Name: three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. Geração de reprodutível Spheroids tumor do tamanho <ol><li> Lavar as monocamadas de células de tumor com fosfato salino tamponado (PBS, 5 ml de 25 cm2 ou 8-10 ml para um frasco de 75 cm2), adicionar enzima de dissociação de células (1 ml por 25 cm2 ou 2 ml de uma 75 centímetros 2 balão) e incuba-se as células a 37 ° C durante 2-5 min. </li><li> Verificar separação celular ao microscópio e neutralizar enzima de dissociação de células com meio de crescimento completo (5 ml de 25 cm2 ou 8 ml para um frasco de 75 cm2). </li><li> Centrífuga suspensão de células a 500 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante, tocar o tubo e re-suspender a pelete de células em 1 ml de meio de crescimento completo usando uma pipeta P1000. Isto deve produzir uma suspensão de células individuais, sem agregados de células. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e diluir a suspensão de células para se obter 0,5-2 x 10 4 células / mL (densidade celular óptima necessita de ser determinada para cada linha celular em Order obter esferóides tumorais de 300-500 uM diâmetro de 4 dias após a sementeira de células 12,13). </li><li> Transferir a suspensão de células para um reservatório esterilizado e, usando uma pipeta de canais múltiplos, dispensar 200 pL / cavidade de ultra-baixo de fixação (ULA) placas de 96 poços de fundo redondo 12. </li><li> Transferir as placas para uma incubadora (37 ° C, 5% de CO2, 95% de humidade). Quatro dias depois, confirmar visualmente formação esferóide tumor e prosseguir com o ensaio de invasão 3D. </li></ol> 2. 3D Tumor Esferóide Invasion Assay <ol><li> Descongele BMM no gelo. </li><li> Manter um conjunto de pontas de filtro estéreis para P10, P200 e P1000 pipetas e tubos estéreis (1,5 ml de volume ou maior, dependendo do volume total requerido) a -20 ° C. </li><li> Coloque as ULA placas de 96 poços contendo 4-dias de idade esferóides em gelo. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, remover suavemente a 100 ul / poço de meio de crescimento a partir das placas de esferóides. Para este ângulo de passo das pontas em relação ao inside parede dos poços de fundo em U, evitando o contacto com o fundo do poço e a localização dos esferóides; minimizar a perturbação dos esferóides. </li><li> Utilizando pontas geladas, transferir BMM para tubos gelados. Para invasão induzida por citocina ou para estudos de avaliação de medicamentos, adicionar os reagentes (em 2x a concentração final) para a BMM utilizando pontas gelada. Por exemplo, utilizar o factor de crescimento epidérmico (EGF) para estimular a invasão de células de carcinoma epidermóide CAL S e R CAL. Misture bem por agitação suave, evitando a formação de bolhas. </li><li> Suavemente dispensar 100 ul de BMM no poço de fundo em U, apontando a ponta na direcção da parede interior do poço. Este passo é o mais crítico como, por análise de imagem ideal, esferóides deve permanecer no centro do poço 12. </li><li> Repita o passo 2.6 para todos os poços necessários, permitindo 5-6 repetições / condição. Se necessário, mude para uma dica recém-refrigerados. NOTA: Quando mais experiente, dispenBMM se utilizando uma pipeta multicanal. </li><li> Usando uma agulha estéril, remover as bolhas, se estiver presente. <ol><li> Usando um microscópio, verificar visualmente que esferóides estão em uma posição central. Se não, a placa de centrifugar a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. Isso irá garantir que esferóides estão localizados centralmente em cada poço. </li></ol></li><li> Transferir a placa para uma incubadora a 37 ° C e permitem a BMM para solidificar. </li><li> 1 hora mais tarde, utilizando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar cuidadosamente 100 ul / poço de meio de crescimento completo. Para os estudos de avaliação de medicamentos de invasão ou induzida por citocinas, incluem citocinas ou inibidores no meio (concentração final de 1x). Em alternativa, se os reagentes não foram adicionadas à BMM na etapa 2.5, adicioná-los para o meio, neste ponto (3x a concentração final desejada). </li></ol> 3. Automated Image Acquisition <ol><li> Placas de digitalização no citômetro (ver Tabela de especificações de equipamentos e materiais) a intervalos starting desde o tempo zero (T0 = dia do ensaio de invasão configurado, imediatamente após o passo 2.10 até 72 horas, ou 96 horas para linhas de células de tumor invasoras mais lentas. </li><li> Selecione o aplicativo &#39;Confluence&#39;. </li><li> Verifique se o esferóide está em foco e, se necessário, ajustar manualmente e corrigir o &quot;Foco off-set &#39;. </li><li> Em &#39;definições de amostragem &quot;, selecione a varredura de um campo central de visão (FOV). Seguindo BMM disso, esferóides tumor deveria ter permanecido em posição central, portanto, não há necessidade de digitalizar todo o bem. </li><li> No software, definir os poços a serem verificados, destacando-os na placa de mapa. Clique em &quot;Start Scan&quot;. NOTA: A digitalização é guardado automaticamente e pode ser revisto mais tarde off-line. </li></ol> 4. Automated Análise de Imagem <ol><li> Selecione o aplicativo &#39;Confluence&#39;. </li><li> No separador &#39;Análise&#39;, ajuste application configurações (por exemplo, &quot;precisão&quot;:, alta baixa normal, &quot;; limiar de intensidade&quot;: 1 - 15) para produzir uma segmentação precisa em torno do esferóide, incluindo os processos celulares e invadopodia estendem no BMM (veja a Figura 1). Ajuste as configurações para cada linha de células tumorais e / ou em vários pontos de tempo. Medidas de aplicação da &quot;Confluence &#39;a% da área bem cobertos pelas células invasoras, no campo de visão selecionado. </li><li> Verifique se as definições de análise são apropriadas (isto é, a segmentação é preciso) para outros esferóides na placa clicando em alguns poços diferentes. Se a segmentação não descrever com precisão um esferóide, ajuste as configurações do aplicativo ainda mais. </li><li> Clique em &quot;Iniciar a análise&quot;. </li><li> No separador &#39;Resultados&#39;, verificar várias poços para verificar a qualidade de análise. Exportação &#39;Bem dados nível&#39; para um programa de planilha. </li><li> REPEAAnálise t para todos os pontos de tempo. Calcule a média% de confluência para poços em duplicado eo invasão plot (% de confluência) contra o tempo em um gráfico de barras, utilizando gráficos científicos e software estatístico de escolha. </li></ol> 5. Manual de Aquisição de Imagem <ol><li> Gravar uma imagem para cada esferóide do tumor a intervalos a partir de t = 0 até 72-96 horas, dependendo da velocidade de invasão da linha de células em questão, usando um microscópio invertido (para uma placa de 96 poços este leva aproximadamente 20 - 30 min). Use uma objetiva de 10X. Utilize uma objectiva de 4X quando uma área invadida é demasiado grande para ser completamente capturada dentro do campo de vista de 10X. </li><li> Salvar cada imagem individual adquirida. </li><li> Para a calibração, tomar imagens de um estágio graticule (1 mm), utilizando ambos os objetivos 10X e 4X (e salvar imagens). </li></ol> 6. Manual de Análise de Imagem <ol><li> Abra as imagens fase retícula no software de análise de imagem de escolha. </li><li> Digite o graticule medições, as unidades (um), os objectivos utilizado (10X ou 4X) e realizar a calibração. Esta etapa é necessária apenas uma vez. Para a análise de imagem posterior, simplesmente recarregar as configurações de calibração necessários. </li><li> Abra as imagens ensaio de invasão e selecione as configurações de calibragem, dependendo da objetiva do microscópio (10X ou 4X) utilizado para obter as imagens. <ol><li> Alternativamente, as imagens de importação obtidos num citómetro de imagem (passo 3) e analisar manualmente, como descrito para as imagens obtidas utilizando um microscópio invertido (ver os resultados apresentados na Figura 3 e Figura 4). </li></ol></li><li> Medir a área coberta pelos esferóides. <ol><li> No software usado aqui para os resultados representativos (ver Tabela de especificações de equipamentos e materiais), vá para &quot;Medir&quot; e selecione &quot;Contagem / size &#39;. Escolheu &#39;File&#39; depois &#39;Carregar definições &quot;e escolha pré-determinada assaconfigurações y. Em seguida, escolha &#39;Count&#39;. O esferóide deve então ser segmentada com precisão. </li><li> Outra alternativa é ir para &quot;Editar&quot; depois &quot;Desenhar / mesclar objetos &#39;para abrir a janela&#39; Magic Wand / Trace&quot;. Use o cursor varinha para clicar a imagem e obter esferóide em segmentação. Selecione &#39;Traço&#39; (na janela de &#39;Magic Wand&#39;) para traçar manualmente o esferóide usando um mouse. </li></ol></li><li> Exportação de medidas de diferentes parâmetros (área, diâmetro, perímetro etc.) para uma folha de cálculo. Record sobre a planilha a informação de imagem relevante (por exemplo, número bem, ponto de tempo relativo). </li><li> Traçar a área média de esferóides replicadas (invasão) versus tempo, utilizando gráficos científicos e software estatístico. Em alternativa, o cálculo da mudança na área de esferóide em cada ponto de tempo, em relação à área em t = 0. Em seguida, invasão trama (% t0) em função do tempo como uma gra linearpH. </li></ol>

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Todos os autores declaram não haver conflitos de interesses concorrentes.

Os dois modelos de tumor descritos aqui (glioblastoma e SCCHN) foram selecionados especificamente para exemplificar nosso ensaio 3D como eles são clinicamente cânceres invasivos localmente relevantes com uma necessidade não atendida de terapias eficazes 12. Após o tratamento de droga, a avaliação in vitro de alterações farmacodinâmica (PD) de biomarcadores pode ser efectuada facilmente por western blot ou imunoensaios de lisados ​​após o uso de reagentes disponíveis comercialmente específicas para permitir a recuperação das células a partir de BMM e / ou análise de imunofluorescência de invadir esferóides tumorais por toda coloração de montagem. Este ensaio de invasão é uma técnica útil para a avaliação rápida e reprodutível de invasão de células tumorais numa forma semi-sólida e, portanto, particularmente adequado para o futuro na triagem de drogas in vitro. As células cancerosas invadir a matriz de um modo 3D como espalham para fora a partir de um &quot;micro-tumores&quot;, representado pela esferóide do tumor, e se estendem até um extracellulambiente ar matriz-like. O verdadeiro tridimensionalidade do ensaio é evidente na morfologia celular, que é diferente do plano, morfologia aderente células assumem quando se desloca sobre um substrato sólido. O grau de invasão pode ser facilmente quantificado usando um citómetro de imagem, permitindo uma leitura automatizada para fora, ou através da utilização de um microscópio padrão em combinação com o software de imagiologia. Além disso, este método é adequado para imagiologia fluorescente 13 (por exemplo, com linhas de células que expressam proteínas fluorescentes ou pré-marcada com corantes fluorescentes). O método é simples de executar, com a única etapa crítica representada pela adição do BMM, quando existe um risco de perturbar a posição central do esferóide em forma de U bem. Isto pode resultar em sub-óptima de análise de imagem, com esferóides em diferentes planos focais. É, portanto, crucial para adicionar o BMM cuidadosamente e lentamente a cada poço. Depois de BMM Além disso, é aconselhável verificar a placasob um microscópio e se a localização é considerado inaceitável, esta pode ser corrigida por centrifugação suave. Com a experiência, isso raramente é necessário. Enquanto este método é muito robusta e reprodutível, variação inter-experimental poderia ocorrer com diferentes lotes de BMM. Para evitar isso, é aconselhável para adquirir suficiente BMM a partir de um único lote para completar uma série de estudos. Uma limitação do método (como por quaisquer ensaios) é a dificuldade em distinguir entre invasão e a proliferação, as células tumorais que provavelmente sofrer durante o período de tempo do ensaio. Embora o tempo de duplicação de células podem ser tomadas em conta, ou inibidores do ciclo celular, tais como citocalasina D introduzida, não é fácil de controlar ou claramente distinguir entre estes dois aspectos diferentes da progressão do tumor, especialmente para o rápido crescimento de células tumorais e para aqueles que têm uma forma mais &quot;expansivo&quot;, ao invés de infiltrativa, padrão de invasão. Por esta razãoSugere-se que um ensaio de crescimento 3D paralelo é realizado para avaliar os efeitos específicos de quaisquer agentes inibidores ou estimuladores. Se os estudos de resposta à dose cuidadosa são realizadas, pode ser possível para seleccionar concentrações que minimizem os efeitos sobre a proliferação. Por exemplo, têm mostrado que o inibidor de HSP90 17-AAG inibe U-87 MG 3D esferóide invasão tumor já às 24 h e a concentrações abaixo da concentração inibidora do crescimento 3D em 50% (GI50) 12. Por outro lado, o significado deste ensaio em comparação com outros ensaios de invasão padrão (por exemplo, ensaios baseados em filtros ou invasão de células individuais em matrizes 3D 1), é que as células de tumor invadir a matriz circundante do esferóide, que se assemelha a um &quot; micro-tumor &quot;ou um&quot; micro-metástases &quot;, e, portanto, leva em consideração aspectos importantes da fisiopatologia de uma massa tumoral. O método que apresentamos fornece informações sobre ocomportamento colectivo de células tumorais, quando saem inicialmente os esferóides, e também individualmente, quando as células individuais atingir regiões mais distantes no BMM. Além disso, as células tumorais dentro esferóides podem experimentar hipóxia e nutrientes privação que, através de mudanças na expressão gênica, podem promover a migração e invasão; tais características estão ausentes em ensaios 2D. Além disso, tudo isso está disponível num formato de alto rendimento, através da utilização de placas de 96 poços específicas e a última tecnologia de imagem, permitindo um ensaio de 3D mais complexo para ser facilmente utilizado em validação de alvos e descoberta de drogas. O método que apresentamos pode acomodar outros pedidos para tratar de aspectos adicionais de invasão das células tumorais. Em particular, a complexidade extra pode ser prevista através da adição de células hospedeiras, tais como os fibroblastos e / ou células endoteliais, no próprio esferóide ou a matriz circundante. Isto também pode ser modificado, não só em termos de rigidez (através da utilização de co diferentencentrations de BMM), mas também em termos de composição (por meio da adição de outros componentes dependentes do tecido / órgão específico do modelo adoptado tumor: por exemplo, para cancros do cérebro tenascina 16 e colagénio para o carcinoma da mama 17). Um conjunto semelhante para (geração de esferóides e de imagem) também podem ser adaptados para avaliar a invasão de tecidos em 3D, onde os esferóides de tumor forem co-cultivadas com corpos embrióides se assemelham a um tecido complexo 12 ou com outros Organóides específicos de células (por exemplo, para os astrócitos glioma 18 ou cripta culturas para cancros gastrointestinais), mas é necessário mais trabalho para permitir a análise de imagem automatizada.

O desenvolvimento de drogas anti-cancro Clássica é em grande parte incidiu sobre a utilização de ensaios in vitro baseados em células para o rastreio de agentes citotóxicos que inibem a proliferação de células tumorais e / ou promovem a morte celular programada (apoptose). Mais recentemente, os esforços têm movido para terapias específicas com o desenvolvimento de inibidores das causas moleculares subjacentes da proliferação de células malignas. Apesar de alguns resultados espectaculares, tais agentes são frequentemente associados com o rápido desenvolvimento de resistência às drogas. Dado que é o potencial invasivo e metastático de células tumorais, que é responsável pela maioria das mortes de cancro, e que a doença relapsed muitas vezes apresenta um fenótipo mais agressivo, é lógico também considerar complementar em modelos experimentais in vitro 1,2 para identificar novos agentes que inibem estas &quot;características&quot; essenciais adicionais de câncer. Durante a progressão maligna, as células tumorais adquirema habilidade de invadir os tecidos circundantes e / ou a propagação em órgãos distantes (metástases). As células cancerosas penetram na membrana basal pela formação de invadopodia 3,4. Estas estruturas são enriquecidos com filamentos de actina, proteínas de adesão e proteinases específicas e são colectivamente responsáveis ​​para a motilidade de células tumorais e a degradação da matriz extracelular (ECM) 5. Invadopodia se estender para o ECM e acredita-se ser importante para a invasão de células tumorais e também o extravasamento em canais vasculares, facilitando hematógena (ou linfático) e disseminação de metástases. Métodos padrão actuais para avaliar a invasão de células tumorais in vitro incluem o seguinte. Baseada em Transwell ou ensaios de câmara de Boyden 2,6 onde as suspensões de células únicas são semeadas em cima de um filtro revestido com uma camada de espessura de proteínas derivadas de ECM. As células, em seguida, invadir e mover para dentro da câmara inferior, em resposta a um quimio-atractor. Comumente usado ECMsão proteínas de colagénio tipo I, ou uma matriz de tipo membranar basal (BMM, por exemplo, Matrigel, derivada do tumor EHS 7) que mimetiza a composição natural de membranas basais. Como uma alternativa ao tipo de câmara de Boyden ensaios baseados-filtro de 8, as células podem ser semeadas no topo de um gel de ECM (a que podem ser adicionados fibroblastos), onde elas formam uma monocamada e, em seguida, individualmente ou colectivamente invadir no gel. Invasão pode ser medido em termos de número de células e / ou a distância percorridas invasoras da superfície do gel de 9. As células tumorais também pode ser totalmente incorporado dentro de uma matriz, quer como uma suspensão de células individuais ou como esferóides - geralmente colocados entre duas camadas de ECM, permitindo distribuição do gel para invadir células para fora da massa do tumor para dentro da matriz circundante 2,6,10,11. O ensaio em três dimensões (3D) esferóide invasão tumoral descrita aqui proporciona um sistema de invasão rápida, utilizando um automatizável highly método reprodutível, padronizada 12 num formato de placa de 96 poços com um esferóide por poço. BMM é adicionado directamente a cada cavidade para proporcionar uma matriz semi-sólido no qual as células de tumor invadir a partir do corpo esferóide. A extensão de invasão de células de tumor é monitorizado a intervalos ao longo de um período de 72-96 horas. Este método proporciona as seguintes vantagens sobre os actuais ensaios de invasão in vitro acima mencionadas: células do tumor são organizados dentro de uma estrutura 3D imitando um micro-região do tumor ou um micro-metástases; os esferóides tumorais são altamente reprodutíveis em tamanho; o ensaio de invasão é realizada in situ na mesma placa como desenvolvimento do tumor esferóide, sem a necessidade de movê-los para placas secundárias; o método, combinado com as tecnologias mais recentes de análise de imagem automatizado, permite que ambos os conteúdos de alta e análises de elevado rendimento de invasão de células tumorais. A análise de imagem é realizada utilizando um citómetro de imagem, que digitaliza um de 96 poçosplaca dentro de 10 min. Ao utilizar a aplicação de confluência, o grau e velocidade de invasão conseguido quer por células individuais ou grupos de células por espalhamento para fora a partir dos esferóides tumorais e invasão para a matriz pode ser medido de uma forma dinâmica. Para menor rendimento, um método alternativo para a análise de imagem é apresentado, baseado na utilização de um microscópio invertido e software de imagem padrão.

<table><tbody><tr><td>Corning Matrigel basement membrane matrix</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Corning</a></td><td>354234</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td></tr><tr><td>Cultrex basement membrane extract, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment 96-well plate</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Add 100 &amp;mu;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &amp;mu;g EGF. To 25 &amp;mu;l of this, add 4,975 &amp;mu;l RHB-A medium to give a 5 &amp;mu;g/ml working stock. Aliquot and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>RHB-A medium</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>For diluting EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Heat at 56 &amp;deg;C to inactivate complement before use</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Cell dissociation solution</td></tr><tr><td>Celigo cytometer</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td></tr><tr><td>IX70 inverted microscope</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>Used with camera for manual image capture</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>Attached to microscope for manual image capture</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Software used to control camera and microscope for manual image capture</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>Scientific graphing and statistical software</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>Scientific graphing and statistical software</td></tr></tbody></table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

Invasão de tecidos normais circundantes é geralmente considerada como uma característica essencial do maligno (em oposição a tumores benignos). Para alguns tipos de câncer, em particular (por exemplo, tumores cerebrais, tais como o glioblastoma multiforme e carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço -. SCCHN) é uma causa de morbidade grave e pode ser até mesmo na ausência de metástases à distância com risco de vida. Além disso, os cânceres que têm recaída após o tratamento, infelizmente, muitas vezes presente com um fenótipo mais agressivo. Portanto, existe uma oportunidade para atingir o processo de invasão para fornecer novas terapias que podem ser complementares aos agentes anti-proliferativos normais. Até agora, esta estratégia tem sido dificultada pela falta de robustos, ensaios reprodutíveis adequadas para uma análise detalhada da invasão e para o rastreio de drogas. Aqui nós fornecemos um método simples micro-placa (baseado em uniforme, de auto-montagem esferóides tumorais 3D), que tem um grande potencial para tal stumorre. Nós exemplificar a plataforma de ensaio que utiliza uma linha celular de glioblastoma humano e também um modelo de SCCHN, onde o desenvolvimento de resistência contra os inibidores do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) alvo está associada com uma maior potencial invasivo matriz. Nós também fornecemos dois métodos alternativos de quantificação semi-automático: uma usando um citômetro de imagem e uma segunda que apenas exige microscopia e captura de imagem padrão, com análise de imagem digital.

3D invasão esferóide tumoral é avaliada através de um método simples, reprodutível e automatizado ilustrado esquematicamente na Figura 1: esferóides de tumor de tamanho reprodutível são obtidos por sementeira de células em ULA placas de 96 poços de fundo redondo. 4 dias esferóides pós-iniciação são incorporados em BMM. Isto proporciona uma estrutura semi-sólido no qual as células de tumor invadir e espalhar-se do esferóide. Os esferóides são localizado centralmente na base de cada poço e invasão para a BMM é facilmente monitorizado a intervalos a partir de t = 0 até 72-96 horas utilizando um citómetro de imagem. Isto pode proporcionar análise de imagem totalmente automatizada. Exemplos de diferentes tipos de invasão de células do cancro encontram-se ilustrados nas Figuras 2 -. 4 A humana glioblastoma multiforme (GBM) linha de células altamente malignas U-87 MG, forma uma estrutura 3D esférico apertado e é utilizado aqui para exemplificar tumores cerebrais em que locais invasão é uma chave com risco de vidarecurso. Uma vez incorporado em BMM, as células de esferóides U-87 MG espalhar com um típico &quot;starburst&quot; padrão de invasão 12. As células tumorais se estendem radialmente para dentro da matriz em que se mantêm uma forma 3-dimensional. O processo é seguido durante um período de 72 horas como mostrado na Figura 2 para o U-87 MG esferóides, quando a extensão da invasão de células de tumor, com informações sobre os processos celulares e invadopodia estendem no BMM é claramente evidente. Totalmente automatizado de análise de imagem usando uma imagem citômetro permite a quantificação precisa da invasão das células tumorais ao longo do tempo. A quantificação na Figura 2 é obtida como ilustrado na Figura 1, onde a análise automatizada produz segmentação em torno das saliências de células que se prolongam para o BMM da L-87 MG corpo esferóide. Note-se que para esta linha de células, o corpo esferóide tumor é excluído a partir da medição da área invadida. Um padrão diferente de Invasion foi exibido pela cabeça e pescoço linhas celulares de cancro escamosas humanos. CAL CAL S e R são isogênico mas CAL S é sensível a, e CAL R resistente aos inibidores de tirosina-cinase EGFR 14. Na ausência de EGF, nem linha celular invadido no BMM (Figura 3) no entanto, como a concentração de EGF foi aumentada (para 2,5 ng / ml), os esferóides parecem &quot;bud». Nas concentrações mais elevadas de EGF (40 e 80 ng / ml) o grau de invasão foi reduzida. Isto é consistente com a resposta à dose em forma de sino clássica ao EGF em termos de invasão que tenha sido relatada previamente 15. Em 20 ng / ml de EGF, protuberâncias semelhantes a dedos, extrudados a partir do corpo principal de CAL R esferóides, enquanto as células S CAL eram menos invasiva, após 72 horas (Figura 3). Este diferencial de invasão foi evidente 48 horas após a esferóides foram colocados em BMM (contendo 20 ng / mL de EGF para distinção máxima entre linhas celulares) E maior após 72 h (Figura 4). Estas imagens foram obtidas rapidamente usando um citômetro de imagem, como por U-87 MG. No entanto, neste caso, para exemplificar um método alternativo, o grau de invasão foi quantificada manualmente usando software de análise de imagem independente e é apresentada graficamente (Figuras 3 e 4). Estes resultados ilustram uma diferença fenotípica entre células de drogas sensíveis e resistentes ao que poderia ser utilizadas para o rastreio de compostos que antagonizam a especificamente resistente, fenótipo invasivo droga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figura 1. Visão esquemática do ensaio de invasão esferóide tumor 3D. O fluxo de trabalho mostra os passos do método envolve incluindo imagens representativas de esferóides U-87 MG de glioblastoma apenas após incorporação em BMM (painel superior; t = 0) e após invasão<html> em BMM (painel inferior; t = 72 h) com e sem a segmentação que mede a área coberta pelas células invasoras. Bar = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figura 2. Tempo curso de invasão-U-87 MG glioblastoma esferóide em BMM. U-87 MG esferóides invasão 3D em BMM foi monitorizada e quantificadas até 72 horas utilizando um citómetro de imagem. (A) Imagens representativas e (B) de quantificação invasão de células de tumor são mostradas. Bar = 500 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. CAL R (resistente) e S CAL (sensível) esferóide invasão tumoral. (A) Imagens representativas e (B) o manual de quantificação dependente da dose de EGF CAL R e S CAL invasão tumoral esferóide são mostrados. Bar = 500 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figura 4. As células de CAL R (resistentes) esferóides são mais invasivos do que CAL S (sensíveis) esferóides tumorais quando colocado em BMM. Após a estimulação EGF CAL R esferóides tumorais mostram uma invasão mais pronunciada do CAL S. (A) Imagens representativas e (B) manual de quantificação de invasão são mostrados. Bar = 500 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

57.0K visualizações.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

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Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicina

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Pesquisa do câncer

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Modelos 3D em Biologia do Câncer: Dinâmica de Invasão em Heterosferóides

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autor em destaque: decifrando a diafonia entre câncer e células imunológicas durante a progressão do câncer de cabeça e pescoço

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

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