Agradecemos Thomas Bates para a leitura e melhorar o manuscrito de forma crítica. Agradecemos também a Christina Ebert e Sabrina Stötzer para manutenção dos peixes.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os &quot;Princípios de cuidados com animais de laboratório&quot;, bem como para a versão atual da lei alemã sobre a Protecção dos Animais. 1. Preparação de anti-sentido-morfolino (MO) <ol><li> Para preparar uma solução-mãe 3 mM MO, adicionar 100 ul de água estéril, ultrapura ao MO liofilizado (300 nmol em frasco de vidro). Para a dissolução completa, aquecer a solução de reserva a 65 ° C durante 5 min. Fecha-se o frasco com Parafilm e armazenar a solução estoque MO à temperatura ambiente (TA). Não refrigerar a solução estoque de MO porque isso poderia causar uma associação da MO com as paredes do frasco. </li><li> Preparar uma solução de trabalho MO 1 mM por diluição da solução de reserva com MO estéril, água ultrapura e adicionar uma solução a 0,5% de vermelho de fenol para uma concentração final de 0,05%. <ol><li> Para obter 10 ul de uma solução de trabalho MO, adicionar 3,3 mL da solução de MO e 1 ul de solução de vermelho de fenol 0,5% para 5,7 ul de água. Estartona preparação de um novo lote de solução de trabalho de aquecer a solução de MO a 65 ° C durante 5 min. </li></ol></li><li> Antes de usar, centrifugar a solução de trabalho de MO para evitar o entupimento da agulha. Por exemplo, girar 10 ul da solução de MO a 15.000 xg durante 5 min (RT) e remover 8 ul de sobrenadante para injecção. NOTA: Perda de atividade pode ocorrer em soluções morfolino ao longo do tempo 11. Para excluir esta, pode-se testar as soluções por espectrometria de UV, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. No caso dos wt1a utilizados morfolino uma eficácia reduzida não foi observada ao longo de um longo período de armazenamento (solução de trabalho 3 mM foi armazenado por mais de um ano). </li></ol> 2. Configurar Pairs acasalamento e Recolha de ovos fertilizados <ol><li> A tarde antes de microinjeção, criou cinco pares de Tg (wt1b: GFP) de linha, cada um em um recipiente de reprodução equipado com uma peneira removível para separarmachos e fêmeas durante a noite. NOTA: Para garantir que os ovos suficientes estão disponíveis para um experimento de injeção de sucesso, peixes utilizados como pares de acasalamento deve ter sido pré-selecionados e avaliados como bons &quot;produtores&quot;. </li><li> Na manhã seguinte, depois de as luzes se acendem, colocar o macho ea fêmea juntos acima da peneira que impede o peixe de comer os seus ovos. </li><li> Assista a desova. Uma vez que uma quantidade de ovos são postos que podem ser injectados antes da fase de 4-célula é atingido (aproximadamente 50), separado do macho fêmea novamente. Transferir os ovos com uma pipeta de Pasteur numa placa de Petri cheia de água embrião para um primeiro ciclo de injecção. Para obter rodadas adicionais de ovos, coloque um par de acoplamento juntos e em separado várias vezes. </li></ol> 3. Trabalhos preparatórios para microinjeção NOTA: Execute os passos 3.1 e 3.2 com antecedência. <ol><li> Para preparar um prato que mantém os embriões em posição durante a injecção (prato microinjeção) inserir um glslides ass em um ângulo de 40-45 ° em um prato de 94 milímetros Petri preenchido com líquido transparente puro, silício, de qualidade alimentar. Remover a corrediça quando o silício está endurecido. Isso produz uma ranhura na camada de silício. NOTA: Como alternativa, utilizar 1,5-3% de agarose em vez de silício e armazenar o prato a 4 ° C. </li><li> Gerar agulhas de injecção de capilares de vidro com um extrator de agulhas. <ol><li> Use capilares que contêm filamentos internos. NOTA: O filamento irá contribuir para transportar a solução de MO na direcção da ponta da agulha após enchimento (ver 3.3). </li><li> Estabelecer as configurações apropriadas no extrator de agulhas. Bons agulhas para injeção em peixes-zebra deve ter longas e finas dicas 12. Gerar pontas com um comprimento de aproximadamente 10 mm e um diâmetro de 1,5-2 uM no seu fim. Por exemplo, usar um extrator de agulhas horizontal com as seguintes configurações: Calor = 330, Pull = 0, Velocidade = 40, Time = 100. </li><li> Examinar a qualidade das agulhas sobdissecando microscópio e resolver aqueles com dicas curtas ou muito longas. NOTA: Agulhas com pontas curtas tendem a danificar o embrião enquanto tal, com muito longas e finas dicas curva ao tocar o córion e não penetrar. </li></ol></li><li> Aterrar a agulha com 2 mL de solução de trabalho MO usando uma ponta microloader e inseri-lo no suporte da agulha do aparelho de microinjeção. </li><li> Como as agulhas estão fechados na extremidade da ponta, gerar uma abertura por beliscar para trás o fim da agulha com uma pinça afiada sob o microscópio de dissecação. Como alternativa, use o aparelho de microinjeção para empurrar delicadamente a ponta de uma superfície rígida (ex. Bloco pequeno de metal ou de trás de uma pinça). </li><li> Calibra-se o volume de injecção, injectando a solução de trabalho de MO em uma gota de óleo mineral colocado sobre uma retícula. Ajustar a duração da injecção para produzir um diâmetro de gota de 75 um até se obter um volume de injecção de cerca de 200 pl. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. microinjeção Procedimento <ol><li> Dispor os embriões em fase 1 de células ao longo do sulco do prato de microinjecção com o pólo vegetal para a direcção de onde vem a agulha (para o ângulo de 45 ° da ranhura). </li><li> Perfurar a córion e a gema com a agulha e injectar 200 ul da solução de trabalho 1 MO mM (0,2 pmol) na gema de 1- embriões de duas células. </li><li> Usando uma pipeta de Pasteur com uma abertura larga, recolher todos os embriões injectados numa placa de Petri cheia de água embrião e incubar a 28,5 ° C. </li><li> Na parte da tarde, remover embriões mortos usando uma pipeta Pasteur com uma grande abertura e substituir a água embrião. </li></ol> 5. Preparação de embriões para In vivo Imaging <ol><li> Na manhã seguinte, substituir a água embrião embrião com água contendo 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para inibir a melanização. Não aplicar PTU antes do final da gastrulação porque interferes com o desenvolvimento embrionário precoce. CUIDADO: PTU é tóxico e teratogênico. Usar luvas em todos os momentos e evitar inalação e contato com a pele. </li><li> Dechorionate os embriões com pinças cortantes sob um microscópio de dissecção no estádio de desenvolvimento desejado. Agarrar o cório com um par de pinças e tentar agarrar do outro lado do cório com um segundo par de pinças. Retire cuidadosamente as pinças em direções opostas sem interromper o embrião. </li><li> Anestesiar o embrião, substituindo a água que contém o PTU embrião (0,003%) com água contendo embrião PTU (0,003%) e 0,02% Acetato de metanossulfonato de 3-aminobenzoato de metilo (tricaina). </li><li> Incorporar o embrião em baixa temperatura de fusão agarose em um μ-prato de fundo lamela com uma grade de deslocalização 50 mm. incorporação adequada requer alguma prática. <ol><li> Preparar alíquotas de 1 ml de 0,7% de agarose em 1,5 ml tubos de reacção e colocá-los em um bloco de ajuste de calor a 36 ° C. Usar uma pipeta Pasteur com ampla abertura em Transfer do embrião para o μ-prato. Retire a água de embriões em excesso, utilizando uma pipeta Pasteur com ponta ultra-fino e sobrepor o embrião com agarose temperado. </li><li> Enquanto a agarose ainda é líquida, orientar o embrião com duas pontas de carregadora gel na posição desejada, no que diz respeito à estrutura de interesse, bem como a distância à rede relocalização. Coloque a estrutura de interesse (aqui os pronephros) o mais próximo possível para o fundo de vidro (aqui: dorsal para baixo), e em proximidade à rede. </li><li> Para uma qualidade de imagem óptima minimizar a camada de agarose entre o embrião e o fundo de vidro através da colocação da estrutura de interesse do embrião tão próximo quanto possível do fundo. Além disso, localize o embrião em estreita proximidade com a grade, mas tome cuidado para que a grade não irá se sobrepor com a estrutura de interesse. Incorporar 3-4 embriões em diferentes u-pratos cada e utilize aquele que está posicionado melhor. </li><li> Quando a agarose é difícil o suficiente para manter a espera de embriões para 2-3 Min e sobrepor o embrião incorporado com água embrião contendo 0,003% PTU e 0,02% tricaina. Decantar a água embrião excesso ou removê-lo usando uma pipeta Pasteur com ponta ultra-fina. Fechar a tampa do μ-prato na posição de bloqueio para evitar a evaporação. NOTA: Evite a ocorrência de bolhas de ar na μ-prato, como eles poderiam prejudicar a gravação de imagem. </li></ol></li></ol> 6. Microscopia NOTA: Use um microscópio equipado para corte óptico através de iluminação estruturada. gravar imagens com um software que contém os seguintes módulos: Multicanal, Z-stack, Série Time, Software autofoco e Extensão Foco. <ol><li> Aquisição de Z-stacks <ol><li> Inverter o μ-prato. O fundo de vidro agora está voltada para o objetivo e o μ-prato serve como uma câmara de imagem. </li><li> Alternar o controle deslizante para a posição de rede e activar o modo de iluminação estruturada nos controles de software. </li><li> Calibraro foco da grade para o canal (s) de escolha com a amostra a ser analisada (embrião incorporado), seguindo as instruções do assistente de calibração Focus. </li><li> Ative o modo de aquisição z-Stack e configurá-lo para o modo de centro. Concentre-se no meio da amostra e defini-la como plano central da pilha z- clicando Center. Definir a dimensão do Z-pilha, definindo o intervalo em torno da posição central. NOTA: estruturas de objetos não deve ser visto nitidamente fora o primeiro eo último plano do z-stack. </li><li> Ajustar o espaçamento entre as secções ópticas. Para melhor resolução z clique no botão Optimal. Com base na profundidade de campo objectivos do software irá definir uma distância recomendada seguindo o critério de Nyquist (50% de sobreposição). NOTA: Se apontando para tamanhos de arquivo menores e as licenças estrutura, definir um tamanho maior espaçamento manualmente. Definir etapas menores do que o recomendado apenas irá resultar em tamanhos de arquivos maiores sem aumentar mais tardeinformações ai. </li></ol></li><li> Imagem de lapso de tempo <ol><li> Abra a ferramenta Time Series e defina o intervalo do experimento de séries temporais. Por exemplo gravar imagens Z-stack a cada 30 minutos ao longo de um período de 5 horas. </li><li> Para corrigir o desvio de foco ao longo do tempo, criou uma estratégia de focagem automática. Verifique a caixa de diálogo estratégia de foco, selecione Software focagem automática a partir da lista drop-down e escolha o canal TL-Brightfield como canal de referência. </li><li> Comece cada ponto de tempo com a focagem automática. A fim de assegurar uma gama de pesquisa confiável dentro de um prazo otimizado, definir um 200 um intervalo de procura fixa relativa. Esta gama está totalmente digitalizado (parâmetro Faixa de cobertura) com (parâmetro de qualidade) qualidade básica em um (parâmetro de amostragem) tamanho máximo etapa. </li><li> Para aumentar a precisão do autofoco, ativar a medição dentro de uma região foco de interesse (foco ROI) ea posição disse ROI foco na janela de visualização ao vivo em torno da estrutura de interesse. NOTA: Seo sistema não tem o módulo de software de focagem automática que atualiza o centro z-position automaticamente durante a gravação de lapso de tempo, pausar o experimento em um determinado momento e ajustar o foco manualmente e continuar o experimento. </li><li> Para compensar um potencial xy-drift durante a gravação de séries temporais, posicionar um ponto específico da grelha impressa (da câmara de imagem) na mira do software e salvar o posicionamento, fazendo uma captura de tela. </li><li> Iniciar a experiência séries temporais. Antes de o intervalo de tempo de série é longo, fazer uma pausa na experiência e, se necessário, re-ajustar o posicionamento de acordo com a imagem. Continue com o experimento. </li></ol></li></ol> Processamento 7. Imagem <ol><li> Alterne para a guia de processamento e selecione o Maior profundidade do foco (EDF) na caixa de diálogo Método. Desde secções ópticas são adquiridos, aplicar o algoritmo de máxima projeção para a série de imagem. NOTA: Aqui, o algoritmo irá projetar a brightest ou o pixel mais escuro da pilha para uma imagem 2D composto numa primeira fase e, eventualmente, usar aquele com a maior variância como uma imagem de resultado para cada ponto de tempo. </li><li> Use o método Filme Exportar para criar um lapso de tempo de filme (por exemplo avi ou mover arquivos) para fora da série de imagens EDF. </li></ol>

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O autor Michael Graf é um funcionário da Carl Zeiss Microscopia GmbH, que produz instrumentos utilizados neste artigo.

O peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular para estudos de desenvolvimento de vertebrados e modelagem de doenças humanas. Porque os embriões de peixe-zebra continuar a ser transparente, desenvolvimento órgãos como cérebro e do coração podem ser observados usando um microscópio preparação padrão. Aproveitando-se de linhagens transgênicas com fluorescência específica do órgão permite avaliações de organogênese em toda a diferentes estágios de desenvolvimento dentro de embriões vivos por microscopia de fluorescência. Uma limitação para a imagiologia detalhes estruturais de órgãos inteiros com microscopia de epifluorescência padrão é o impacto dos sinais de objectos acima e abaixo do plano focal. Esta luz fora de foco não só resulta em diminuição do contraste e resolução da imagem, ele também pode obscurecer estruturas importantes de interesse 13,14. Várias técnicas como confocal- de varredura a laser, fiação confocal- disco ou microscopia multiphoton foram desenvolvidos para minimizar a informação para fora de foco e, assim increaso contraste da imagem e bem como a resolução axial. Um método alternativo para obtenção de cortes ópticos é a microscopia de iluminação laser e a digitalização sem estruturado, uma grande técnica de iluminação de campo com base que é e simples de implementar em um microscópio comum 15. Os resultados aqui apresentados mostram que seccionamento óptico, alcançado pela iluminação estruturada, implementado em um microscópio de dissecação e combinada com a reconstrução de imagens de foco estendidos, permite a visualização de detalhes estruturais do normal e perturbado desenvolvimento renal no peixe-zebra. Em particular, as células positivas para GFP em morphants wt1a são dispersos em várias profundidades focais, e as imagens de um único plano com desfocagem do foco para fora-de- seria subestimar a complexidade tridimensional do fenótipo. Para acompanhar a dinâmica do órgão organização, rearranjo ou interrupção, microscopia de lapso de tempo de fluorescência é um poderoso ainda que técnica complexa. Durante time-lapseimagiologia ligeiras vibrações ou oscilações de temperatura menores causar desvios na direção x, y ou z. Isto exige equipamento adicional (câmara ambiental, tabela anti-vibração), de modo a obter resultados estáveis. O método apresentado utiliza a capacidade de um microscópio de dissecação com uma unidade de foco motorizado para gravar imagens de lapso de tempo, sem dispositivos extras. Para manter um foco estável, uma estratégia de focagem automática e foi estabelecida uma grelha de deslocalização impressa na parte inferior da câmara de imagem foi usada para correcção de x, y instabilidade. incorporação adequada do embrião é um passo crítico no âmbito do protocolo. Alguns prática é necessário para colocar a estrutura de interesse tão próximo quanto possível do fundo de vidro, e em proximidade à rede sem sobreposição com ela. A principal vantagem do método é que ele é uma ferramenta simples e a preços acessíveis para a observação directa dos processos de desenvolvimento, tais como o crescimento e migração de estar emembriões durante várias horas. Além disso, os benefícios específicos do microscópio de dissecação, como grande campo de visão e distância de trabalho estendida facilitar o exame de amostras maiores, incluindo órgãos inteiros. No entanto, algumas limitações devem ser mantidos em mente. A pausa da experiência para verificar e reajustar o posicionamento faz com que o procedimento demorado e a ausência de um controlo de temperatura robusta altera o tempo de desenvolvimento &quot;standard&quot;, o qual é definido como h após a fertilização a 28,5 ° C durante 16 peixes-zebra. Outro problema potencial é restrito a profundidade de processamento de imagem em que o animal, particularmente quando a estrutura de interesse está localizado dentro do embrião ou larvas. Uma tal estrutura é o glomérulo pronephric peixe-zebra, o qual está situado entre as somitos e do saco vitelino. A profundidade limitante para a imagiologia do glomérulo verificou-se ser cerca de 200 um, a uma distância que é atingido após 5 dias de desenvolvimento. Em contraste, as estruturas que são fluorescentes located mais perto da superfície do animal pode ser trabalhada durante mais tempo. Por exemplo células do fígado são acessíveis para geração de imagens, pelo menos, até 9 de dpf. Uma outra limitação é que a imobilização de longo prazo do embrião ou em larvas de agarose e tratamento tricaina induzir atraso do crescimento e do edema cardíaco, respectivamente. Uma vez que esta pode interferir com o desenvolvimento normal, recomenda-se a limitar a duração de gravação de lapso de tempo para um certo período de interesse. Para assegurar que durante a estruturas de imagiologia de interesse desenvolver-se normalmente que é útil para comparar (no final) a aparência geral com a de um animal mantido sob as mesmas condições experimentais, mas sem a incorporação e anestesiados. Gravação de um z-stack de cortes ópticos a cada 30 minutos durante um período de 5 horas e subsequente cálculo da profundidade de foco imagens estendida fornecida informação espacial e temporal sobre os eventos iniciais do normal e perturbado desenvolvimento rim, que foi induzida bknockdown de wt1a y morfolino-mediada. Morfolino knockdown experimentos realizados previamente já mostraram que Wt1a cumpre um papel precoce e essencial na formação pronephros A hibridação in situ com o marcador renal 17,18 eo emprego do wt1b transgênico:. Linha de GFP para o desenvolvimento pronephros de imagem em tempo fixo aponta 9,10 revelado que os resultados da deficiência wt1a em morfogênese glomerular interrompido e não especificação podócitos. Em contraste com estas abordagens estáticos, gravações de lapso de tempo de visualizar directamente dinâmica nefrogênese precoce nos embriões de controlo e a migração de células positivas para GFP para fora da região em pronephric morphants wt1a. A possibilidade de controlar as células misrouted ao longo do tempo permite uma análise mais detalhada fenótipo. Em geral, o método que é aqui apresentada fornece um método barato e fácil de usar alternativa para o complexo, e menos acessíveis SEtups normalmente utilizado para geração de imagens de lapso de tempo, como microscópio de varredura a laser (equipado com uma câmara ambiental e mesa de anti-vibração) ou folha de microscópio de luz. A rotina descrita para corrigir problemas de deriva pode também ser aplicado para realizar imagens de lapso de tempo sobre as configurações sem opções de seccionamento ópticos, como microscópios de fluorescência estéreo. A técnica não só é adequado para investigar o desenvolvimento do rim, mas também pode ser aplicado para monitorizar morfogénese normal e deficiente de outros órgãos tais como o coração ou o fígado. Além disso, o método pode ser usado para observar vários processos mais dinâmicos em organismos embrionário e adulto modelo, tais como a cicatrização de feridas ou de regeneração.

Seguindo a gastrulação, organogênese é o próximo estágio do ciclo de vida de um indivíduo. Trata-se o rearranjo, interacção e, muitas vezes, a migração de células para a produção de tecidos e órgãos. Imprecisão nos processos subjacentes ao desenvolvimento de órgãos, muitas vezes leva a doenças que podem se manifestar imediatamente ou também mais tarde na vida. Assim, a compreensão organogênese tem sido um grande esforço na biologia do desenvolvimento e investigação biomédica. A fim de poder investigar o desenvolvimento de um órgão em particular, tem que ser visível até mesmo através da parede do corpo do embrião. Isto permite a gravação das alterações espaciais e temporais que ocorrem durante o desenvolvimento. Além disso, a fim de analisar a importância de fatores envolvidos na organogênese, ele precisa ser suscetíveis à manipulação. Um organismo que é extremamente adequado para a investigação de organogênese in vivo é peixe-zebra. sua transparrência durante o desenvolvimento embrionário, em combinação com a utilização de linhas transgénicas fluorescentes permite a observação da localização da proteína de expressão e dinâmica, bem como a visualização dos órgãos internos 1. Isto proporciona uma vantagem única sobre a investigação do desenvolvimento dos órgãos em tempo real, em comparação com modelos de mamíferos cujos órgãos são inacessíveis para análise microscópica. Além disso, diferentes ferramentas estão disponíveis para manipular o desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Para além da geração de linhas mutantes, os oligonucleótidos anti-sentido de morfolino (MO) pode ser usada para knockdown da actividade de genes particulares que estão envolvidas no desenvolvimento de certos órgãos. MOs segmentar um local de união ou a translação códon de iniciação (AUG) e, assim, interferir com splicing de pré-mRNA ou a tradução. O rim de embrião de peixe-zebra, os pronephros, é um modelo anatomicamente simples, mas valiosa para estudar o desenvolvimento renal ea função do genes relacionadas com doenças renais 2. É composto por apenas duas unidades funcionais chamadas néfrons. Cada néfron consiste de um glomérulo, onde filtração do sangue tem lugar 3. Outros componentes são a região pescoço curto, bem como do túbulo segmentada para a secreção e reabsorção dos solutos e a conduta, que termina na cloaca 4. Independentemente da sua composição simples, a organização e os diferentes tipos de células do pronephros de peixe-zebra são muito semelhante a um rim de mamífero 5,6. Um factor, que é criticamente envolvido no desenvolvimento do rim, é codificada pelo gene supressor do tumor de Wilms WT1 7. Zebrafish possuem dois paralogs chamados wt1a e wt1b ser expresso em um padrão idêntico de sobreposição, mas não durante o desenvolvimento dos pronephros 8. Usando peixes-zebra transgénicos com estruturas pronephros marcado com GFP, foi demonstrado que knock-down completa de wt1a &lt;/ em&gt; ou de uma forma de emenda específica leva a malformações graves ou leves de rim embrionário, respectivamente 9,10. O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de nefrogênese normal e deficiente em embriões de peixe-zebra, empregando um microscópio de fluorescência de dissecação equipado para corte óptico através de iluminação estruturada. secções ópticas em geral permitem a aquisição de imagens que só contêm informações em foco. Fora de foco informação pode ser evitado por várias abordagens, tais como algoritmos matemáticos (eg.) De desconvolução, desenho óptico (por exemplo, de microscopia confocal de varrimento laser) ou uma combinação de ambos (por exemplo, a iluminação estruturada). Para induzir defeitos no desenvolvimento do rim foi utilizado um anti-sentido contra MO wt1a que foi injectado em uma linha de peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)). Esta linha mostra GFP-fluorescência no glomérulo, pescoço e o anteriorparte do túbulo 9,10. Em comparação com configurações mais complexas para as gravações time-lapse com seccionamento óptico, como a digitalização a laser ou microscópios folha de luz, um microscópio zoom é fácil de manusear e menos dispendioso. Além disso, Equipamento de iluminação estruturada pode ser facilmente combinado com equipamento convencional de fluorescência (por exemplo, a fluorescência da lâmpada, filtros) e ofertas de dissecação vantagens específicas do microscópio, como uma distância de trabalho prolongada e grande campo de visão. Problemas com tração foram resolvidos sem o uso de equipamento adicional (câmara ambiental, mesa de anti-vibração) geralmente necessária para obter resultados estáveis. Para corrigir o desvio de foco uma estratégia de foco automático foi estabelecido e câmaras de imagem com grades de realocação impressos foram utilizados para reajustar o posicionamento seguindo um desvio na direção x ou y. O método apresentado pode também ser aplicado para microscópios ópticos sem opções de seccionamento, tais como fluorescência estéreo microscopes e oferece uma alternativa aos equipamentos mais complexa, que é normalmente utilizado para a gravação de lapso de tempo de tecidos em desenvolvimento e dinâmica de órgãos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Material</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Control Morpholino</td>
			<td style="width:147px;">Gene tools, LLC</td>
			<td style="width:148px;">Standard control oligo</td>
			<td style="width:252px;">Prepared&#160;control&#160;oligo</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">wt1a Morpholinos&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Gene tools, LLC</td>
			<td style="width:148px;">customized</td>
			<td style="width:252px;">Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0,5% Phenol red solution</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P0290</td>
			<td style="width:252px;">Injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">peqGOLD universal agarose</td>
			<td style="width:147px;">peqlab</td>
			<td style="width:148px;">35-1020</td>
			<td style="width:252px;">To prepare microinjection dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass capillaries&#160; (GC100F-10)</td>
			<td style="width:147px;">Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td style="width:148px;">30-0019</td>
			<td style="width:252px;">To generate injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;">5242956003</td>
			<td style="width:252px;">To load the microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont forceps&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Fine Sience Tools</td>
			<td style="width:148px;">91150-20</td>
			<td style="width:252px;">To generate an opening at the needle tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:216px;">Embryo water (0.3x Danieaus&#180; solution)</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4,&#160; 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graticule 5mm / 0.05mm</td>
			<td style="width:147px;">Science Services</td>
			<td style="width:148px;">PY68039-02</td>
			<td style="width:252px;">For calculation of injection amount</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml</td>
			<td style="width:147px;">Roth</td>
			<td style="width:148px;">E305.1</td>
			<td style="width:252px;">To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml</td>
			<td style="width:147px;">Roth</td>
			<td style="width:148px;">E304.1</td>
			<td style="width:252px;">To remove excess of water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P7629</td>
			<td style="width:252px;">For suppression of melanization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:148px;">E10521</td>
			<td style="width:252px;">To anethesize zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melting agarose</td>
			<td style="width:147px;">Biozym</td>
			<td style="width:148px;">850111</td>
			<td style="width:252px;">For embedding&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:216px;">&#181;-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50</td>
			<td style="width:147px;">ibidi</td>
			<td style="width:148px;">81148</td>
			<td style="width:252px;">Imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel loader tips</td>
			<td style="width:147px;">Hartenstein</td>
			<td style="width:148px;">GS05</td>
			<td style="width:252px;">To orient the embryo for proper embedding</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette puller (model P-97)</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">To generate injection needles&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:147px;">Saur Laborbedarf</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermomixer copact</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">Thermoblock for tempering the low melting agarose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SZ61 (Stereomicroscope)</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For injection control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Axio Zoom. V16</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For embedding and imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApoTome.2 slider</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For optical sectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AxioCam MRm</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">For image acquisition&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ZEN 2012</td>
			<td style="width:147px;">Zeiss</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:252px;">Imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of zebrafish kidney development with time-lapse imaging using a dissecting microscope equipped for optical sectioning

A fim de compreender a organogénese, as alterações espaciais e temporais que ocorrem durante o desenvolvimento de tecidos necessitam de ser gravado. O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento normal e deficiente renal em embriões de peixe-zebra, utilizando um microscópio de fluorescência de dissecação equipado para iluminação estruturada e aquisição de z-stack. Para visualizar nefrogênese, peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)) foram utilizadas estruturas renais com fluorescente etiquetado. Defeitos renais foram provocados por injecção de um oligonucleótido anti-sentido morfolino contra o wt1a gene de tumor de Wilms, um factor conhecido por ser crucial para o desenvolvimento do rim. A vantagem da configuração experimental é a combinação de um microscópio de zoom com estratégias simples para os movimentos de ajuste re-em x, y ou z direção sem equipamento adicional. Para contornar deriva focal que é induzido por variações de temperatura e vibrações mecânicas, Uma estratégia de focagem automática foi aplicado em vez de utilizar uma câmara ambiental normalmente exigido. A fim de voltar a ajustar as mudanças de posição devido a um xy-drift, foram empregados câmaras de imagem com grades de realocação estampado. Em comparação com configurações mais complexas para a gravação de lapso de tempo com seccionamento óptico, tais como varredura a laser confocal ou microscópios folha de luz, um microscópio zoom é fácil de manusear. Além disso, oferece dissecando benefícios específicos do microscópio, como alta profundidade de campo e uma distância de trabalho estendida. O método para estudar a organogénese aqui apresentada também pode ser usado com microscópios de fluorescência estéreo não capazes de seccionamento óptico. Embora limitado para high-throughput, esta técnica oferece uma alternativa aos equipamentos mais complexa, que é normalmente utilizado para a gravação de lapso de tempo de tecidos em desenvolvimento e dinâmica de órgãos.

microscopia de lapso de tempo é uma técnica poderosa para assistir processos biológicos dinâmicos durante um longo período de tempo. Um problema que ocorre frequentemente durante o lapso de tempo de imagem é um movimento na direcção X, Y ou Z, chamado de deriva, que é induzido por variações de temperatura e vibrações mecânicas. O método aqui apresentado permite a gravação de estruturas de fluorescente etiquetado em embriões de peixe-zebra ou larvas em um microscópio de dissecação, sem câmara ambiental e mesa de anti-vibração de lapso de tempo. Para a compensação de xy-drift, o espécime foi incorporado em uma câmara de imagem com uma grade de deslocalização impressa (Figura 1). A localização de um ponto específico da grelha relacionadas com a mira da ferramenta de software foi utilizado para devolver o espécime para a posição pré-ajustada (Figura 2A). Os resultados apresentados foram obtidos usando um microscópio de zoomcom um controle deslizante integrado para seccionamento óptico através de iluminação estruturada (Figura 2B). Para a correção focal contínua, uma estratégia de foco automático foi estabelecido. Nesta estratégia, o foco automático software é usado para localizar o foco baseado em contraste máximo antes de cada ponto de tempo. Este plano focal assim definido é posteriormente definido como plano de centro para a aquisição z-stack. A fim de minimizar a fototoxicidade na amostra, o canal de luz transmitida de campo claro é utilizado como canal de refercia, uma vez que permite que os tempos de exposição suficientemente curtos durante o passo de focagem automática (Figura 2C). O método foi aplicado para a análise comparativa do desenvolvimento renal em embriões morphant Control e wt1a de uma linha de peixes-zebra transgénicos (Tg (wt1b: GFP)). Durante nefrogênese no início desta linha mostra fluorescência verde na mesoderme intermediária, foram os progenitores renais surgem de 9,10 e mais tardenos túbulos que formam e primórdios nefrónio (Figura 3). Lapso de tempo de gravação de imagem revela que nefrogênese no controle de morfolino injetado embriões é inalterado em comparação com os não injectados (resultados não apresentados) e segue os passos descritos de desenvolvimento do rim zebrafish precoce 3. Aos 20 HPF os túbulos pronephric em desenvolvimento são visíveis e nas suas extremidades anteriores, acumulações de células esféricas, que representam a formação dos primórdios nefrónio formação pode ser detectado. Durante as próximas horas, túbulos e primórdios néfrons crescer e, mais tarde, os primórdios começar a fundir-se na linha média (Figura 4, vídeo 2). Em contraste, nefrogênese é fortemente perturbado em embriões wt1a morphant. Embora as estruturas tubulares GFP positivas são visíveis em 20 hpf, eles parecem ser mais difusos e menos desenvolvida. Além disso, não há primórdios de nefrónios apropriadas foram formadas. A diferença mais marcante para tele controlar embriões neste ponto de tempo, no entanto, é o aparecimento de um grande número de células fluorescentes fora das pronephros em desenvolvimento (Figura 4, de vídeo 2). Posteriormente, estas células deixar o campo pronephric e migram ventralmente (vídeo 2). Desenvolvimento do rim em embriões de controlo e morphants wt1a da linha transgénica wt1b foram comparadas anteriormente, tomando imagens em diferentes pontos de tempo fixos 9,10. Em contraste com este método estático, gravação de lapso de tempo permite acompanhar a dinâmica de nefrogênese normal e misrouting de células progenitoras renais causadas pela depleção wt1a. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema Ilustração de um embrião incorporado em uma Câmara Comercialmente Disponível com Relocation Grids. O prato temquatro redes, cada uma subdividida em uma distância de repetição de 50 mm, impresso em um fundo lamela de vidro. O embrião a ser trabalhada é incorporado cabeça para baixo, com a estrutura renal em estreita proximidade com um quadrado de observação, mas sem sobreposição com a rede. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig2.jpg" /> Figura 2:. Os ajustes de Compensação de desvio na imagem Time-lapse e grade de projeção de iluminação estruturada uma posição distinta da rede de deslocalização foi trazido para o centro da imagem (marcado pela mira amarelo) e serve como um ponto de referência para mais tarde xy-alinhamento no caso de pequenos deslocamentos. O rectângulo vermelho representa a região de interesse (ROI) utilizados na estratégia de focagem automática (A). wa seccionamento ópticoss obtido por iluminação estruturada. A imagem mostra uma estrutura de grade projetada no plano focal após a calibragem correta (B). O ROI para a estratégia de foco automático (retângulo vermelho) está definido para cobrir estruturas embrionárias distintas altas em contraste (aqui somites) que permitem a focagem automática de confiança na estrutura de interesse (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig3.jpg" /> Figura 3: wt1b Transgénicos:. Embriões de GFP com fluorescência verde no desenvolvimento do rim sobreposições de dorsal (A) ou (B) a transmissão lateral e imagens de fluorescência são apresentados com o anterior para a esquerda. np, primórdio néfron; pt, túbulo pronephric; mais ou menosácaro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53921/53921fig4.jpg" /> Figura 4: Knockdown de wt1a atrapalha o desenvolvimento de rim embrionário Representante, profundidade prolongado de imagens de foco a partir de gravações time-lapse.. No controle de morfolino embriões injetados, o desenvolvimento renal mostra o progresso normal com túbulos crescentes e primórdios nephron que começam a se fundir na linha média. Em contraste, morphants wt1a falhar para formar primórdio nefrónio adequada e uma quantidade enorme de células positivas para GFP estão fora do campo pronephric. (np, nephron primórdio; pt, túbulo pronephric). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/53921fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta fi</a>gura. <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie1.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/co-MO.mov" target="_blank">Suplementar vídeo 1. gravação Time-lapse do desenvolvimento normal do rim no controle de morfolino embriões injetados. (Clique direito a download).</a> O vídeo mostra como túbulos crescer e primórdios néfrons começam a se fundir. A partir de 20 hpf, imagens foram tiradas em intervalos de 30 min durante um período de 5 horas. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53921/53921movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53921/wt1a-MO.mov" target="_blank">Suplementar Vídeo gravação 2. Time-lapse de nefrogênese perturbado em embriões wt1a morphant. (Clique direito a download).</a> O vídeo mostra a migração de células positivas para GFP para fora da região pronephric. A partir de 20 hpf, as imagens foram tiradas em 30 min intervalos ao longo de um período de 5 horas.

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Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

analysis-zebrafish-kidney-development-with-time-lapse-imaging-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K visualizações.  Leibniz Institute on Aging - Fritz Lipmann Institute (FLI).  O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar. 

Vídeo: Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Um Sanduíche papel de filtro submerso por longo prazo<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Imagem Time-lapse de galinha precoce embriões

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Microscopia de folha de luz isotrópica e análise de linhagem de células automatizadas para catalogar Caenorhabditis elegans Embryogenesis com resolução subcelular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

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