O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, e NIH R56 AI063274

<ol>
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Os autores deste artigo não têm concorrentes interesses financeiros para divulgar.

Aplicações de genotipagem em larga escala têm sido usados ​​para compreender melhor o mecanismo genético subjacente muitas doenças humanas. A descoberta de qualquer variante significativa através de uma análise de associação do genoma pode sinalizar uma região candidata para um estudo mais aprofundado. Além disso, os dados do genótipo é uma boa ferramenta para o controle de qualidade em projetos de seqüenciamento. Para maximizar o rendimento da amostra, várias placas de amostra podem ser amplificados e armazenados em seus fragmentados, estados suspensão. Oito placas pode ser amplificado em um único dia, combinando a primeira 24 horas do protocolo para vários lotes e fornecer material suficiente para ~ 2-8 dias de processamento de chip. Se as placas são armazenadas previamente amplificados, e se novas amostras são cruzados para fichas imediatamente após a digitalização começa na corrida anterior, o processamento pode ser executado de forma contínua, sem a necessidade de fazer uma pausa para a preparação da amostra adicional. Portanto, apesar de amostras terá três dias para submeter-se ao completoensaio, os dados podem ser gerados por dia. Fichas Assuming24 são processados ​​a cada dia, uma semana de trabalho de cinco dias permite a mais de um mil amostras de DNA para serem executados em um chip de talão de 12 amostras. Se um dos passos ou reagente falhou, no entanto, vários lotes pode estar em risco para o mau desempenho antes de qualquer correção pode ser aplicada. Os erros podem passar despercebidos até que as matrizes são digitalizados ou analisado, portanto, se o rendimento é maximizado, centenas de amostras em vários estágios do protocolo já poderia ter recebido o mesmo tratamento com defeito após o descobrimento. Como os reagentes e os dados perdidos não podem ser recuperados, o usuário deve pesar os riscos contra a necessidade de um fluxo de trabalho acelerado. O software de análise de GenomeStudio é a primeira oportunidade de medir realmente o sucesso do processo de genotipagem. Se a Norma-R vs parcelas intensidade Norm-Teta estão devidamente agrupados, a taxa média de chamada (por cento do total de SNPs digitado com sucesso) das amostras deve se aproximar de 99%, embora este valor varia slightly dependendo do tipo de matriz. Os dados a partir de qualquer amostra com uma taxa de chamada menor que 85-90% não é confiável e deve ser descartada. Para fins de controle de qualidade, os resultados devem ser comparados a qualquer genótipos previamente conhecidos sempre que possível. Se esses dados não existe, intencional duplicação da amostra é uma ferramenta útil na verificação da placa ou matriz colocações. Estes pares duplicados devem ser colocados em chips separados, placas, lotes ou projectos; seus genótipos verificado após geração. Enquanto constrangimentos específicos QC variar de acordo com a preferência do investigador, as restrições comuns SNP são baseados em sucesso chamada de exemplo, o equilíbrio de Hardy-Weinberg, ou falta completa entre casos e controles, enquanto que as restrições de amostras comuns são baseados em taxas de chamada, inconsistências mendelianas, ou referências cruzadas do cromossomo X heterozygosity aos dados clínicos de gênero [13]. Se algum problema surge, o Dashboard Controles, encontrado na suíte de análise, podem ser submetidos àcompanhia, a fim de determinar a causa. Esses controles muitas vezes pode limitar o problema ao passo provável ou falha de reagentes. Se algum SNPs de interesse são encontrados através de um experimento genotipagem Infinium, suas parcelas de intensidade deve ser verificada em GenomeStudio por erros de agrupamento antes de mais pesquisas sejam efetuadas. Um experimento de genotipagem Infinium não é provavelmente devido a um erro de processamento humano ou DNA entrada de má qualidade. Amostra quantificação deve ser exato e preciso. Para melhores resultados, os reagentes adicionados a qualquer amostra ou chip tem de ser vertido para o volume definido pelo protocolo. As pipetas devem ser devidamente calibrado. Os reagentes não devem ser executados após o vencimento e não devem ser novamente congelados, uma vez descongelado, para salvar o reagente RA1. A fim de minimizar possíveis erros de coloração e de extensão, a mistura de formamida / EDTA deve ser preparado todos os meses. Todos os -20 ° C reagentes devem ser armazenados em freezers apenas o manual-degelo. Todo material de laboratório usado na ruaaining, de extensão e de lavagem de partes do protocolo deve ser lavada cuidadosamente com água e detergente neutro imediatamente após desuso. Os reservatórios de umidificação na câmara hyb deve ser limpo com uma escova de tubo de ensaio e detergente neutro. As lâminas de vidro devem ser lavados com água sanitária a 10%, conforme as instruções dos seus manuais do usuário, uma vez por semana.

Digitando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) é um método fundamental de identificar variantes de risco associados à doença. Historicamente, o âmbito de experiências de genotipagem tiver sido limitados pela tecnologia disponível. Métodos de genotipagem baseadas em electroforese em gel estão limitadas na amostra e SNP throughput [1]. O desenvolvimento destes ensaios muitas vezes pode ser trabalhoso, contando com a composição e estrutura da região em torno da variante de otimização [1]. Ensaios TaqMan genotipagem, desenvolvido pela Life Technologies, pode executar um grande número de amostras de forma rápida e com o mínimo envolvimento técnico [2], mas as restrições SNP-multiplexação continuam a limitar o número total de genótipos para bem menos de um milhão por dia [3,4 ]. Plataforma Iplex da Sequenom também pode executar muitas amostras de uma só vez, mas, como menos de cem SNPs podem ser multiplexados em conjunto, o throughput é comparativamente baixa global [5]. Tecnologia fluxo SNP da Beckman Coulterpoderia, teoricamente, produzir mais de três milhões de genótipos por dia, mas esta faixa de limites de tecnologia de projeto para um máximo de apenas quarenta e oito SNPs por reação [4,6]. Enquanto o ensaio GoldenGate pode processar quase duas centenas de amostras de DNA de cada dia em centenas ou milhares de SNPs por amostra, o preço por genótipo não é competitivo com, técnicas avançadas de ultra-alto rendimento ao digitar mais de três mil SNPs de uma só vez [4,7 ]. A fim de processar vários milhões de genótipos por dia, a escala necessária para grandes estudos de associação do genoma, os ensaios matriz de hibridização tornaram-se a opção mais rentável no mercado. Linha de Affymetrix de matrizes de hibridização e linha de matrizes à base de Infinium da Illumina permitir potencialmente centenas de amostras a ser digitado em centenas de milhares ou milhões de SNPs em paralelo [4,8]. Estes SNPs podem ser espalhados por todo o genoma, localizada em regiões de interesse, como a exomes, ou personalizado com a preferência do usuário. Estas matrizes têm a vantagem de não apenas ser capaz de genótipo com precisão um milhão de SNPs por amostra de uma vez, mas também para medir a variação do número de cópias, anormalidades cromossômicas potencialmente revelando. Infinium alinhados matrizes OMNI BeadChip atualmente tem a capacidade de genótipo até quase cinco milhões de marcadores por amostra, incluindo meio milhão de loci costume, em até cerca de cem amostras de cada dia. Como a maioria das doenças têm um componente genético, essas experiências em larga escala pode ser crucial na busca de genes associados com a doença. De alta capacidade para a geração de genotipagem permite genótipo eficiente no exemplo define grande o suficiente para detectar de forma convincente de associação genética em freqüências alélicas menores inferiores. Projectos de genotipagem todo o genoma pode ser usado para localizar regiões com freqüência do alelo de caso-controle estatisticamente significativa ou diferenças no número de cópias [9,10,11]. De acordo com o National Human GeInstituto de Pesquisa de nome, estudos de associação ampla de genoma levou a 1.490 publicações separadas entre 25 de novembro de 2008 e 25 de janeiro de 2013, decorrente da descoberta de SNPs 8283 com um valor de p menor que 1 x 10 -5 (ver http:// www.genome.gov/gwastudies/). Esses estudos, que pesquisou as condições que vão desde a altura ao câncer testicular, beneficiou da abordagem ampla proporcionada por uma análise de todo o genoma. Em casos como estes, regiões inteiras de interesse poderia ter escapado à atenção tinha o escopo de digitação sido demasiado restritiva. Assim, para análises de associação em grande escala, uma técnica de genotipagem de todo o genoma é a técnica de escolha. Existem diferentes versões do ensaio Infinium, cada um projetado para uso com tipos específicos de arrays. O ensaio InfiniumUltra, discutidos em profundidade a seguir, é adequado para muitos 12 - ou lascas de matriz 24 de amostra. Estes, muitas vezes o genótipo mais de cem mil SNPs por amostra de DNA e se concentrar em targeted regiões, como em exome ou personalizados painéis. Outras versões do ensaio podem ser necessárias para outros tipos de chips, como as matrizes de genotipagem de todo o genoma. No entanto, como todos os ensaios Infinium compartilham uma base comum e diferem principalmente apenas pelos nomes de reagentes, os volumes de reagentes, ou o procedimento exato reagente coloração, técnicas aperfeiçoadas em uma versão ensaio muitas vezes pode ser universalmente aplicado. Outras matrizes, como matrizes de metilação, pode usar um protocolo quase idênticas, como bem. Cuidados devem ser tomados ao utilizar apenas a versão de ensaio necessários para o tipo de chip em uso. Alguns tipos, como as que medem nível de expressão de genes, pode exigir o uso de um protocolo de nonInfinium. As amostras devem ser processadas em lotes. Por exemplo, com o ensaio de InfiniumUltra, tubos de ensaio de pré-hibridação conter um volume suficiente para executar 96 amostras, e os tubos não podem voltar a ser congelados. Portanto, as amostras devem ser executados em lotes de 96 amostras de cada vez. As amostras serão amplificados sobre os abetosdia t. Após aproximadamente 1 hora de benchwork, as amostras devem ser aquecidos num forno de convecção durante 20-24 hr. No dia seguinte, cerca de 4 horas, será gasto fragmentação, precipitação, e ressuspensão das amostras, no ponto em que as amostras podem ser congeladas para uso futuro ou hibridadas com o chip. Carregando fichas leva quase 2 horas, após o qual as amostras serão hibridizados durante a noite por 16-24 horas. No terceiro dia, o passo de coloração e extensão leva ~ 4 horas. Uma hora mais será gasto lavagem, revestimento, secagem e os chips. Finalmente, as matrizes são verificados, o que pode levar 15-60 min / chip, dependendo do tipo usado. As precauções padrão de segurança de laboratório e limpeza aplicar. Embora a amplificação não é à base de RCP, as estações de trabalho separados para pré-e postamplification procedimentos são necessários a fim de minimizar a probabilidade de contaminação. O número de cada reagente fornecido pelo kit em uso de identificação deverá ser registrado em uma folha de rastreamento. Reagents devem ser descongeladas imediatamente antes da utilização e invertido várias vezes antes de dispensar. O DNA a ser digitado deve ser ADN genómico de alta qualidade (260/280 razão de absorvâncias de 1,6-2,0, 260/230 razão de absorvâncias de abaixo de 3,0), isolado através de métodos padrão e quantificados com um fluorómetro. Degradação de DNA é muitas vezes um fator que contribui para os resultados do ensaio de baixa qualidade. Normalmente, é necessária a 200 ng de ADN, embora esta quantidade pode variar de alguns tipos de chip. A-manipulação líquido Tecan robô pode automatizar muitas etapas do protocolo e minimizar o erro humano como um fator.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="477">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:145px;">Consumable or Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Manufacturer&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Part Number&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Minimum Required for 96 Samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.8 ml Deep Well Plate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0765</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Plate Mats</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0674</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Reagent Basin</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-681-502</td>
			<td style="width:113px;">9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat-seal Sheets</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0559</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow-through Spacer</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">NC9563984</td>
			<td style="width:113px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 200 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L200F</td>
			<td style="width:113px;">192</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 10 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L10F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 1,000 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L1000F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">DNA Suspension Buffer</td>
			<td style="width:121px;">Teknova</td>
			<td style="width:99px;">T0220</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.1 N NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AC12419-0010</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Isopropanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">A451</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">459836</td>
			<td style="width:113px;">330 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Formamide (100%)</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:99px;">C001K38</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:99px;">E177</td>
			<td style="width:113px;">0.2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">10 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-10XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">200 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-200XLS</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">1,000 &#956;l Single-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L-1000XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">13500-890</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Refrigerated Microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">BK369434</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">SE-901-1001</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex Microsample Incubator</td>
			<td style="width:121px;">SciGene</td>
			<td style="width:99px;">1057-30-0</td>
			<td align="right" style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex MIDI Heat Block Insert</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-601</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat Sealer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0384</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hyb Chamber w/ Insert and Mat</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-402</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-804-20</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow Through Assembly Parts</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-202</td>
			<td style="width:113px;">8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Wash Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-450</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Genepaint Chamber Rack</td>
			<td style="width:121px;">Tecan</td>
			<td style="width:99px;">760-800</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Temperature Probe</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">A1-99-109</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Staining Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-207</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Self-Closing Tweezers</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc</td>
			<td style="width:99px;">5374-NM</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Vacuum Manifold</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc&#160;</td>
			<td style="width:99px;">2240</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">iScan or HiScan</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">-</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infinium assay for large-scale snp genotyping applications

Genotipagem variantes no genoma humano provou ser um método eficiente para identificar associações genéticas com fenótipos. A distribuição de variantes dentro das famílias ou populações pode facilitar a identificação dos fatores genéticos da doença. Painel de BeadChips genotipagem da Illumina permite aos investigadores ao genótipo milhares ou milhões de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou analisar outras variantes genômicas, tais como número de cópias, através de um grande número de amostras de DNA. Estes SNPs podem ser espalhados por todo o genoma ou alvo em regiões específicas, a fim de maximizar o potencial de descoberta. O ensaio Infinium foi otimizado para produzir de alta qualidade, resultados precisos rapidamente. Com uma configuração adequada, um único técnico pode processar a partir de algumas centenas a mais de um milhar de amostras de ADN por semana, dependendo do tipo de matriz. Este ensaio orienta os usuários através de cada passo, começando com DNA genômico e terminando com a varredura da matriz. Usando decoro REAGEnts, ​​as amostras são amplificados, fragmentado, precipitado, ressuspenso, hibridizado com o chip, prorrogado por uma única base, manchado, e digitalizadas em cada um de alta resolução sistema de imageamento óptico iScan ou Hi Scan. Um passo durante a noite é necessário para amplificar o ADN. O DNA é desnaturado e isotermicamente amplificado por amplificação de todo o genoma e, portanto, não é necessária a PCR. As amostras são hibridizadas para as matrizes durante um segundo passo durante a noite. No terceiro dia, as amostras estão prontas para serem digitalizados e analisados. O ADN amplificado pode ser armazenados em grandes quantidades, o que permite matrizes grânulo para ser processado a cada dia da semana, maximizando assim o rendimento.

Um chip talão devidamente processado deve mostrar intensidades vermelhas e verdes brilhantes e distintas de luz a laser durante a digitalização. Na Figura 6, o software de digitalização iScan exibe uma amostra de ADN genómico padrão hibridizaram para um painel de costume matriz genotipagem. Os nucleotídeos marcados que foram anexados durante as etapas de extensão e de coloração fluorescente sob as luzes dos dois lasers. Como estes nucleótidos estender selectivamente cadeia de oligonucleótido do talão hibridado com a cadeia de DNA fragmentado, e como as cadeias de oligonucleótidos foram concebidos para terminar no local da variante, a cor e a intensidade do sinal resultante pode ser utilizado para determinar os alelos presentes no local SNP. Uma folha gerado por usuários da amostra, que corresponde IDs de amostra e informações clínicas para chipID e posição, e um manifesto específico SNP-array, obtido diretamente da empresa, são necessárias a fim de importar o scaarquivos de saída nner para o software de análise de GenomeStudio. Folhas de amostra Exemplo pode ser encontrada no site da empresa. Uma vez que o projeto GenomeStudio é construído, os genótipos podem ser obtidos a partir dos grupos de intensidade resultantes gerados automaticamente pelo software. Apesar de existirem várias opções de exibição, o modo de exibição padrão, Norm-R (um valor de intensidade normalizada) vs Norm-Theta (um rácio de intensidade alélicas), é muitas vezes o enredo mais fácil de diferenciar três grupos distintos. A maioria dos SNPs deve mostrar uma, duas, ou três grupos, dependendo da freqüência do alelo menor. Os três grupos representam amostras demonstrando AA, AB, ou alelos BB (ver Figura 7). Estes grupos podem ser atribuídos genótipos ou através da importação de um modelo de posição agrupamento padrão diretamente da empresa, selecionando &quot;Cluster Todos os SNPs&quot; na barra de ferramentas de análise do software, ou clicando e arrastando os círculos coloridos nas parcelas de intensidade para EDI manualmente<html> t chama. A cor da amostra no gráfico de intensidade (vermelho, roxo ou azul) indica que a chamada (AA, AB ou BB, respectivamente); preto indica nenhuma chamada. Ao percorrer os SNPs listados no painel de dados completa do software, o agrupamento para cada SNP podem ser vistos ou recolhidos. Uma vez que os clusters são atribuídos chamadas satisfatórios, o painel de dados completa do software lista os genótipos para cada amostra individual em cada SNP particular. A opção Seletor de coluna acima da tabela pode alternar formatos de dados. Os dados podem ser exportados através de barra de ferramentas de análise ou diretamente da tabela de dados completa para análise em profundidade. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Visão geral - Infinium Ensaio protocolo.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Completa Hyb Câmara de base e esteira, além de tampa. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3 Carregando um BeadChip -.. Dispensar a amostra sobre as portas de entrada [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior</a><html> imagem. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4 Retirar o BeadChip Coverseal -.. Segure o selo no canto e delicadamente descascar diagonal [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Completa Assembléia BeadChip Flow-through - O BeadChip é separado de uma lâmina de vidro com um espaçador e preso com grampos.&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Successful BeadChip Scan - A) O BeadChip é digitalizada com ambos um laser vermelho e verde; o software de digitalização exibe ambos simultaneamente. Seções passam intensidade QC irá destacar verde no visor BeadChip para a esquerda. Seções falhando intensidade QC irá destacar vermelho no visor BeadChip. B) Quando a digitalização estiver concluída, o software irá sobrepor os displays vermelhos e verdes. Uma imagem zoom-in é mostrado. A cor ea intensidade de cada talão indivíduo indica o alelo presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.wipáginas fina = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. SNP NORM-R vs NORM-teta Perfis de Cluster - A) A SNP válido com três grupos distintos que representam AA, AB, e os genótipos BB, de cor vermelho, roxo e azul B) A edição exigindo SNP.. O cluster de meio, que deve ser homozigotos AB, é deixado sem chama. O cluster BB é erroneamente chamado de AB. C) A SNP pobre desempenho. Não genótipos podem ser obtidas a partir deste enredo intensidade, como não existem grupos distintos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> .

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Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Um protocolo é descrito que utiliza ensaios Infinium Illumina para realizar genotipagem em larga escala. Estes ensaios podem genótipo de forma confiável milhões de SNPs em centenas de amostras de DNA individuais em três dias. Uma vez gerados, os genótipos pode ser usado para verificar as associações com uma variedade de diferentes doenças ou fenótipos.

Infinium Ensaio para a grande escala Applications genotipagem

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

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38.6K visualizações.  Oklahoma Medical Research Foundation.  Um protocolo é descrito que utiliza ensaios Infinium Illumina para realizar genotipagem em larga escala. Estes ensaios podem genótipo de forma confiável milhões de SNPs em centenas de amostras de DNA individuais em três dias. Uma vez gerados, os genótipos pode ser usado para verificar as associações com uma variedade de diferentes doenças ou fenótipos. 

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biologia

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Um método simples para genotipagem Accurate

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identificação de novos reguladores de transpiração vegetal por triagem de imagens térmicas em larga escala em Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Um procedimento de ChIP-Seq semiautônomo para estudos epigenéticos em larga escala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...