Estratégia alternativa para analisar a invasão celular in vitro de culturas 3D

Nosso grupo de pesquisa se concentra principalmente na conversa cruzada entre câncer e células imunológicas. Nosso objetivo é investigar o impacto de vários mecanismos biológicos na evolução do câncer de cabeça e pescoço por meio da modulação da imunidade tumoral. O objetivo deste protocolo é avaliar a invasão dentro da matriz extracelular e a colocalização espacial de diferentes tipos de células em um contexto multicamadas.

A vantagem deste protocolo é o uso de heterosferóides incorporando dois tipos de células não neoplásicas relevantes ao lado de células cancerígenas para analisar a invasão com matriz extracelular em direção a uma membrana microporosa e estímulos de quimiotaxia. Para começar, adicione nanopartículas magnéticas à suspensão celular e misture 10 vezes. Centrifugue as células a 400G por cinco minutos em temperatura ambiente e misture 10 vezes para ressuspender as células.

Em seguida, transfira e misture todas as células em um novo tubo para co-cultura e dispense 100 microlitros de células co-cultivadas em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa. Insira o campo magnético de acionamento do esferóide sob a placa para induzir a agregação e a formação de esferóides e coloque-o na incubadora por três horas. Usando uma ponta de 200 microlitros, adicione 50 microlitros de ECM ao centro de uma membrana microporosa de 24 poços.

Remova as bolhas com uma agulha estéril, garantindo que a matriz cubra uniformemente a superfície da membrana. Incube a membrana por uma hora a 37 graus Celsius para a formação de gel. Para começar, prepare a cultura de células 3D e a membrana microporosa revestida com matriz extracelular.

Adicione 500 microlitros de meio de cultura, suplementado com 10% de soro bovino fetal na câmara inferior da membrana microporosa como um atrativo de quimioterapia. Em seguida, remova cuidadosamente o meio dos heterosferóides formados e adicione suavemente 50 microlitros de meio fresco não suplementado por poço sobre o esferóide. Usando uma tesoura estéril, corte a borda de uma ponta de baixa retenção de 200 microlitros e colete o esferóide, junto com 50 microlitros de meio.

Coloque suavemente o esferóide no topo da matriz extracelular. Em seguida, adicione cuidadosamente 150 microlitros de meio não suplementado gota a gota para atingir um volume total de 200 microlitros. Coloque a placa na incubadora por 48 horas.

Clique em arquivo no software de análise. Selecione abrir, escolha a imagem e clique em OK. Em seguida, clique em analisar, seguido de definir medidas para selecionar a área, densidade integrada e exibir o rótulo.

Clique em OK. Por fim, clique em analisar e depois em medir. As imagens de campo claro representam a localização de esferóides ou células, identificadas por conglomerados escuros ou pretos.

As imagens das diferentes células exibiram variação na intensidade e quantidade de fluorescência em diferentes imagens ao longo do eixo Z, indicando diferentes padrões de proliferação e invasão entre as células. Usando microscopia confocal, diferentes canais foram sobrepostos para visualizar os padrões de colocalização durante a invasão. A análise das imagens dos resultados representativos apresentados indicou que os monócitos invadem primeiro, seguidos pelas células neoplásicas, e os fibroblastos são as últimas células a invadir a matriz extracelular.