1. Preparação agregado para a medição da tensão superficial do tecido. Para células aderentes, esferóides podem ser formadas usando o método da gota pendente ou através da geração de uma folha coerente de células que podem então ser cortada em fragmentos 1 mm. Formação de agregados pelo método de gota em suspensão: <ol><li> Quase confluentes culturas de células aderentes devem ser cultivadas a confluência de 90%, quando então monocamadas devem ser lavados duas vezes com PBS. Depois de drenar bem, adicionar 2 ml (para 100 placas mm) de 0,05% de tripsina-EDTA 1 mM, e incubar a 37 ° C até que as células detach. Parar tripsinização adicionando 2 ml de meio completo e gentilmente usar uma pipeta de 5 ml para triturar a mistura até que as células estão em suspensão. Transferência de células para um tubo de 15 ml. </li><li> Adicionar 40 mL da solução estoque a 10 mg / ml DNAse e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Brevemente Vortex e centrifugar a 200 xg por 5 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante e lavar pellet com 1 ml completa meio de cultura de tecidos. Repita, então as células ressuspender em 2 ml de meio completo de cultura de tecidos. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro, ou contador de células automatizado e ajustar a concentração para 2,5 x 10 6 células / ml. </li><li> Remova a tampa de um prato de 60 milímetros de cultura de tecidos e coloque 5 ml de PBS no fundo do prato. Este funcionará como uma câmara de hidratação. </li><li> Inverter a tampa e use uma pipeta de 20 l para depositar 10 gotas mL para o fundo da tampa. Certifique-se que gotas são colocadas suficientemente distante para não tocar. É possível colocar pelo menos 20 gotas por prato. </li><li> Inverter a tampa do PBS-cheia câmara inferior e incubar a 37 ° CO C / 5% 2 / 95% de umidade, monitorar as gotas diárias e incubar até folhas ou células ou agregados formaram. </li><li> Uma vez que formam folhas, podem ser transferidos para fundo redondo de vidro shaker frascos contendo 3 ml de meio completo e incubados em um agitador banho maria a 37 ° C e 5% CO 2 até formar esferóides. </li></ol> Formação de agregados pelo método de camada de células: <ol start="9"><li> Suspensões de células individuais são preparadas como descrito acima, mas a concentração é ajustada para 1x10 6 células / ml. </li><li> Transferência de 3 ml de suspensão de células de 10 ml de fundo redondo de balões (Belco, Vineland, NJ). </li><li> Incubar frascos em um banho de água giratórios / agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 37 ° C, 5% de CO 2 para 4h de 120 rpm até que as células se recuperar de tripsinização. </li><li> Transferência de células para um tubo de centrífuga de vidro de fundo redondo e centrifugar a 200 X g em um pellet fina. Incubar por mais 24 h até formar uma folha coerente. </li><li> Agite suavemente o tubo de cultura para desalojar a folha e despejar o conteúdo do tubo de cultura em um pequeno prato de vidro estéril, cultura de tecidos. </li><li> Use micro bisturis para cortar as folhas em fragmentos de vários tamanhos. </li><li> Incubar fragmentos a 37 ° C no banho de água giratórios shaker a 120 rpm com menos de 5% CO 2 por 2 a 3 dias ou até que se tornem esféricos. </li></ol> 2. Medição da tensão superficial agregado <ol><li> O tensiômetro superfície do tecido. O aparelho é mostrado nas Figs. 1 e 2. A célula de compressão (Fig. 3) é composto por duas câmaras. A câmara externa (OC) é conectado a uma bomba de 37 ° C água circulante, e serve para regular a temperatura da câmara interna (CI). As câmaras são construídas de Delrin moído e conter janelas de quartzo para a visualização do agregado. Quanto menor a montagem (LA) parafusos na base da câmara interna e é utilizada para: 1) a posição do agregado na câmara interna; 2) selar o fundo da câmara interna; 3) elevar o total para iniciar a compressão e (4 ) controlar a distância entre as placas paralelas e, portanto, a compressão do agregado. O núcleo central (CC) do conjunto é ajustável. A ponta do núcleo central (o pedestal) é composto de Teflon liso e atua como a placa de compressão mais baixa (LCP). A placa de compressão superior (UCP) é um cilindro de teflon 15 milímetros de comprimento que trava do braço de equilíbrio (B) por uma chama-se endireitou fio de níquel-cromo (NCW) *. Durante o curso de um experimento, o agregado de células (A) está posicionada na parte inferior do prato e levantou até que os contatos da placa superior. A placa superior está ligado ao braço de equilíbrio (B). Compressão do agregado causas deslocamento do braço equilíbrio. A balança é um Cahn / Ventron modelo electrobalance gravação de 2000, que opera no princípio de equilíbrio nulo. O fulcro do braço equilíbrio tem uma armadura dentro de um campo magnético permanente. Quando o saldo está operando, continuamente modula a corrente que passa através do conjunto eletromagnético, que por sua vez mantém o braço de equilíbrio na posição horizontal. Quando um objeto é suspenso a partir do braço de equilíbrio, a tensão, que se aplica o equilíbrio para manter o braço na horizoposição ntal, é proporcional ao peso do objeto. Esta tensão mede a força externa aplicada a compressão do agregado. Forma da agregação é monitorado por observação visual através de um estereoscópio Nikon x 25 SMZ10A acoplado a um computador equipado com uma placa de captura. A fim de minimizar a adesão de agregados celulares para as placas de compressão, ambas as placas de compressão inferior e superior foram revestidos com poli (2-hydroxyethylmethacrylate) {poli (HEMA)}, um material polimérico a que as células não aderem 16. * O fio é chama-se endireitou por enforcamento um comprimento de 15 polegadas de fio a partir de uma posição de aperto retorta e um clipe de binder pequeno até o fim. Um bico de Bunsen é, então, corra para cima e para baixo o comprimento do fio até o fio de luz vermelha. O fio esticado pode então ser cortada em comprimentos apropriados. Um pequeno gancho é formado por dobrar o fio cerca de ¼ de polegada a partir do final usando duas lâminas de barbear. A outra extremidade é então inserido no cano da placa de compressão mais baixa. </li><li> Compressão agregado. <ol><li> A câmara interior é preenchido com pré-aquecido CO 2-meio de cultura independente do tecido (Gibco / BRL, NY). </li><li> Agregados variando em tamanho de cerca de 200-300 μ são posicionados na placa de compressão mais baixa (Fig. 4A). Agregados são carregados por um agregado de aspiração em meio de cultura de tecidos metade do caminho até a ponta de uma pipeta Pasteur equipado com uma lâmpada de silicone, transferindo a pipeta para a câmara interior, eo posicionamento da ponta da pipeta sobre a LCP. O agregado é então gentilmente expulsos para o LCP, pressionando ligeiramente o bulbo. Alternativamente, o agregado é permitida a cair por gravidade para a LCP. </li><li> A placa de compressão superior (UCP) está posicionado acima do agregado e deixado em repouso, estabelecendo uma linha de base pré-compressão peso aparente UCP. </li><li> A LCP é então levantado até que a soma é comprimida contra a UCP (Fig. 4B). Ajustar a altura do núcleo interno da parte inferior do aparelho irá controlar diferentes graus de compressão. Compressão é monitorada pela observação através de um microscópio de dissecação equipado com uma câmera de vídeo CCD. </li><li> Imagens agregada são capturados, digitalizados e analisados ​​utilizando ImageJ. Mudança de peso aparente UCP é continuamente gravadas em um registador de agulhas, a realização de equilíbrio de forma a ser indicada pelo nivelamento da tensão de saída da balança Cahn. Cada agregado é submetido a dois diferentes graus de compressão. </li></ol></li><li> Cálculo da tensão superficial agregado. No equilíbrio, forma a coesividade de um agregado de células comprimido entre placas paralelas a que não adere podem ser obtidas a partir da equação de Young-Laplace (Fig. 5), onde σ é coesividade, F é a força que age para comprimir o agregado , πr 3 2 é a área da superfície do agregado em que F força é exercida, e R 2 e R 3 são, respectivamente, o raio do equador do agregado comprimido eo raio de um arco definir seu perfil de superfície normal para a compressão de placas e estendendo entre eles (Fig. 6). Medir a força de compressão e da geometria com força e equilíbrio de forma e aplicar essas medidas para a equação de Young-Laplace gera valores numéricos de tensão aparente tecido da superfície. Ao atingir o equilíbrio e cálculo de σ 1, os agregados são descompactados e permitiu a abordagem de um equilíbrio de segundo e σ 2 é calculado conforme descrito acima. </li><li> Confirmação da liquidez agregada. A tensão superficial calculada de um agregado líquido, quando submetido a duas compressões diferentes permanecerá constante. Em tais agregados a relação entre σ 2 / σ 1 será igual a 1 e será menor do que a razão entre a força aplicada em cada compressão sucessivas (F 2 / F 1). Em contraste, a tensão superficial calculada de um agregado elástica vai obedecer à lei de Hooke e aumentar proporcionalmente à força aplicada. Para os agregados elástica a relação entre σ 2 / σ 1 não será igual a 1, mas em vez disso, a abordagem da relação de F 2 / F 1. A tensão superficial dos agregados líquidos também será independente do tamanho total 2,17. Medições apenas em que a tensão de superfície é independente da força aplicada e tamanho são usados ​​para calcular σ média para cada linhagem celular. </li></ol> 3. Resultados representativos: Abaixo está uma tabela de resultados TST típicos para agregados de fibroblastos de rato próstata (RPF) e próstata de ratos células musculares lisas (RPSMC). Como pode ser visto na fig. 7 agregados de células RPF tem uma tensão superficial de 22,8 ± 1,1 dinas / cm. Além disso, os valores de temperatura média tensão medida após a compactação 1 e após a compressão 2 foram estatisticamente identical, quando comparados por um teste t pareado. Também comparamos os índices de σ 2 / σ 1 e F 2 / F 1 para garantir que estes agregados não obedeceu a lei de Hooke, como fariam se eles se comportaram como sólidos elásticos. Conforme demonstrado na Tabela 1, a proporção de σ 2 / σ uma abordagem realmente 1.0. Além disso, a proporção de F 2 / F 1 foi significativamente maior que σ 2 / σ 1 (teste t pareado, P &lt;0,05), confirmando que estes agregados não obedecem a lei de Hooke e de fato se comportam como líquidos. Em contraste RPSMCs obedeceu a lei de Hooke. Como é evidente na Tabela 1, a relação entre σ 2 / σ 1 é significativamente maior que 1 e não foi estatisticamente diferente do que a de F 2 / F 1. Para demonstrar ainda mais líquido como o comportamento, que explorou a relação entre a tensão superficial (σ) e volume agregado. Como pode ser visto na fig. 8 de volume é independente do sigma para células RPF (linha de regressão vermelho, r 2 = 0,002), enquanto parece haver alguma dependência da sigma no volume de RPSMCs (linha de regressão azul, r 2 = 0,146). Estes dados confirmam que agrega RPF se comportam de maneira semelhante líquido, enquanto que os de RPSMCs parecem se comportar mais como sólidos elásticos. Somente aqueles obtidos a partir de agregados mesurements comportando-se como líquidos seriam usados ​​para calcular a tensão superficial. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Visão geral do tensiômetro superfície do tecido. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Uma visão mais detalhada da câmara de tensiômetro (painel direito). <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Visão esquemática da câmara de tensiômetro. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Imagens de descompactado (A) e comprimido (B) agregados. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. A Equação de Laplace. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Diagrama de uma gota de líquido comprimido entre duas placas paralelas a que adere mal, em equilíbrio forma. R 1 e R 2 são os dois raios de curvatura principal, no equador da gota e em um plano através do seu eixo de simetria, respectivamente. R 3 é o raio da área circular a gota de contato com qualquer placa de compressão. H é a distância entre as placas de compressão superior e inferior. X é um lado de um triângulo retângulo com hipotenusa R 2 estendendo-se até um ponto de contato entre a superfície da gota e nem placa de compressão. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> σ 1 (dinas / cm ± SEM) </td><td> σ 2 (dinas / cm ± SEM) </td><td> Pσ 1 vs 2 σ </td><td> σ 1,2 (dinas / cm ± SEM) </td><td> σ 2 / σ 1 </td><td> F 2 / F 1 </td><td> Pσ 2 / σ 1 e F 2 F 1 </td></tr><tr><td> RPF </td><td> 22,6 ± 1,7 </td><td> 22,9 ± 1,4 </td><td> &gt; 0,05 * </td><td> 22,8 ± 1,1 </td><td> 1,04 ± 0,04 </td><td> 1,47 ± 0,06 </td><td> &lt;0,05 </td></tr><tr><td> RPSMC </td><td> 15,0 ± 2,8 </td><td> 23,0 ± 3,2 </td><td> 0,039 </td><td> NA </td><td> 1,9 ± 0,3 </td><td> 1,6 ± 0,1 </td><td> 0,16 * </td></tr></tbody></table> Figura 7. Medições TST e confirmação de liquidez agregada para agregados de fibroblastos de rato próstata e células musculares lisas. <img src="/files/ftp_upload/2739/2739fig8.jpg" alt="Figura 8"/> Figura 8. Relação entre sigma e volume de agregados de RPF (linha vermelha) e RPSMCs (linha azul).

<ol>
	<li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Schotz, E. -. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha5beta1+integrin-fibronectin+interactions+specify+liquid+to+solid+phase+transition+of+3D+cellular+aggregates.">Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates.</a> PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tumor+cell+cohesion+and+suppression+of+invasion+by+E-+or+P-cadherin.">Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin.</a> Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).</li><li>Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+up-regulates+cadherin+expression+and+cohesion+of+HT-1080+human+fibrosarcoma+cells.">Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells.</a> Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).</li><li>Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+measurement+of+brain+tumor+cohesion.">Biophysical measurement of brain tumor cohesion.</a> Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).</li><li>Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensiometry:+a+novel+technique+for+predicting+invasive+potential+of+prostate+tumors+based+on+tumor+cell+aggregate+cohesivity+in+vitro.">Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro.</a> Surgical Forum L. , 707-708 (1999).</li><li>Folkman, J., Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+shape+in+growth+control.">Role of cell shape in growth control.</a> Nature. 273, 345-349 (1978).</li><li>Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+properties+of+embryonic+tissues:+Measurement+of+interfacial+tensions.">Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions.</a> Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).</li><li>Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+of+biological+viscoelastic+drops.">Aspiration of biological viscoelastic drops.</a> Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Medir a coesão agregado pelo TST é relativamente simples. Há, no entanto, passos-chave que devem ser dominados, a fim de gerar dados TST utilizável; 1) agregados deve ser &quot;saudável&quot;. Isto pode ser controlado, garantindo que a formação de agregados começa com as células que estão na confluência ideal antes de desapego. Tamanho agregado eo tempo na cultura também deve ser controlado para minimizar o desenvolvimento de um núcleo necrótico dentro do agregado; 2) Outro parâmetro que pode influenciar ...

<ul><li> água do banho / agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) </li><li> 10 ml de fundo redondo de balões (Belco, Vineland, NJ) </li></ul>

measurement of aggregate cohesion by tissue surface tensiometry

Medição rigorosa de energia de ligação intercelular só pode ser feita através de métodos baseados em princípios termodinâmicos em sistemas em equilíbrio. Nós desenvolvemos tensiometria tecido da superfície (TST) especificamente para medir a energia livre de superfície de interação entre as células. Os conceitos biofísicos subjacentes TST têm sido descritos anteriormente em 1,2 detalhe. O método é baseado na observação de que células mutuamente coesa, se mantida em agitação cultura, espontaneamente montar em clusters. Ao longo do tempo, esses grupos irão arredondar para cima para formar as esferas. Este comportamento arredondamento imita o comportamento característico de sistemas líquidos. Energia de ligação intercelular é medido através da compressão agregados esférico entre placas paralelas em um tensiômetro de superfície de design personalizado tecido. A mesma equação matemática usada para medir a tensão superficial de uma gota de líquido é usado para medir a tensão superficial do tecido 3D-como agregados esféricos. O equivalente celular de tensão superficial líquido é energia de ligação intercelular, ou, mais geralmente coesividade tecidos,. Estudos anteriores de nosso laboratório mostraram que a tensão de superfície de tecido (1) prevê como dois grupos de células embrionárias vão interagir uns com os outros 1-5, (2) pode influenciar fortemente a capacidade dos tecidos para interagir com biomateriais 6, (3) pode ser alterada, não só através da manipulação direta da caderina-base da coesão intercelular 7, mas também pela manipulação de moléculas-chave ECM, como FN 11/08 e 4) se correlaciona com o potencial invasivo de câncer de pulmão 12, 13 fibrossarcoma, tumor cerebral 14 e tumor de próstata linhagens de células 15. Neste artigo vamos descrever o aparelho detalhe, os passos necessários para gerar esferóides, para carregar o esferóides na câmara de tensiômetro, para iniciar a compressão agregado, e analisar e validar as medições de superfície de tecido tensão gerada.

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Nós descrevemos um método de medir energia de ligação, expressável como tensão superficial do tecido, entre as células dentro do tecido 3D-como agregados. Diferenças na tensão superficial do tecido têm demonstrado correlação com invasão do pulmão, músculos e tumores cerebrais, e são determinantes fundamentais de estabelecer relações espaciais entre diferentes tipos celulares.

Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

measurement-of-aggregate-cohesion-by-tissue-surface-tensiometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K visualizações.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. Nós descrevemos um método de medir energia de ligação, expressável como tensão superficial do tecido, entre as células dentro do tecido 3D-como agregados. Diferenças na tensão superficial do tecido têm demonstrado correlação com invasão do pulmão, músculos e tumores cerebrais, e são determinantes fundamentais de estabelecer relações espaciais entre diferentes tipos celulares.

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Bioengenharia

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Preparação de Membranas de Luz respondem por um enxerto de superfície combinada e Processo Postmodification

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Detecção de Exosomal Biomarker por induzida pelo campo elétrico de lançamento e Mensuração (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Methods Article

Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido