Perfusão Normotérmica Ex-Vivo em Máquina de Fígado em Camundongo. A perfusão hepática oxigenada normotérmica é uma estratégia promissora para o resgate de órgãos marginais e foi recentemente introduzida na prática clínica. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes não são bem compreendidos.
Um modelo de camundongo é necessário para aprofundar o estudo das vias moleculares, aproveitando animais geneticamente modificados, como camundongos transgênicos, aguardando, portanto, o estabelecimento de um sistema normotérmico de perfusão por máquina oxigenada para fígados de camundongos. Aqui está um esquema de todo o nosso sistema. Primeiro, todo o sistema é controlado a 37 graus centígrados por um controlador termostático através da circulação da água.
O perfusato é bombeado do reservatório por uma bomba peristáltica para um oxigenador. Há um fluxo ininterrupto de gás de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono no oxigenador. O perfusato então passa por uma armadilha de bolhas.
O perfusato com bolhas de ar é bombeado de volta para o reservatório sob pressão. O perfusato remanescente flui para a câmara do órgão, onde o tubo é conectado à veia porta. O perfusato é drenado do fígado através da cava supra-hepática para a câmara do órgão.
A saída do perfusato da câmara orgânica é direcionada de volta ao reservatório pela bomba peristáltica. Um tubo de drenagem biliar é conectado à câmara do órgão para coletar a bile. Esta é a nossa mesa de operação.
Todas as cirurgias são feitas ao microscópio. Mantemos condições cirúrgicas semi-estéreis durante todo o procedimento cirúrgico. Segure a cânula do tubo francês com pinças.
Penetrar na parede da cânula com uma agulha 30G a um centímetro de distância da extremidade da cânula. Empurre a agulha através da cânula até que a ponta da agulha fique visível. Aqui está uma imagem de comparação do cateter 26G e da cânula autofabricada; ambos são adequados para canulação portal de camundongos.
Prepare 25 mililitros de solução salina heparinizada com uma concentração final de 2.500 unidades internacionais por mililitro e coloque a seringa em incubadora regulada a 40 graus centígrados. Aqui estão os principais componentes do sistema de perfusão de máquina normotérmica ex-vivo. Os componentes incluem principalmente a câmara de órgãos, máquina termostática, bomba de roletes, oxigenador e reservatório.
Aqui, você pode ver uma configuração detalhada da nossa câmara de órgãos. Basicamente, ele é composto por um corpo de câmara de órgãos, um sensor de pressão, um trocador de calor e uma armadilha de bolhas. Montamos uma entrada de perfusato, uma saída de perfusato e uma porta de drenagem biliar.
Este é o sistema de monitorização da DDA que usamos para monitorar a pressão da veia porta. O sistema ADI consiste em um sensor de pressão, um controlador central e monitores. Ative o programa LabChart para monitoramento de pressão.
Calibração e zeragem são necessárias antes de cada uso do sensor de pressão. Use mercúrio de zero milímetro e mercúrio de 20 milímetros como marcas para calibrar o sensor de pressão para a calibração em duas etapas. Com base na monitorização constante da pressão portal, podemos ajustar o flurano portal de acordo com as mudanças de pressão.
Em volumes iguais de perfusato para o reservatório e a câmara de órgãos para preparar o sistema, atenção especial deve ser dada para manter a esterilidade durante o processo de enchimento. Conecte a câmara de indução com um soquete de parede. Vire o oxigênio para 0,5 litro por minuto.
Vire o isoflurano para 3% Coloque o animal na câmara até que a anestesia profunda seja atingida. Use microseringa para aplicar dose de analgesia adaptada ao peso corporal. Aqui, sete microlitros de buprenorfina.
Agora, iniciamos a operação cirúrgica. Faça uma incisão transversal na área abdominal do rato. A incisão cutânea estende-se para a linha axilar bilateral da carne em ambos os lados.
Faça cuidadosamente uma incisão longitudinal ao longo da linha alba. Corte a camada muscular abdominal com eletrocoagulação e tesoura. Coloque cuidadosamente um pedaço de gaze úmida para proteger o fígado da eletrocoagulação.
Expor totalmente a cavidade abdominal do rato. Mova cuidadosamente o intestino delgado para fora da cavidade abdominal com um cotonete molhado para expor totalmente o hilo. Mostramos aqui um diagrama esquemático de canulação da veia porta e canulação do ducto biliar.
Basicamente, escolhemos a cânula apropriada de acordo com o tamanho do camundongo e usamos fio de seda 6-0 para a fixação da cânula. Liberte cuidadosamente o ducto biliar comum usando pinças curvas finas sem dentes. O ducto biliar comum é muito facilmente danificado e quebrar.
Uma vez que quebra, não pode ser canulado. Devido à direção da posição anatômica, pinças curvas são mais fáceis de operar. Coloque duas alças de sutura de seda 6-0 sobre o ducto biliar comum em preparação para a próxima etapa.
Puncione cuidadosamente o ducto biliar com uma agulha 30G. Use pinças curvas pontiagudas para ampliar os pequenos orifícios, para que possa alimentar a canulação do ducto biliar. Use pinças de canulação do vaso através da cânula do ducto biliar e empurre-a para dentro do ducto biliar. Nota.
No momento da canulação, você sentirá a resistência trazida pela bile. Se a força não for bem controlada, a cânula será empurrada para fora do trato biliar pela pressão de saída da bile. Ajuste cuidadosamente a profundidade da cânula.
Se for muito profundo, pode danificar o ducto biliar e, se não for profundo o suficiente, pode escapar. O fluxo biliar pode ser observado na cânula após a canulação bem-sucedida. Aperte a veia porta com pinça plana e libere cuidadosamente o tecido conjuntivo com pinça curva.
Não puxe com força aqui, para não causar ruptura da veia porta. Uma vez que a veia porta é danificada, é difícil canular a veia porta. Coloque duas suturas de seda 6-0 Loop sobre a veia porta livre.
Use um clipe arterial para fechar a veia porta distal. Puncione cuidadosamente a veia porta com uma das cânulas da veia porta acima. O fluxo sanguíneo pode ser claramente observado dentro da cânula após uma punção bem-sucedida.
Tome solução salina de heparina pré-aquecida da incubadora. Remova todas as bolhas de ar. Fixe a seringa com soro fisiológico heparinizado pré-aquecido na bomba da seringa.
Conecte o tubo de extensão da bomba de seringa à cânula da veia porta. Ajuste a velocidade para dois mililitros por minuto e inicie a lavagem hepática. Aumentar o isoflurano para 5% e eutanasiar o rato com uma sobredosagem inalação de isoflurano.
Observe a cor do fígado no final do procedimento de lavagem. Excise o fígado uma vez que a cor se transformou em um amarelo homogêneo. Transfira cuidadosamente o fígado para a câmara do órgão usando uma placa de Petri.
Mantenha uma pequena quantidade de soro fisiológico na placa de Petri para evitar que o fígado seja esmagado. Nota. A veia porta e o ducto biliar podem ser facilmente torcidos durante esse procedimento, o que pode afetar a perfusão hepática e a coleção biliar. Infundir lentamente soro fisiológico normal na cânula da veia porta com uma seringa para evacuar as bolhas de ar na cânula.
Conecte a cânula da veia porta ao tubo de saída do perfusato na câmara do órgão. A cânula do ducto biliar do camundongo é guiada através de uma válvula da câmara do órgão, que é fechada com uma tampa de borracha. Em seguida, o tubo biliar é inserido em um microtubo pré-preparado de 0,5 mililitro com um pequeno orifício no chumbo.
Depois que tudo estiver conectado, ligue a bomba peristáltica. Verifique a leitura da pressão da veia porta para ajustar a vazão. Mantenha a pressão da veia porta entre sete a 10 milímetros de mercúrio ajustando a taxa de fluxo. Nota.
O fluxo nominal pode variar ligeiramente dependendo da idade e do posicionamento dos tubos. Esta é a seleção do meio de perfusato, volume de perfusato e pressão de perfusão com base em uma investigação da literatura de estudos normotérmicos de perfusão de máquina de fígado oxigenado em ratos. Este é um estudo passo a passo para estabelecer o modelo de perfusão em camundongos.
Foram necessários cerca de 14 experimentos para selecionar os cateteres mais adequados. Em nossas mãos, o uso de dois cateteres de borracha French para a veia porta, juntamente com um cateter de borracha French para o ducto biliar, é a melhor combinação para obter perfusão homogênea com todos os cateteres no local. O pH e o nível de potássio mantiveram-se estáveis durante 12 horas de perfusão.
O pH variou de 7,26 a 7,71 e o de potássio de 5,9 a 6,8 milimoles por litro. A coloração HE mostra que, após 12 horas de perfusão, a integridade histológica do fígado de camundongos estava relativamente bem preservada. Em conjunto, demonstramos aqui o estabelecimento bem-sucedido de um sistema normotérmico de perfusão em máquina oxigenada para o fígado de camundongos.
A perfusão de fígado de camundongo por 12 horas resultou em boa preservação da morfologia hepática, embora não em todo o órgão. Esforços adicionais são necessários para alcançar uma perfusão homogênea completa por um período maior de tempo. Uma vez que isso seja alcançado, o uso de animais geneticamente modificados pode ser considerado, como o uso de camundongos knockout de IL-2 para investigar o papel da inflamação.
