Nosso protocolo nos permite estudar como os tecidos, como o músculo esquelético, regulam seu tamanho, o que continua sendo uma questão-chave na biologia celular e do desenvolvimento, com importantes implicações fisiológicas e médicas. A principal vantagem de nossa técnica é que o crescimento celular pode ser observado e medido em animais vivos in vivo com um alto grau de precisão espacial e temporal. O progresso na compreensão básica do crescimento muscular precoce pode destacar as origens do desenvolvimento de problemas musculares precoces e levar à descoberta da Novo Therapeutics para proteger contra a perda muscular em idosos e pacientes com distúrbios de perda muscular.
Prepare 1%LMA em um tubo de 1,5 mililitro e mantenha-o em um bloco de calor de 37 graus Celsius para uso repetido. Selecione os peixes a serem montados e anestesiar transitoriamente cada peixe. Para evitar o choque térmico, remova a alíquota LMA do bloco de calor e deixe-a esfriar até logo acima da configuração.
Pegue uma placa de Petri de 60 mililitros que tenha sido revestida com uma camada de 1%LMA e coloque-a no palco de um microscópio de dissecação. Transfira a larva com uma pipeta Pasteur de plástico de um mililitro para uma placa de Petri revestida de 60 milímetros e remova o máximo de meio transferido possível. Em seguida, ainda usando a pipeta Pasteur, coloque algumas gotas de LMA sobre o peixe e oriente rapidamente a larva perto da superfície superior do LMA com seu eixo anteroposterior e dorsoventral dentro de 10 graus da horizontal, usando fórceps ou uma agulha de vidro fina e polida pelo fogo antes que o LMA se ponha.
Alternativamente, use uma pipeta Pasteur de plástico de um mililitro. Recolher as larvas com um mínimo de peixe médio e transferir as larvas para a alíquota do LMA arrefecido. Permita que a larva afunde por cinco segundos para ficar totalmente cercada por LMA.
Em seguida, recupere a larva e transfira-a em uma gota de LMA para a placa de Petri revestida de agarose. Posicione rapidamente a larva como demonstrado anteriormente. Se as larvas não forem corretamente montadas horizontalmente perto da superfície da gota de agarose, remova e reincorpore, as larvas podem ser facilmente recuperadas por sucção suave usando uma pipeta Pasteur de plástico de um mililitro e o LMA pode ser suavemente removido usando toalhetes de chem.
Aguarde cerca de 10 minutos até que o LMA se defina. Inunde o prato com cerca de 10 mililitros de meio de peixe contendo tricaine. Para capturar pilhas confocais, deixe o peixe montado descansar por pelo menos 10 minutos antes da varredura, à medida que ocorre o inchaço da agarose.
Carregue o prato de amostra no estágio do sistema confocal. Localize as larvas e concentre-se na somita desejada. O somite 17 pode ser escolhido devido à sua facilidade de localização perto do respiradouro anal e facilidade de imagem.
Verifique contando os somitos do anterior. Para capturar imagens YZ, configure como se quisesse capturar uma pilha Z. Comece definindo os pontos superior e inferior do peixe.
Ambos os lados esquerdo e direito podem ser capturados conforme desejado, garantindo que todas as varreduras rápidas do YZ capturem as regiões desejadas. Oriente a área de varredura para o peixe conforme o software confocal permitir. Posicione o peixe com o eixo anteroposterior, paralelo ao eixo dex da imagem e ao eixo dorsoventral paralelo ao eixo Y com o somita 17 no centro do campo.
Concentre-se em um plano de nível médio no miótomo superior, no qual todas as metades do somito epaxial e hipaxial, juntamente com os mioseptos verticais e horizontais são visíveis e capturam uma imagem XY de alta resolução. Nomeie o arquivo e salve-a. Para capturar as imagens ZH, desenhe uma linha dorsal a ventral precisa através da somita escolhida, perpendicular ao eixo anteroposterior do peixe.
Adicione uma posição anteroposterior selecionada e, em seguida, execute uma varredura de linha de pilha Z. Repita a varredura da linha YZ três vezes em posições anteroposteriores definidas ao longo do miótomo selecionado para capturar YZA, YZM e YZP. Nomeie e salve essas imagens com a imagem XY relacionada.
Este protocolo foi denominado como o método de quatro fatias e as imagens podem ser analisadas usando o software Zen ou ImageJ. Para criar uma câmara de estimulação, pegue uma placa de poço de seis por 35 milímetros e crie duas pequenas aberturas com menos de cinco milímetros de diâmetro, um centímetro de distância em cada lado de cada poço usando um ferro de solda estreito. Uma vez criada, a câmara de estimulação pode ser reutilizada.
Enfie um par de fios de prata ou platina através das aberturas de cada poço. O material adesivo reutilizável pode ser aplicado perto das aberturas para manter os fios no lugar e garantir uma separação de um centímetro entre os fios. Aos três dias pós-fertilização, dividir os peixes em três condições, peixes de controle médio, inativos e inativos mais caule.
Para os grupos inativos e inativos mais caule, anestesiar larvas 72 horas após a fertilização com tricaína 0,6 milimolar. Para os peixes de controle médio, deixe-os desanestesiados. Prepare 60 mililitros de 2%agarose em meio peixe.
Derreta bem usando um micro-ondas e deixe esfriar. Em seguida, adicione tricaine e despeje pelo menos quatro mililitros em cada poço da câmara de estimulação. Adicione imediatamente pentes personalizados de quatro poços entre os eletrodos.
Aguarde 10 minutos para o gel definir. Remova os pentes cuidadosamente para criar quatro poços retangulares. Encha cada poço com água tricaína e coloque uma única larva anestesiada, inativa mais larva de caule em cada poço usando uma micropipeta, com seu acesso anteroposterior perpendicular aos eletrodos.
Verifique sob o microscópio fluorescente de dissecação se cada peixe está totalmente anestesiado dentro de cada câmara bem. Conecte um estimulador eletrofisiológico ajustável gerador de padrões à câmara através de um controlador de polaridade, usando clipes de crocodilo conectados a cada eletrodo de um lado da câmara. Em seguida, estimule o peixe conforme descrito no manuscrito do texto.
Verifique regularmente sob o microscópio para confirmar se os peixes estão sendo estimulados. O estímulo elétrico deve induzir uma contração bilateral visível e um leve movimento uma vez a cada cinco segundos seguindo os parâmetros descritos. Após a estimulação, remova cuidadosamente os peixes de cada poço, lavando-os suavemente com uma pipeta de plástico e retorne à incubadora em um meio de peixe fresco e contendo tricaina.
Despeje a água tricaine de dentro da câmara e use fórceps para cortar e remover a agarose de cada poço, enxaguar os poços com água da torneira e deixá-los secar. Para a análise do tamanho muscular, denominado método de quatro fatias, foram obtidas imagens XY e YZ do músculo larval do peixe-zebra e calculado o volume do somite. Uma forte correlação foi observada entre os métodos de quatro fatias e pilha completa, embora o método de quatro fatias tenha dado uma estimativa de volume ligeiramente maior.
A análise volumétrica dos miótomos adjacentes dos somitos 16 e 18 revelou que cada somita era cerca de 7% maior que o anterior. Investigações posteriores revelaram que um método de duas fatias, exigindo apenas uma única medição ZH, forneceu uma estimativa razoavelmente precisa do volume do miótomo. O miótomo cresceu detectavelmente em comprimento e área transversal entre dois e cinco dias após a fertilização, levando a um aumento constante no volume.
O músculo inativo pelo anestésico tricaína entre o terceiro e o quarto dia pós-fecundação apresentou volume significativamente reduzido, indicando que o crescimento muscular larval era dependente da atividade. Maior variação na redução do tamanho do miótomo foi observada ao medir o volume do miótomo aos quatro dias pós-fertilização, em comparação com a medição de cada peixe individual aos três e quatro dias pós-fertilização. No entanto, não foi observada diferença significativa no volume do miótomo entre os dois métodos de medidas do miótomo.
A medição do número de fibras dentro do miotoma, bem como o volume médio de fibras, revelou que a atividade controla ambos os aspectos celulares do crescimento. Certifique-se de que as larvas estão completamente anestesiadas usando tricanina recém-preparada. A anestesia parcial levaria a um resultado variável.
Como sabemos, as larvas respondem mais vigorosamente à estimulação elétrica. Este método, combinado com transcriptômica a jusante e experimentos farmacológicos, revelou novos insights sobre como a detecção de força impulsiona o crescimento do músculo esquelético.
