Culturas celulares bidimensionais não imitam adequadamente o crescimento do tumor in vivo. Para melhorar, procedimentos 3D foram desenvolvidos usando eferóides. Nosso ensaio glioblastoma spheroid 3D é particularmente adequado para investigar a invasão de tumores cerebrais no ambiente saudável do tumor cerebral.
Modelos de cultura tridimensional podem ser usados para recapitular uma arquitetura multicelular, heterogeneidade e estado metabólico de tumores permitindo uma avaliação mais rigorosa dos efeitos medicamentosos. Certifique-se de não tocar na parte inferior do poço ou remover completamente o supernasce, manter o gel no gelo e adicionar as células ao gel rapidamente. Para gerar esferoides tumorais de tamanho uniforme, primeiro lave a cultura celular tumoral de interesse com cinco mililitros de PBS e trate as células com 0,5 a um mililitro de enzima dissociação.
Após cinco minutos a 37 graus Celsius, pare a reação com quatro a 4,5 mililitros de PBS e transfira as células separadas para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de crescimento completo. Após a contagem, resuspenque as células em uma vez 10 a 10 a sexta células por oito mililitros de meio de crescimento completo complementados com dois mililitros de concentração de 2% de metilcelulose e transfira a suspensão para um recipiente de sistema estéril. Em seguida, adicione 100 microliters de células a cada poço de uma placa inferior redonda de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius 5% por três a quatro dias.
Para realizar um ensaio de invasão, quando as células tumorais formaram esferoides de tamanho uniforme, transfira cada estrutura celular para um tubo de 500 microliteres e lave os esferoides uma vez com 200 microliters de PBS. Após a segunda lavagem, transfira cuidadosamente os esferoides em 100 microliters de matriz de colágeno recém-preparada e adicione cada suspensão esferoide no centro de cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços. Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, adicione 100 microliters de meio de crescimento completo em cima do gel em cada poço.
Certifique-se de colocar todos os esferoides no centro de cada poço para a melhor imagem da invasão celular tumoral. Para realizar um ensaio de migração, quando as células tumorais formaram esferoides de tamanho uniforme, cubra uma placa de seis poços com 0,2 miligramas por mililitro de Matrigel em meio de crescimento por 30 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, remova o Matrigel e adicione dois mililitros de meio de crescimento completo a cada poço.
Transfira os esferoides da placa inferior redonda em volumes de 50 microliteres em poços individuais da placa de seis poços e coloque a placa na incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, manche os esferoides com 10 nanogramas por mililitro de Hoechst por 30 minutos a 37 graus Celsius. Para aquisição de imagens após um ensaio de invasão ou migração, coloque a placa no palco de um microscópio confocal Brightfield equipado com uma câmera de vídeo e obtenha imagens durante o período experimental apropriado.
Para analisar as imagens de forma semi-automatizada, importe as imagens para Fiji e clique em Plugins, Macros, Interactive Interpreter. Copie e cole o laço roxo adaptado. Mantenha as frases roxas e adicione as frases verdes de interesse conforme necessário.
Em seguida, para medir a área de cada esferoide, clique em Analisar e Medir. Para medir a hipóxia em áreas distintas da estrutura esférica, a coloração de anidraidese carbônica IX pode ser usada para determinar a atividade hipóxica. Nesta análise representativa, foram observadas mais células positivas de anidrase carbônica IX no centro esferoide.
Células hipóxicas localizadas no núcleo esferoide tendem a ser mais glicólticas do que as células ao redor do núcleo. Mitocôndrias podem ser imagens por microscopia eletrônica para análise posterior. O diâmetro esferoide está diretamente correlacionado com a densidade das células que compõem a estrutura celular 3D e as macros fiji podem ser usadas para quantificar a proliferação, invasão ou migração das células dentro de cada esferoide ou migração das células dentro de cada esferoide.
Aumentos no núcleo esferoide refletem a estimulação da proliferação celular. Após a inibição do complexo I da cadeia respiratória mitocondrial, a grande maioria da produção de ATP nas mitocôndrias está comprometida reduzindo a proliferação em 20% após 72 horas. O tratamento do cloreto de hidrogênio aumenta a invasão do tipo colágeno I durante um período de 24 horas, mas reduz a área migratória dos esferoides 1,5 vezes em comparação com o controle de esferoides não tratados.
Conforme avaliado por imagens ao vivo, os esferoides demonstram alta dinâmica interna e se movem rapidamente. O tamanho dos esferoides deve ser relativamente uniforme e devem ser tomados cuidados para manipular os esferoides para o centro dos poços para obter os melhores resultados de imagem. Este método também pode ser usado para investigar a proliferação de células tumorais, migração e morte, bem como a expressão de matriz extracelular, receptores celulares ou proteínas intracelulares de interesse.
Os esferoides também podem ser encapsulados e o efeito do aumento da tensão da superfície celular pode ser investigado após a remoção das cápsulas.
