O objetivo geral deste protocolo é examinar e quantificar a regeneração muscular em um modelo de zebrafish de doença muscular. Este método fornece um pipeline de alto rendimento que não só é econômico, mas também altamente reproduzível na pontuação do potencial regenerativo de um músculo doente em um ambiente in vivo. Demonstrando o procedimento comigo estará Avnika Ruparelia, pesquisadora do Instituto Australiano de Medicina Regenerativa.
Para genotipagem de embriões vivos, descasque a película protetora clara da superfície superior de um chip de extração de DNA de 24 câmaras e use uma ponta de filtro de 20 microliteres com uma ponta de corte para transferir um único embrião anestesiado em 13 microliters de meio embrião em cada câmara do chip. Quando todos os embriões tiverem sido carregados, monte suavemente o chip na plataforma de genotipagem de embriões de zebrafish colocando um lado no primeiro, seguido pelo resto do chip. Afixe a tampa da plataforma magnética sobre o chip para evitar a evaporação do meio de embrião durante o protocolo de extração de DNA e feche a tampa.
Defina a unidade base para 2,4 volts, 0,051 amperes e 0,12 watts e inicie o protocolo de extração de DNA. A plataforma deve começar a vibrar, o que pode ser avaliado tocando suavemente a tampa. Enquanto o programa está em execução, prepare uma placa de 24 poços adicionando um mililitro de meio de embrião a cada poço e rotule tubos de tira de oito poços para serem usados para a coleta de material de DNA de cada embrião.
Após oito minutos de extração, pressione o botão liga/desliga para parar a vibração da plataforma, remova suavemente a tampa magnética e levante o chip da plataforma. Transfira 10 microliters de meio de embrião de uma câmara para o poço apropriado do tubo de tira de oito poços e adicione imediatamente duas gotas de meio de embrião fresco às câmaras. Transfira o embrião da câmara para um poço apropriado da placa de 24 poços previamente preparada.
Quando todos os embriões tiverem sido transferidos, coloque a placa em uma incubadora de 28 graus Celsius. Realize os ensaios de genotipagem a jusante apropriados no material genético coletado nos tubos de tira de oito poços para determinar o genótipo de cada embrião. Uma vez identificado o genótipo de cada embrião, transfira os embriões para placas de Petri de 90 milímetros contendo 25 mililitros de água média e incubar as placas a 28 graus Celsius até lesão muscular.
Aos quatro dias após a fertilização, use uma pipeta para transferir uma larva anestesiada para uma nova placa de Petri e remova cuidadosamente qualquer meio de excesso da placa sob um microscópio dissecando. Oriente o peixe de tal forma que a cabeça esteja à esquerda, a cauda esteja à direita, a região dorsal esteja para cima, e a região ventral esteja baixa, e use uma agulha de calibre 30 para fazer uma rápida facada precisa em um a dois somitas no músculo epaxial acima do poro anal e horizontal para o mioseptum. Aplique uma gota de embrião médio ao zebrafish ferido e transfira cuidadosamente a larva para um poço de uma placa de 24 poços contendo um mililitro de meio de embrião fresco por poço.
Quando todas as larvas forem feridas, coloque a placa na incubadora 28 graus Celsius até que o zebrafish seja imageado. Para quantificar a regeneração muscular, abra uma imagem pós-lesão de um dia em um programa de software de análise de imagem apropriado e use a ferramenta de polígono para desenhar uma forma ao redor do local da ferida. Use o software para medir a área e a intensidade média de birefringência da região e copie esses valores para as células D3 e E3 do modelo fornecido.
Desenhe duas regiões adicionais cada uma abrangendo um a dois somites ilesos e meça a área e intensidades médias de birefringência de cada uma dessas regiões. Copie esses valores para as células D4 e D5 e E4 e E5 no modelo. Em seguida, repita a medição para as mesmas regiões na imagem pós-lesão de três dias.
Quando a birefringência tiver sido medida da mesma forma em todas as imagens, calcule a bireringência normalizada para cada região dividindo a intensidade média de birefringência de cada região por sua área. Para cada ponto de tempo, calcule a média normalizada de birefringência das duas regiões não feridas para fornecer um ponto de referência para o músculo não ferido. Para determinar a extensão da lesão muscular no primeiro dia pós-lesão, divida a birefringência normalizada da região da lesão pela bireringência normalizada média das regiões não feridas.
Para determinar a extensão da regeneração muscular, divida a birefringência normalizada da região da lesão nos três dias de imagem pós-lesão pela intensidade normalizada média das regiões não feridas nesta fase. Por fim, calcule o índice regenerativo dividindo o valor da extensão da regeneração muscular no terceiro dia pós-lesão pelo valor da extensão da lesão muscular no primeiro dia pós-lesão. Nesta análise representativa, uma embreagem de embriões de um cruzamento entre dois zebrafish heterozigos lama2 foi transferida para um chip de extração de DNA e, posteriormente, genótipada.
Enquanto a lesão muscular resulta em uma redução da intensidade de birefringência no primeiro dia pós-lesão, a regeneração bem sucedida do músculo resulta em um aumento da birefringência dentro da mesma região. Também é notável que, enquanto larvas do tipo selvagem exibem uma intensidade uniforme de birefringência devido a uma padronização muscular normal, a intensidade de birefringência no músculo das larvas de mata-mata Lama2 é desigual e altamente esporádica provavelmente devido a uma integridade muscular reduzida. Como observado, tanto o tipo selvagem quanto as larvas deficientes de Lama2 demonstram um aumento significativo da intensidade de birefringência no local da ferida em três dias após a lesão em comparação com um dia pós-lesão, indicando que o músculo se regenerou.
A determinação do índice regenerativo revela que as larvas deficientes de Lama2 apresentam um aumento impressionante na regeneração muscular em comparação com animais do tipo selvagem. Embora este protocolo nos permita identificar quaisquer alterações na capacidade do músculo de se regenerar em modelos de doença muscular, a análise celular e molecular a jusante precisa ser realizada para identificar os mecanismos responsáveis pelas alterações observadas. Este método nos permitiu identificar como a função de células-tronco musculares prejudicadas e um comprometimento em elementos de nicho associados contribui para a patogênese da doença muscular, permitindo assim identificar novos mecanismos da doença.
