Descobrimos recentemente que muitas células B em zebrafish LCK GFP expressam baixos níveis de GFP. Isso faz desta linha uma ferramenta útil para estudar células B, bem como células T. A principal vantagem dessa técnica é que agora podemos estudar células B e células T a partir de zebrafish LCK GFP ou podemos estudar células B-ALL e T-ALL de peixes com câncer.
Esses métodos permitem o desenvolvimento de células B e estudos B-ALL em zebrafish. Que são relevantes para entender o sistema imunológico adaptativo e são malignidades comuns no câncer pediátrico. Se você nunca fez essas dissecções antes de querer refinar sua técnica algumas vezes até que você possa obter boas amostras de timo e medula.
A demonstração visual ajudará os espectadores a reconhecer fluores e B-ALL em peixes e selecionar as configurações corretas para discriminar células B e T para seu isolamento. Após anestesiar com 0,02% Tricaine no sistema de peixes, use o filtro GFP em um microscópio de epifluorescência para examinar o zebrafish de dois a seis meses de idade para a timmi fluorescente no aspecto medial dorsal da cavidade ramificada. Depois de localizar o timo coloque peixes eutanizados em uma placa de Petri e use o microscópio fluorescente para remover o timmi positivo GFP.
E configurações de microscopia brightfield para colher a medula renal e baço. Coloque cada órgão coletado em um tubo de 1,5 mililitro contendo 500 microliters de meio de triagem fria e use um homogeneizador de microtubo piloso para homogeneizar os tecidos no gelo. Em seguida, coe o tecido homogeneizado através de um filtro de malha de 35 micrômetros para gerar uma única suspensão celular e colocar as células no gelo.
A partir de dois a quatro meses, use um microscópio fluorescente para tela de rag2:hMYC LCK EGFP utilizando configurações de baixa exposição para identificar leucemia linfoblástica aguda de células T brilhantes ou T-ALL e configurações de alta exposição para identificar animais B-ALL dim. Controle do tipo selvagem e peixes pré-leucínmicos têm GFP localizado apenas no timo. Categorize o peixe com base na extensão da fluorescência GFP usando um sistema simples de três categorias.
Peixes de nível um demonstram um sinal fluorescente como um tumor tilamico com apenas uma propagação local limitada. Peixes de nível dois demonstram um sinal fluorescente além do timo envolvendo menos de 50% do corpo. E os peixes nível três demonstram um sinal fluorescente que se estende além de 50% do corpo.
Separe o peixe com ALL daqueles sem câncer. E monitore os peixes pré-leucínmicos sem tumores positivos de GFP uma vez por mês para o desenvolvimento de novos ALL. Para isolamento de células T ou B-ALL use uma lâmina de barbear para remover a cabeça e a região timimática de um peixe de nível três eutanizado e colocar o corpo em uma placa de petri.
Use uma pipeta P-1000 para lavar a cavidade peritoneal do peixe com 500 microliters de meio de triagem fria, coletando as células e o meio em um tubo de cinco mililitros. Usando uma ponta de pipeta fresca, injete de 2 a 300 volumes adicionais de 200 a 300 microliter de meio de triagem fria na cavidade corporal e use a ponta da pipeta para aplicar pressão suave ao corpo do peixe para extruir as células da cavidade corporal no tubo de cinco mililitros. Em seguida, coe a suspensão celular através de um filtro de malha de 35 microliter.
E coloque as células no gelo até que sua análise por citometria de fluxo. Para a homogeneização do corpo inteiro use um homogeneizador de microtubo pilão para homogeneizar o corpo do peixe e adicionar mais 300 microliters de meio de triagem fria ao tubo. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de malha de 35 micrômetros, lavando o filtro com meio de classificação adicional conforme necessário, até que apenas os detritos de tecido permaneçam no filtro.
Em seguida, coloque as células no gelo até sua análise. Para análise citométrica de fluxo das células isoladas, de acordo com as diretrizes do fabricante, as células do fluxo estabelecem os parâmetros do citômetro de fluxo. E adquira 10.000 a 50.000 eventos para definir os parâmetros de dispersão e dispersão lateral para definir os portões celulares linfócitos e progenitores e excluir os detritos celulares.
Exclua os dobradores celulares e use os portões linfoides e/ou precursores para determinar o número e a porcentagem das células positivas do GFP. O uso de ficoerthrina e as intensidades GFP definem portões para as células negativas GFP versus GFP baixas versus GFP. Aprender onde colocar os portões para isolar as células altas GFP e GFP é fundamental para obter populações puras de células B e T.
Duas populações positivas de GFP distintas, células B baixas GFP e células T altas GFP podem ser obtidas a partir do timo. As células B residentes na medula renal de zebrafish de três meses de idade expressam baixos níveis de GFP. As células altas do GFP são escassas, no entanto, indicando que apenas uma pequena porcentagem de linfócitos T estão presentes na medula aos três meses de idade.
Da mesma forma, as amostras esplênicas mostram percentuais mais elevados de GFP baixos do que as células altas de GFP. Em peixes transgênicos duplos que ainda não desenvolveram leucemia linfoblástica aguda, a expressão GFP no timo, medula e baço é semelhante à observada em peixes LCK EGFP uni transgênicos. No entanto, o número de linfócitos por órgão é aumentado.
Presumivelmente, devido à expansão impulsionada pelo MYC de populações imaturas de células B e T nas quais o promotor rag2 está ativo. Em peixes transgênicos duplos com B e ou T-ALL que desenvolveram cânceres fluorescentes por seis meses B-ALL são cânceres vagamente fluorescentes contendo principalmente células baixas de GFP. Em contraste, peixes brilhantemente fluorescentes podem abrigar populações isoladas de T-ALL ou mistas de células B-ALL baixas e T-ALL de GFP.
De fato, como avaliado pela análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase, as células baixas do GFP expressam níveis mais elevados de transcrições celulares B. E as células altas do GFP expressam níveis mais altos de genes de células T, LCK e o marcador GFP. É fundamental aprender a reconhecer peixes com B-ALL por microscopia.
E como definir adequadamente os portões de citometria de fluxo para separar as populações baixas e gfp baixas e gfp. Após este procedimento, você pode isolar DNA, RNA ou proteína de células altas GFP e GFP para PCR, sequenciamento, o que está em experimentos de transplante de sangue ou in vivo. Uma vez que aprendemos que os peixes LCK GFB têm células B fluorescentes, além de células T, poderíamos estudar ambos os tipos de células do mesmo animal para avaliar B e T-ALL.
