° C&#39;de, nitrojen ve fırında Kuru gofret. </li></ol></li></ol> 2. PDMS Cihaz İmalatı <ol><li> Buhar biriktirme ile 0.2 mi trimetilklorsilan ~ Tüm ustaları Silanize. <ol><li> Hızla Silanizing ajanı birkaç damla ile oda sıcaklığında hava geçirmez bir kapta usta içine. NOT:. Diğer Silanizing protokolleri kabul edilebilir 38 ise yapılan properly PDMS kaldırmak kolay olacaktır. </li></ol></li><li> Içindeki çok katmanlı valfın gösterilmiştir olarak 39 tasarımları, cihazın membranı ve kontrol valfı katmanları için farklı oranlarda bir ticari poli (dimetilsiloksan) (PDMS) tabanı ve sertleştirme ajanı karıştırılır. 1 ve 5: baz oranı 1: 20 kullanarak zar ve kontrol valfı kalıplar için sertleştirme maddesi olarak bulunmuştur. <ol><li> Membran kalıp için, sertleştirme maddesi, 0.5 g baz, 10 g karıştırılır. NOT: Bu birim zar ustası üzerine spin-kaplı olacaktır. </li><li> : 1 oranında kontrol vanası kalıp, bir 5 taban ve sertleştirme ajanı karıştırılır. Kontrol vanası ustası tutmak için kullanılan kap bağlıdır kontrol vanası kalıp gerekli PDMS miktarı; ana PDMS ~ 1 cm ile kaplanmış şekilde doldurunuz. </li></ol></li><li> İyice hava kabarcıkları görebilir kadar her ikisi de bir vakum odası içinde preparatlar ve de-gaz bunları PDMS karıştırın. Isıya dayanıklı kontrol valfi ana yerleştirinkutu, bir cam tabak gibi. 1 oranında Master üzerinde PDMS ve de-gaz kabı ikinci kez: dikkatlice 5 dökün. </li><li> Kontrol vanası PDMS konteyner de-gassed edilirken, spin-kat 20: dikkatle hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için zar ustası üzerine PDMS karışımı dökerek membran yöneticisinde 1 oranında PDMS, daha sonra spin-kaplama usta 1,000 rpm&#39;de 45 saniye boyunca karıştırılmıştır. </li><li> Kısmen zar ana 6 dakika ve kontrol valfı ana için 15 dakika boyunca 80 ° C&#39;de bir fırın içinde, her iki ustaları tedavi. NOT: Kısmen tedavi zaman PDMS şeklini tutmak gerekir, ama malzeme biraz pejmürde olacaktır. PDMS henüz tedavi değilse basıldığında malzeme şeklini tutar kadar bir seferde bir kaç dakika artışlarla tekrar pişirin. </li><li> Uzakta yavaşça kalıp soyma, kontrol vanası ustadan dikdörtgen PDMS kalıplar kesin. 0.75 mm delik yumruk kullanarak kalıplı bileşeni aracılığıyla giriş delikler. NOT: delik 23 birimlik bir blun sokulmasıyla temizlenebilirGerekirse t ucu iğne ve kalıp dış, selofan bant ile temizlenebilir. </li><li> Membran yöneticisinde reaksiyon odaları bulmak tepkime haznesi membran özellikleri ile kontrol vanası kalıp bileşeni hizalayın ve membran ustanın üstüne doğrudan kontrol vanası bileşeni yerleştirmek için bir optik mikroskop kullanarak. Cihazın sol alt köşesine kontrol vanası girişini yönlendirmek ve reaksiyon odaları ve membran master kanal dikdörtgen kontrol vanası içinde görünür olduğundan emin olun. </li><li> 2 saat süre ile 80 ° C &#39;de hizalanmış kalıp bileşenleri pişirilir. NOT: membran ve kontrol vanası kalıpları şimdi birlikte mühürlü ve bir kalıp olarak manipüle edilecek. </li><li> Membran delmek için değil bu yüzden çok yavaşça ustadan kalıp soyma, uzak zar ustadan katmanlı PDMS kalıp kesin. </li><li> Giriş Punch ve 0.75 mm delik yumruk kullanarak hücre ekstresi girişi için delik çıkış. Her iki katmanları üzerinden delikler,Aşama 2.6 de tarif edildiği gibi aynı şekilde temizleyin. </li><li> Bir indüktif eşleşmiş plazma-temizleyici, plazma tedavi hem kalıp (membran tarafı yukarı) ve 20 saniye boyunca 10.5 W bir numaralı 0 cam lamel kullanma. Hemen plazma temizleyici lamel ve kalıp çıkarmak ve cam ve kalıp arasındaki hava cepleri en aza indirmek için çalışırken, cama doğru, membran tarafı bileşenleri katman. Membran giriş kanalı doğrudan basmayın, ya da zar zor reaktanları ile kanal doldurmak için yapım, cam tavlama olabilir. <ol><li> Cam katmanı kesilmesini önlemek için monte aygıtları tutarken özel özen gösterin. Cihaz yüksek büyütme yağ daldırma hedefleri kullanılarak cam lamel ile görüntülü gerekir gibi ince cam lamelleri kullanın - cam çok kalın ise, cihaz özellikleri görünür olmayabilir. </li></ol></li><li> Son olarak, 2 saat süre ile 80 ° C&#39;de tamamlanır cihazları tedavi. </li></ol> 3. Deneysel Kurulum foR Hücresiz protein sentezi Reaksiyon <ol><li> 1 saat boyunca deiyonize edilmiş su içinde kaynayan bir cihaz hidratı. NOT: Tamamen sulu Aygıt bulutlu bir görünüm olmalıdır. Cihaz, aynı zamanda hidrat için oda sıcaklığında steril su içinde O / N bırakılabilir. </li><li> Bir inkübasyon odası bir ters mikroskop kullanılarak, 30 ° C çevre sıcaklığı ayarlayın. NOT: Bu sıcaklık, böylece diğer reaksiyonlar için en uygun sıcaklıklar 40 değişebilir, bir T7 promotörü ile GFP ekspresyonu optimize etmek üzere seçilmiştir. </li><li> Dağı cihaz selofan bant ile sahne tutucu mikroskop ve yerel hidrasyon korumak için ıslak kağıt mendil ile cihazın kenarları sarmak için. </li><li> Kontrol valf harekete ve reaktif girişi için azot gazı basıncı modüle iki yüksek hassasiyetli kapalı-çevrim gerilim basınç dönüştürücüler kullanın. NOT: diğer atıl gazlar kullanılabilmektedir ama bu protokol, sadece düşük saflıkta azot ile test edilmiştir. <ol><li> Ilk dönüştürücüyü bağlayınBir septum kapak ile 4 ml bir cam şişe içinde tutulan bir su deposu 24 gauge PTFE tüp. Bir 23 gauge küt uçlu iğne ile sonlanan bir ikinci tüp kullanarak kontrol valfı girişine rezervuar bağlayın. NOT: Her iki tüpler iki keskin 23 gauge iğne ile rezervuar septum nüfuz. </li><li> Bir erkek-erkek Luer-lok konnektörüne bağlı 24 ayar PTFE tüp ikinci transdüser bağlayın. Her cihaz için ayrı ayrı monte başka 23 göstergesi künt uçlu iğne ile tüp bağlı bir Luer-lok 23 gauge iğne bu takın. Bu iğne, membran tepkime kanalına bağlar; Reaksiyon kanalı ve giriş reaktif su temizlemek için kullanın. </li></ol></li><li> Bir hücresiz protein sentezleme sistemi kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre, buz üzerinde Çağrıları reaksiyon bileşenleri bir araya getirin. Buz üzerinde Teklif Çağrılarını reaktifleri tutan harcanan zamanı en aza indirmek ve montajdan sonra hemen cihaza reaksiyonu yerleştirin. NOT: Bu cihaz olmuşturticari bir E. kullanılabilir E. coli protein ifadesi seti ve yapısal olarak GFP ifade eden bir plazmid elde. Toplam reaksiyon hacmi 25 ul&#39;ye ayarlandı - bu arzu edildiği takdirde, reaksiyona giren maddeler için daha düşük bir hacim kullanmak mümkün olabilir. Teklif Çağrılarını reaktifler donma-erime döngüleri duyarlı olma eğilimi gibi, deney öncesinde uygun hacimde reaktif numunelerinin yapmak yararlı olabilir. Diğer reaktif maddeler, reaksiyon karışımına ilave edilebilir, ama reaksiyon tam olarak cihaz üzerine tatbik edilmeden önce monte edilmelidir. <ol><li> Geçen DNA girişi ekleyerek, reaksiyonu birleştirin. Not: bir Eppendorf tüpü içinde bir araya sonra buz üzerinde tutulmuştur takdirde Çağrıları reaksiyon başlar. Bu sorun giderme tutarlı deneyler arasındaki zaman ölçeği ve yardım tutacak - Zaman cihaza reaktifler uygulamak ve deney değişebilir başlamak için alınan beri reaksiyon monte ve karıştırılır sonra, bir zamanlayıcı başlatmak için yararlı olduğunu. </li></ol></li><li> KullanmaAşama 3.4.2 anlatılan boru ve iğne konektörü, bir 1 ml şırınga ile bir tüp içine monte reaksiyon geri. Reaksiyon odası girişine künt ucu iğne takın. Şırınga, iğne konnektörünü ayırın ve reaksiyon odası dönüştürücü için kullanılan erkek-erkek konnektörüne takın. </li><li> Kanalı doldurmak için Çağrıları reaktanlar basınç (&lt;10 psi) uygulanır. Reaksiyon dolduğunda iğne çıkarın. </li><li> Kontrol vanası girişine diğer transduserden künt tüp yerleştirin. Henüz kontrol vanası basınç etmeyin. </li><li> Sahnede monte cihazı yerleştirin. Aydınlık görüntüleme kullanarak, bir 100X yağ daldırma amacı ile reaksiyon odaları bulun. </li><li> Harekete geçirir 20 psi kontrol vanası transdüser tazyikli tarafından kontrol vanası; Kontrol valfı harekete geçirildiği zaman zarda gözle görülür bir değişiklik belirgin olacaktır. Reaksiyon odalarının dipleri odaklanın. </li><li> Görüntü elde etme başlayın; floresanstaki artış ağırlıkbüyük olasılıkla reaksiyonun erken dönemlerinde belirgin olmayacak olsa hasta, iç ve reaksiyon odalarının dış çevresinde görülebilir. Reaksiyon kararlı durum floresan ulaşıncaya kadar her 1-3 dk görüntüleri yakalayın. Otomatik odaklama aşaması mevcut değilse, kısaca görüntüler atılıyor önce her görüntüyü yönlendirmesi. NOT: Bazı photobleaching meydana olsa nedeniyle photobleaching göre floresan üzerindeki etkileri sürece photobleaching oranı bilindiği gibi hesaba olabilir. Bu ışıkla ağartma hızı belirli bir süre boyunca sabit bir ışıkla ağartma tür GFP bilinen bir konsantrasyonda ya da florofor karışımı gibi bir floresan standart, maruz bırakılması ile tahmin edilebilir. </li><li> Edinilen ilk görüntüye tepki düzeneğinden geçen zamanını kaydedin. NOT: Bu genellikle 4-5 dakika sürer. </li></ol> 4. Görüntü Analizi ve Veri İşleme <ol><li> Böyle ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak seçinBir ROI olarak reaksiyon odalarının iç. Tüm resimler için ROI ortalama floresan yoğunluğu değerini kazanır. NOT: Bu ham floresan yoğunluğu izidir. <ol><li> Her reaksiyon haznesinin iç çevresinde ilgi bölgeleri seçmek için kullanın Zaman Serisi Analyzer - Zaman Serisi Analyzer ve ROI Müdürü eklentileri kullanarak ImageJ Bu görevi gerçekleştirmek. Her reaksiyon odasının iç tekabül eden bir alana &quot;AutoROIProperties&quot; Set &quot;tıklayın On ekle&quot; onay ve her odayı seçin. NOT: Bu adım aynı zamanda floresan odasının etrafında bir ROI çizmek için elips aracını kullanarak yapılabilir. Bu ROI boyutu genellikle 100X amacı ile inceledi 10 mikron çaplı odası için 30 x 30 piksel elips karşılık gelir. </li><li> ROI Yöneticisi tüm ROI&#39;leri vurgulayın. Tüm görüntü yığını içinden her ROI floresan yoğunluğu ortalama belirlemek için &quot;Çok Tedbir&quot; işlevini kullanın. NOT: Sta adında bir eklentickReg gerekirse, görüntü yığını hizalamak için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Bir deneyde tüm odaları için ham floresan yoğunluğu izlerini aldıktan sonra, tüm izleri arasında inter-deneysel ortalaması alınarak, bireysel ham izlerinden ortalama çıkarılarak reaksiyon deterministik bileşeni belirlemek. Böyle bu analiz için Igor veya MS Excel gibi kullanın veri analiz yazılımı. NOT: Bu gürültü sağladığı reaksiyon odası için izler. </li><li> Hücreler 25 türetilen gen sentezleme gürültü analiz etmek için kullanılan aynı usuller kullanılarak, bu tepkime hazneleri gen ifadesi gürültü analiz edin. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücrelerinde gen ifadesi nedeniyle küçük hücresel hacimleri ve önemli reaktanları düşük kopya numaraları doğal gürültülü. Gürültü biyoloji genellikle kaynaklar, işlenmesi ve gen devreleri ve ağları 44 kontrol moleküllerin nüfus konsantrasyonlarda, pozisyonları, ya da devletlerin dalgalanmaların biyolojik sonuçları üzerinde duruluyor. Bu çalışmanın büyük bölümü, hücre içindeki genetik ağların doğal kapsamında bir gen devresinin gürültü görüntüleme avantajı hücresel sistemlerde gerçekleştirilmiştir. Fakat, hücre içermeyen sistemler hücresel sistemlerde önlenemez karıştırıcı dış etkilere 18 olmadan tek bir gen devresinin iç dalgalanmaların karakterizasyonu sağlar. Gürültü analizi, işleyişi, genetik devreleri yapılandırılmıştır ve nasıl içine önemli fiziksel anlayışlar sunabilir, negatif ve pozitif 25 karakterize hücresel sistemlerde kullanılan olmuştur <sup&gt; 27 otoregülasyon, dışsal ve 45,46 patlama ifade gürültü 18, ve transkripsiyonel içsel katkıları. Burada daha iyi tutulmasının ve 47,48 sıkıştırmadan asli protein sentezleme gürültü sahip rolleri anlamak için, reaktör büyüklüğü ve reaksiyon başlatma kez aynı anda kontrol edilmesini sağlamak mikroakışkan cihazlarda, hücre içermeyen bir ekspresyon sisteminin çalışmasını anlatmaktadır canlı hücreler ile bağlantılı komplikasyonları. tasarımın özelliği veren temel femtoliter hacim (mikron çaplı) yakalar PDMS elastomerik &quot;kontrol valfi&quot; membran, bir hücre serbest protein sentezleme sisteminin, reaktanların sınırlandırılması için kullanılan reaksiyon odaları dizilerinin entegrasyonu Reaksiyon başlatılması için iyi tanımlanmış bir &quot;sıfır zamanında&quot; de reaktifler (Şekil 1). Bu kontrol, protein sentezinde yer alan reaksiyonlar kinetik foll sağlaryüksek hassasiyet ile gerçek zamanlı olarak borçlu. Arası deneysel değişkenliği mümkün olduğunca en aza indirgenmesi için Bunun gibi, hücre içermeyen reaktiflerin idare etmek önemlidir. Bu kontrol bize teknikleri, daha önce canlı hücre içinde gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılan benzer bir şekilde, hücre içermeyen bir genetik devrelerin gürültü yapısının ölçülmesine olanak vermektedir. Çağrıları sistemlerinde kullanılan reaktanlar donma-erime döngüleri duyarlı olabileceği için, reaktiflerin, buz üzerinde çözülmesi için harcadıkları zamanı soğuk reaktantları tutmak ve en aza indirmek için önemlidir. Periyodik zaman içinde ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için, toplu olarak Çağrıları sisteminin ifadeyi test etmek için iyi bir uygulama - bu, bir Eppendorf tüpü içinde 10-15 ml&#39;lik bir reaksiyon yapılır ya da bir mikro-plaka okuyucu gibi bir cihaz olabilir , birden gerçekleştirir reaksiyon kinetiği yakalamak için zamanla okur. Düşük ifade l sorun giderirken her deneyde girenler yaş ve çözülme sürelerini kaydeden yardımcı olacaktırdüzeyleri,. Çağrıları reaktifleri montaj Bundan başka, bu da tam olarak monte edilmiş ve buz çıkartıldıktan sonra, reaksiyon başlar dikkat etmek önemlidir. Tutarlı &quot;bir zaman sıfır&quot; korumak için, DNA girişi son ilavesinden sonra programdan hibe reaksiyonun başlatılması aşağıdaki süresini kaydetmek için, ve kuluçkaya cihaza mümkün olduğunca çabuk reaksiyonu uygulamak yararlı olacaktır. Bu işlem yaklaşık 4-5 dakika sürer, ve floresan henüz reaksiyon odaları içinde görünür olmamalıdır. Bu kontrol tepkime eğrisinin büyüme kısmı görselleştirmek için uygun zaman maksimum olmasını sağlar. Cihazda Teklif Çağrılarını reaksiyonları çalıştırmadan önce, kalite-kontrol testleri odalarından hiçbir sızıntı olduğunu doğrulamak için çalıştırmak için tavsiye edilir. Bir sıkı bağlamak test cihazı için bir flüorofor uygulanması ve de tamamen ağartılmış kadar bağımsız bir kuyu maruz bırakılması ile (Şekil 2B gibi) gerçekleştirilebilir. Fonksiyonlu odalar olması durumundabölmenin duvarları ve iç ve dış mekanlar arasında bir tezat var olmalı - hiçbir kurtarma içinde de görünür olmalıdır, iyi-mühürlü. Floresan kurtarma açıktır veya reaksiyon odasının duvarları iyi tanımlanmış değilse, kontrol vanası basınç artırılmalı veya cihaz cam slayt sızıntı veya delaminasyon kontrol edilmelidir. Bu protokol, ticari bir E. Çağrıları reaktifleri ile test edilmiştir diğer güçlü Çağrıları sistemleri kullanılabilir olsa da (25 ul ölçekli) E. coli hücre serbest protein sentezleme kiti. Bu tepkin madde maliyeti deneylerinde sınırlayıcı bir faktör olduğunda yararlı olabilir cihaz tepkileri uygularken 25 ul daha düşük miktarlar kullanılması da mümkündür. Böylece bu aygıt için müsait değildir - reaktifler cihaza ilave edilir ve reaksiyon odaları kapalı sonra, bu de harekete geçiren bir kontrol valfi olmadan çözeltisine tepkime maddelerini eklemek mümkün değildirReaksiyon sırasında belirteçlerin ilave edilmesi gerekmektedir reaksiyonlar için le. Değerlendirilmemiştir Bu süre sonra dehidratasyon ve cihazın kuruma etkileri - Bu cihaz aynı zamanda Teklif Çağrılarını 3 saat daha uzun çalışabilir reaksiyonları gözlemlemek için optimize edilmemiştir. Daha uzun reaksiyon süreleri arzu edildiği takdirde, bu etkiler, ya da bir rutubet gözünün kullanılarak, buharlaşmayı önlemek için cihaz conta inkübasyon sıcaklığının değiştirilmesi ile hafifletilebilir. Böyle odası duvarları 49,50 veya gözenekli zar tabakasının dahil olarak nano-gözenekli yapılar olarak cihaz tasarımı Değişiklikler, reaktif alışverişine izin ve böylece reaksiyon sürelerini uzatmak olabilir birkaç yöntem temsil eder. Muntazam hacim mikrofabrike reaksiyon bölmeleri bölme duvarlı &quot;yan reaksiyonların&quot; olarak deney ve araştırma için son derece uygundur tutarlı boyutlar muhafaza edilmesi için değerlidir. Kullanarak yöntemlerinin aksine hayırBu reaksiyonlar az sayıda değerlendirilmesi gerekirse de, teknik, n-mikrofabrike ve deneyler esnasında boyutsal bir esneklik sağlamaz. Ancak, bu reaksiyon odaları için kontrol tasarım time-lapse mikroskopi için son derece uygundur, ve lohusalık yüksek verimli yöntemine bir aydınlatıcı tamamlayıcısı olabilir.

Hücre-serbest sistemler canlı hücrelerin çalışmasında kaçınılmaz olan bu tür fitness, bölünme ve mutasyon gibi komplike faktörlerden arındırılmış biyolojik reaksiyonlar görüntülemek için basitleştirilmiş ve esnek bir platform sunuyoruz. Bu tür yaklaşımlar membran proteinlerinin 1 karakterizasyonu, protein etkileşimleri 2 sondalama ve çeviri 3-7 temel yönlerini keşif gibi hücresel sistemler incelemek için istihdam edilmiştir. Son zamanlarda hücre içermeyen sistemler sentetik biyoloji 8-10 için geçerli platformlar gibi bir dayanak başladı. Bu tür yaklaşımların itiraz yaşadıkları hücrelerde reaksiyon dinamiklerini etkileyen kaynak paylaşımı ve &#39;dışsal gürültü&#39; sentetik biyoloji özgür olmasıdır. Ancak soru hücre içermeyen reaksiyonlar gömülü olduğu fiziksel çevre reaksiyonun ilerlemesini ve sonucunu nasıl etkilediğini olarak kalır. Hücre-serbest reaksiyon ortamlar - özellikle sınırlı EnvironmHücre-ilgili birimleri yaklaşım veliler - kötü karakterize kalır. Hücre-Free Protein Sentezi (Teklif Çağrılarını) litre ölçekli reaksiyon hacimleri 11 mikrolitre bir dizi genelinde eşdeğer kinetik sergileyen &#39;ölçek-ücretsiz,&#39; olarak geleneksel olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, hücresel ölçekli hacimlerine hapsedilmesini reaksiyonlar önemli ölçüde protein ekspresyon oranları 12 etkilediği gösterilmiştir. Stokastik hücre-serbest reaksiyonların doğası - özellikle hacimleri femtoliter altında gitmek bile bu sistem yaklaşımı olarak ya da - özellikle önemli olabilir. Gen ekspresyonunda Gürültü büyük ölçüde küçük hücreli hacim ve bileşenlerin yüksek yoğunluk gibi yalnız kalma sureti ile etkilenmiş bir özelliği önemli moleküllerin pek çok kuvvet çok düşük popülasyon seviyeleri göre - örneğin 1 fl hacmi içinde Escherichia coli sınırlandırır kadar 4,300 farklı polipeptidleri altında birkaç yüz farklı promotörlerin 1 uyanlabilir kontrolü3. Bu doğal gürültü chemotaxis 14 olmak üzere çok sayıda biyolojik süreçlerde merkezi bir itici güç olarak dahil olmuştur, aktif çoğaltma ve gecikme 15, lizis ve lizojeni 16,17 arasında λ faj kararı ve yetkinlik arasındaki Bacillus subtillus kararı arasında HIV kararı ve sporülasyon 17. Hücre içermeyen sentetik biyoloji sonra hücresel gen devreleri ve ağların stokastik özelliklerini keşfetmek ve belirli teknolojik hedeflere ulaşmak için bu davranışları değiştirmek için bir fırsat hem de sağlar. Hücresel sistemlerin az gürültü 18-27 iyi çalışılmış edilmiş olmakla beraber, özellikle de hücre bazında, hücre barındırmayan sistemlerde 8 temel ses davranışı az arama olmuştur. Burada hücre içermeyen sentetik biyolojide stokastik etkilerinin incelenmesi için bir platformu sunmak. Bu mikrofabrike platformu femtoliter ölçekli reaksiyon c içeriyorhızla açık (ve odanın dışında serbest difüzyon) ve devletlerin kapalı (bölme içinde sınırlı reaktanları) arasında geçiş olabilir Hambers. Kapalı durumda, bir yeşil floresan protein (GFP) ifade hücresiz protein sentezi (Çağrıları) reaktantları sınırlandırmak ve zaman atlamalı floresan mikroskobu 28 (Şekil 1) kullanılarak gen ekspresyonunu takip edin. Bu hücreler 25 karakterize etmek için kullanılan, doğrudan benzer bir şekilde gen ekspresyonu, stokastik dalgalanmalar yapısını ölçerek hücresiz ortam karakterize eder. Hücresiz tepkileri sınırlanması için olmayan mikroüretim yöntemleri veziküller ve lipozomlar 29-32, bir su-içinde-yağ emülsiyonları 12 ve gözenekli ortam 33 içerir. Bu yöntemler sınırlı hacimleri 34 boyutu dağılımı üzerinde kontrol sağlayabilir ancak bununla birlikte, mikroüretim yöntemleri bile nano üzerinde sıkıca belirtilen ebatlara yüksek tekrarlanabilir özellikleri oluşturmak.Ayrıca, bu sert yapılar kolayca buharlaşma veya dış ortamda değişikliklere duyarlı olmadan zamanla izlenebilir. Hızlı reaksiyon (zaman sıfır) başlatıldığı zaman zaman açıkça belirlenmesini zorlaştıran, reaksiyon başlangıcından aşağıdaki reaksiyon odaları mühür, önceki çalışma 8,35 olarak kullanılan mikrofabrike konteyner tasarımları. Burada yer alan yöntem kullanılarak, sadece 4-5 dakika bu şekilde iyi tanımlanmış bir &quot;sıfır zamanında&quot; sağlayan başlatma ve cihaz üzerindeki reaksiyon görselleştirme arasında ihtiyaç vardır. Aşağıdaki protokoller imal edilmesi ve optik litografi, cihaz grubu, cihaz test ve görüntü analizi için yöntemler de dahil olmak üzere, bu cihaz test etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="526">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:151px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:107px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Thinner</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>92360 FLUKA</td>
			<td>Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.75 mm hole-puncher</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15072</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">23 ga needles blunt tip</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-231PL-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#0 glass coverslip</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>260366</td>
			<td>Gold Seal</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Eclipse TE 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD camera</td>
			<td>Roper Scientific</td>
			<td>CoolSNAP-HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shutter</td>
			<td>Shutter Insturment</td>
			<td>Lambda SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Light Source</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Intensilight C-HGFI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Color Filters</td>
			<td>Chroma Technology Corp.</td>
			<td colspan="2">ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100x oil-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N.A. 1.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Temperature Regulator</td>
			<td>Oko Lab</td>
			<td>H201-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph</td>
			<td>Universal Imaging Corp.</td>
			<td>Version 7.8.3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marsh Bellofram transducers</td>
			<td>Marsh Bellofram</td>
			<td>T2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 gauge PTFE tubing</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/SWTT-24-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Septum vials</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>C4015- 17W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power Supply</td>
			<td>Hewlett Packard</td>
			<td colspan="2">6205B Dual DC Power Supply</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sharp 23 ga needles</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Male-to-male luer lock adapters</td>
			<td>Qosina</td>
			<td>20024</td>
			<td>Polycarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Blunt Needle 23 Ga.</td>
			<td>Component Supply Co.</td>
			<td>/NE-232PL-5C</td>
			<td>Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S30 E coli protein expression system</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L1110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pet3a-GFP vector/protein</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69418-3</td>
			<td>Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>#732-6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 555</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>AF555</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Version 1.46r</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: Time Series Analyzer</td>
			<td>Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA</td>
			<td>Version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: StackReg/TurboReg</td>
			<td>Ecole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne Biomedical Imaging Group</td>
			<td>Distribution is dated July 7, 2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plugin: ROI Manager Tools</td>
			<td>Tiago Ferreira</td>
			<td>12/15/2013 Version</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology

Hücre-serbest sistemler karmaşık kaynak paylaşımı izole biyolojik reaksiyonlar belirli ağları tarama için esnek bir platform sağlamak (örneğin, küresel gen ifadesi, hücre bölünmesi) canlı hücrelerin içinde karşılaştı. Ancak, geleneksel makro ölçekli toplu reaktörlerde kullanılan bu tür sistemler, genellikle kendi yaşam mikro ölçekli meslektaşları karakteristik dinamik davranışları ve verimliliği sergilemek için başarısız. Reaksiyon dinamikleri iç hücre yapısı ve ölçek etkisini anlamak karmaşık gen ağları anlamak için çok önemlidir. Burada kapalı moleküler sistemin esnek karakterizasyonu izin verirken hücresel ölçekli hacimlerindeki hücre içermeyen tepkiler sınırlayan bir mikrofabrike cihaz rapor. Bu çok-katmanlı poli (dimetilsiloksan) (PDMS) cihazı (açık ve kapalı) tahrik edilebilir bir elastomerik zar üzerinde femtoliter ölçekli reaksiyon bölmesi içerir. Çalıştırıldığında, odalar Hücre-Free Protein Sentezi (Teklif Çağrılarını) reaksiyonları sınırlandırmakzaman atlamalı floresan mikroskopi kullanılarak zaman içinde kinetik reaksiyon görüntülenmesi için izin veren bir floresan proteini ifade etmiştir. Burada bu cihaz Çağrıları gen devreleri karakterize etmek ve böylece hücresel sistemlerde kullanılan ses biyoloji tekniklerinin kullanımını sağlayan, hücresel sistemlerin karakterize etmek için kullanılan, doğrudan benzer bir şekilde Çağrıları reaksiyonlar gürültü yapısını ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir ve Hücre içermeyen çevre ile etkileşimleri.

Bu mikrofabrike platformun belirgin bir avantajı, bağımsız bir Çağrıları tepkileri (Şekil 2A) sınırlandırmak üzere harekete geçirilir kontrol elastomerik &quot;kontrol valf&quot; uygulanması bulunmaktadır. Cihaz harekete geçirildiğinde, membrandan odaları reaksiyon bölmesinde (Şekil 2C) bir diziye floresan reaktifler sınırlandırmak için cam lam üzerine bastırılır. Bölmeler güvenilir deney süresi boyunca reaksiyonun sınırlandırmak doğrulamak için, bir bazik sıkı bağlamak testi (ışıkla ağartma sonra Floresan Kurtarma) 37 uygulanmıştır. Bir fluoroforun (AF 555) cihaza uygulanan ve kontrol vanası tahrik edildi; mikroskop deklanşör diyafram kullanarak, bir (Şekil 2D) tek sıra fluorofor izole edilmiştir hapsederek ve bireysel photobleached. karanlık oldu ve kontrol vanası 20 dakika basınçsız kadar parlaklık kurtarmak değil iyi seçilmiş60, daha sonra, cam bölmeyi serbest bırakır. Bu test, bu reaksiyon haznesine deney süresince iyi açılmadan doğrular. Uygun koşullar altında (örneğin, GFP veya Lusiferaz gibi) kolayca görülebilir proteini eksprese eden bir Çağrıları Reaksiyon bu cihaza uygulanan bir kaç dakika içinde fark edilebilir bir proteini ifade eder. Reaksiyonun süresi boyunca, tepkime hazneleri iç ve dış, protein sentezi görüntülenmiş olan ve her bir odanın (Şekil 3A) içinde flüoresan yoğunluğu birimleri ölçülmesiyle hesaplanabilir. Floresans yoğunluğu protein konsantrasyonuna karşılık gelen, her bir reaksiyon odası (Şekil 3D) zaman içinde eşlenebilir. Gen ifadesi her moleküler aşamada (bağlayıcı sentezi, yıkımı, protein-DNA, vb) 20 dalgalanmaları (gürültü) tanıtır doğal olarak stokastik süreçtir. Gürültü biyoloji Bir şube üzerinde duruluyorGen devre gürültü 41 ispat değeri. Hücresiz sistemlerde ifadesi ifade eden moleküler makine ve reaksiyon kapları sınırlarını tanımlayan yüzeyleri arasındaki etkileşimlerden kaynaklanan dış gürültü etkileri olacaktır. Hücre-serbest reaksiyonlar bile küçük reaksiyon odalarına sınırlı olarak bu dışsal etkiler olasılıkla daha belirgin hale gelecektir. Birden çok sınırlı Çağrıları reaksiyonlar zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için yeteneği daha sonra hücresel sistemler 25 bildirilmiştir yöntemlere, doğrudan benzer bir şekilde kapalı hücre içermeyen sistemlerde gürültü yapısı (büyüklük ve dinamikleri) dikkatli analiz sağlar. Şekil 3C ve 3B ile ilgili, sadece yaklaşık 300 fl hacim tekabül PDMS reaksiyon bölmesi 10 mikron çapında içinde göre, 15 ul&#39;lik bir oyuk hacmi olan bir standart 384-çukurlu bir mikrolevhadaki bir T7 promoterinden kurucu GFP süresini gösterir Yedi siparişdaha az büyüklükte s. 10 um, reaksiyon odası içinde protein ekspresyonu oranlarındaki farklılıklar hücrelerde görülen yaklaşan, iyi levha ölçümleri çok daha yüksektir. Cihaz üzerinde yapılan çoğaltılmış çok katlı reaksiyonlar bir mikroplaka okuyucu platolar, genellikle reaksiyon hacmi 42,43 içindeki kaynak sınırlama neden olduğu varsayılmaktadır floresanstaki hızlı bir artış vardır (Şekil 3B), toplu olarak yapılan Çağrıları reaksiyonlara benzer kinetik sergileyen . Bu belirleyici bir büyüme davranışı, dalgalı olsa da, bütün reaksiyon odası boyunca ve deneyler arasında tutarlıdır - deneyler boyunca odalar arasında izleri ortalama ile, belirgin bir eğilim reaksiyonu (Şekil 4A), sadece gürültü bileşenleri bırakarak iz değerlerinden çıkartılmaktadır edilebilir . Şekil 4B deterministik, geçici bileşenin çıkarılmasından (üst sonrasında GFP ifade gürültü gösterir) Ve Şekil 4A, 10 um, reaksiyon odası karşılık gelen izleri sırasında gürültü (alt) otokorelasyon. otokorelasyon izleri sıfır gecikme süresi varyans gibi, gürültü büyüklükleri verirken otokorelasyon izleri yarım zamanlarda dağıtım gürültü frekans bağımlılığını verir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig1.jpg" /> Şekil 1. hücresiz protein sentezi reaktifler gen sentezleme gürültü ölçümü amacıyla femtoliter tipi bir reaksiyon odası içinde hapsedilir. Ticari bir hücresiz protein sentezleme sistemi için reaksiyona giren maddeler içinde PDMS reaksiyon bölmesi GFP teşkil edici olarak ifade sınırlı için kullanılır. Bu bölmelerin bir dizi protein ekspresyonu ve gen sentezleme gürültü karakterize etmek amacıyla, zaman atlamalı floresan mikroskobu ile görüntülenebilir. floresan yoğunluğu ozamanla her reaksiyon haznesi bireysel iz olarak çizilen olabilir f. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig2.jpg" /> Şekil yapışmalı femtoliter ölçekli odaları ile iki katmanlı mikroakışkan cihazın 2. Fabrikasyon. (A) Düzen ve cihaz tabakalarının görünümü patladı. Cihaz iki PDMS katman ve bir cam lamel oluşmaktadır. Cam ve kontrol valfı tabakası arasında PDMS membran, tepkime haznesine sahiptir. PDMS tepkime haznesinin (B) SEM görüntüsü. İç çapı 10 mm. Cihazdaki giriş kanalı (C) şematik. Hücre-Free Protein Sentezi (Teklif Çağrılarını) reaktifler reaksiyon kanalıyla uçakla. Su kontrolünde basınçlı edilirValf odaları 37 sızdırmazlık, cam slayt karşı reaksiyon odaları sıkıştırmak için. Ref çoğaltılamaz. Royal Society of Chemistry izni ile 37. (D) Floresan Kurtarma iyi FITC odasını gösterir kullanarak tek üzerine (sıkı bağlamak) testi Photobleaching sonra dış ortama karşı iyi mühürlü olduğunu. Fluorofor odaları (üst resim) yakalandı ve bir tek kuyu (düşük görüntü) photobleached edildi. Hiçbir floresan kurtarma kontrol vanası serbest bırakılıncaya kadar photobleached odasında görüldü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig3.jpg" /> Kapalı Hücre-Free Reaksiyon Şekil 3. EGFP ifadesi. (A) kapalı reaksiyon c Floresan görüntüleri<html> reaksiyonunda seçilen zaman noktalarında Hambers. Protein üretimi reaksiyon bölmesi içinde ve ana kanaldaki odası dışındaki görülebilir. (B), EGFP bir T7 polimeraz promotörünü ve terminatörünü ve güçlü bir ribozom bağlanma yeri (RBS) sağlayarak, pET3a vektörü içine klonlandı. (C) bir mikroplaka okuyucu içinde yapılan bir kütle hücresiz reaksiyonda EGFP yapısal ifadesi Normalleştirilmiş floresans ölçümleri. Teklif Çağrılarını reaksiyonlar genellikle hızlı bir şekilde &#39;kararlı durum&#39; floresan yavaşlama önce protein üretmek - Bu kaynak kısıtlılığı 43 ile ilişkilidir. Siyah tire ortalama iz gösterir. (D) birçok deney içinde 51 reaksiyon odalarından okunan 51 ham floresan yoğunluğu izleri normalize floresan. Siyah tire protein ifade deterministik bileşeni göstermek çeşitli deneyler üzerinde ortalama iz gösterir./52616/52616fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig4.jpg" /> Şekil 4. Bireysel Gürültü izleri ve Hücresel ve Hücre-Free Sistemi Gürültü Otokorelasyon. (A) Austin Gönderen ark., GFP (üst) ve bakterileri 25 canlı izleme GFP üretimi elde normalize otokorelasyon fonksiyonları (alt) 2006. Gürültü. Macmillan Publishers Ltd. izni ile yayımlanmaktadır: [Doğa] 25 (. Cilt 439), telif hakkı (2006). Mikroakışkan cihaz reaksiyon odalarında izlenen (B) GFP (üst) ve hücre-free sistemi GFP üretimi elde normalize otokorelasyon fonksiyonları (alt) Gürültü,. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig4highres.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Watch this Scientific Journal Video about Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology at JoVE.com

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Hücre-serbest Biyoloji yapışmalı femtoliter Odası Diziler

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

sealable-femtoliter-chamber-arrays-for-cell-free-biology

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K Görüntüleme.  University of Tennessee, Knoxville. A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Video: Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

Biyomühendislik

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A general protocol is described for the preparation of V. natriegens crude cell extracts using common laboratory equipment. This high yielding protocol has been specifically optimized for user accessibility and reduced cost. Cell-free protein synthesis (CFPS) can be carried out in small scale 10 &#956;L batch reactions in either a 96- or 384-well format and reproducibly yields concentrations of &#62; 260 &#956;g/mL super folder GFP (sfGFP) within 3 h. Overall, crude cell extract preparation and CFPS can be achieved in 1&#8722;2 full days by a single user. This protocol can be easily integrated into existing protein synthesis pipelines to facilitate advances in bio-production and synthetic biology applications.

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

Cell-free expression systems are powerful and cost-efficient tools for the high-throughput synthesis and screening of important proteins. Here, we describe the preparation of cell-free protein expression system using Vibrio natriegens for the rapid protein production using plasmid DNA, linear DNA, and mRNA template.

Boş hücre Protein ifade kullanarak hızla büyüyen bakteri Vibrio natriegens

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

OnePot PURE Cell-Free System

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic biology. Unfortunately, commercially available systems are costly, and their tunability is limited. In comparison, a home-made approach can be customized based on user needs. However, the preparation of home-made systems is time-consuming and arduous due to the need for ribosomes as well as 36 medium scale protein purifications. Streamlining protein purification by coculturing and co-purification allows for minimizing time and labor requirements. Here, we present an easy, adjustable, time- and cost-effective method to produce all PURE system components within 1 week, using standard laboratory equipment. Moreover, the performance of the OnePot PURE is comparable to commercially available systems. The OnePot PURE preparation method expands the accessibility of the PURE system to more laboratories due to its simplicity and cost-effectiveness.

We present a fast and cost-effective method to produce the recombinant PURE cell-free TX-TL system using standard laboratory equipment.

OnePot PURE Hücresiz Sistem

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Hücresiz Sistemler Kullanarak Protein Prototipleme için Minimal, Doğrusal Şablonların Amplifikasyonu için Hızlı, Enzymatik Yöntemler

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...

Rapid Characterization of Genetic Parts with Cell-Free Systems

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the fine-tuning of genetic circuits, such that their function results in predictable outcomes. With the growth of synthetic biology as a field, there has been an explosion of genetic circuits that have been implemented in microbes to execute functions pertaining to sensing, metabolic alteration, and cellular computing. Here, we show a rapid and cost-effective method for characterizing genetic parts. Our method utilizes cell-free lysate, prepared in-house as a medium to evaluate parts via the expression of a reporter protein. Template DNA is prepared by PCR amplification using inexpensive primers to add variant parts to the reporter gene, and the template is added to the reaction as linear DNA without cloning. Parts that can be added in this way include promoters, operators, ribosome binding sites, insulators, and terminators. This approach, combined with the incorporation of an acoustic liquid handler and 384-well plates, allows the user to carry out high-throughput evaluations of genetic parts in a single day. By comparison, cell-based screening approaches require time-consuming cloning and have longer testing times due to overnight culture and culture density normalization steps. Further, working in cell-free lysate allows the user to exact tighter control over the expression conditions through the addition of exogenous components and DNA at precise concentrations. Results obtained from cell-free screening can be used directly in applications of cell-free systems or, in some cases, as a way to predict function in whole cells.

Well-characterized genetic parts are necessary for the design of novel genetic circuits. Here we describe a cost-effective, high-throughput method for rapidly characterizing genetic parts. Our method reduces cost and time by combining cell-free lysates, linear DNA to avoid cloning, and acoustic liquid handling to increase throughput and reduce reaction volumes.

Genetik Parçaların Hücresiz Sistemlerle Hızlı Karakterizasyonu

Characterizing and cataloging genetic parts are critical to the design of useful genetic circuits. Having well-characterized parts allows for the ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.