Este trabalho foi financiado pela Aliança do Prêmio Pré-centro NanoHealth (W81XWH-11-2-0168) e Centro de Texas para Nanomedicina Câncer (1U54CA151668-01).

1. Fabricação de chips <ol><li> Criar a solução de revestimento para o chip, começando com a solução precursora hidrolisado de silicato. Misturar 14 mL de tetraetilortossilicato (TEOS) com 17 mL de etanol, 6,5 mL de água desionizada e 0,5 mL de HCl 6M sob agitação forte (1200 rpm), utilizando uma agitação da placa quente. Aquecer esta solução a 80 ° C durante 2 horas, mantendo a agitação constante. </li><li> Prepare soluções poliméricas, adicionando o desejado tri-bloco coploymer (Pluronic F127, L121 e P123) e 10 mL de etanol à temperatura ambiente com agitação forte. Completa-se a mistura por adição de 7,5 ml da solução de silicato (do passo 1.1) para a solução de copolímero tri-bloco seguido por 2 horas de agitação forte à temperatura ambiente. Isto representa a solução de revestimento final. </li><li> Aplicar 1 mL de solução de revestimento para uma bolacha de silício de 4 polegadas por centrifugação de revestimento a uma taxa de 1500 rpm durante 20 segundos. Em seguida, o calor a 80 ° C durante 12 horas. </li><li> Aqueça os filmes para remover su orgânicarfactant através do aumento de temperatura de 1 ° C por minuto a 425 ° C e, em seguida cozer durante 5 horas. </li><li> Pré-tratamento da sílica mesoporosa superfície do chip (MPS) com o oxigênio plasma incineração (Plasma Asher - Março de Plasma System). (O Fluxo 2: 80 sccm, potência: 300 W, tempo: 10 minutos). </li><li> Modificação química da superfície opcional: chips silanate em organossilano 3% em uma mistura de metanol: água Dl (19:1) solução durante 72 horas à temperatura ambiente em uma caixa de luva N 2. Lavar sequencialmente com metanol e água desionizada. Curar fichas a 110 ° C durante 15 minutos num forno ventilador de accionamento manual. </li></ol> 2. Amostra pré-tratamento <ol><li> Adicionar TFA e ACN para cada amostra de soro de tal forma que as concentrações finais estão TFA 0,01% e 5% ACN. Vórtice para misturar. </li><li> Agitar estas amostras sobre uma mesa de vórtice agitador à temperatura ambiente durante 30 minutos. </li></ol> 3. Fracionamento de soro <ol><li> Pré-cozer fichas durante a noite num forno a 160 ° C. Alternativamente, store as fichas em um exsicador até estar pronto para usar para evitar a hidratação da superfície por água do ambiente ao ar. </li><li> Use ar comprimido a poeira de quaisquer partículas que podem estar sobre a superfície do chip. </li><li> Cortar pré-fabricado, comprado CultureWell câmaras lamela para incluir o número desejado de poços. Lamínula limpa com etanol 100% e depois coloque em MPS superfície do chip. Pressione lamela para baixo com uma pinça para assegurar uma vedação completa com chip. </li><li> Pipetar 10 de amostra de soro em cada 3 mm bem. Incubar durante 30 minutos numa câmara humidificada a temperatura ambiente. </li><li> Pipetar até soro de poços e descarte. Pipetar 10 de água desionizada a cada poço para lavar as proteínas maiores. Repita 4 vezes. </li><li> Pipetar 5 uL de tampão de eluição (0,1% TFA + 50% ACN) para cada poço de amostra. Pipetar cima e para baixo 30 vezes enquanto se move em torno da ponta da pipeta na bem para misturar o tampão de eluição. (Apenas aplicar tampão de eluição de 1-2 amostras de cada vez para evitar tampão de eluiçãoevapore tão rapidamente). </li><li> Após a mistura, pipetar todos tampão de eluição e colocar num tubo de microcentrífuga de até estar pronto para executar a análise MALDI-TOF. </li><li> A fim de imitar a complexidade de uma amostra biológica e para avaliar o efeito de enriquecimento na colheita espécies de baixo peso molecular, com o nosso sistema de fraccionamento no chip, foram selecionados e montados de uma mistura padrão de proteínas e péptidos de contagem 20 e seis espécies diferentes, com um amplo gama de pesos moleculares (900-66 500 Da) e PIS (4,0-10,2) e as concentrações de 0,5-8 pmol / uL) (ver a lista de proteína na Tabela 1). </li></ol> 4. MALDI-TOF Análise de Peptídeos <ol><li> UL mancha 0,5 da amostra a MALDI placa de destino e deixa-se secar. </li><li> Matriz mancha 0,5 uL (α-ciano-4-hidroxicinâmico ácido (CHCA), 5 g / L) ou solução saturada de ácido trans-3 ,5-dimetoxi-4-hidroxicinâmico (SA), em acetonitrilo a 50% contendo TFA a 0,1% e permitir que a co-cristalização. &lt;/ Li&gt; <li> UL mancha 0,5 de solução de calibração para cada ponto de calibração e deixa-se secar. </li><li> Insira placa-alvo em MALDI-TOF espectrômetro de massa. A máquina deve ser definida para o modo refletor positivo com uma intensidade do laser de 4200 e 3000 tiros por amostra. O intervalo de massas seleccionado deve ser de 800-5000 Da, com uma massa alvo de 2000 Da. </li><li> Realizar análise de MALDI-TOF mesmo no modo linear, mas alterar o intervalo de massa de 900 a 10.000 Da ou 3000 para 70.000 Da e uma massa de 5000 Da alvo. </li></ol> 5. Análise de Dados <ol><li> Os espectros-prima foram processadas com o software ConvertPeakList e os dados foram exportados para SpecAlign software para pré-processamento. Todos os espectros foram alinhadas utilizando o método de correlação PAFFT e intensidades foram normalizados para a corrente total de iões (TIC) em cada espectro correspondente. Todos os espectros foram suavizadas e de-propalado com o factor de 4 e 0,5, respectivamente. Picos foram detectados com uma linha de base de 0,5 janela de massa, de 21 e alturarácio 1,5, valores negativos foram removidos antes da análise. </li><li> Agrupamento hierárquico foi realizada utilizando Cluster 3,0 e visualizados com o software Mapletree. MALDI MS Dados (intensidades m / z de pico) foi log-transformada, normalizada e centrada mediana. A correlação de Pearson foi utilizada para calcular a distância entre as amostras, e agrupamento de ligação completa foi realizada. </li><li> Um estudante independente t-teste foi utilizado para a comparação entre os grupos (n = 2 grupos) para cada pico detectado MS antes da análise de agrupamentos sem supervisão hierárquica. A P-valor de 0,02 ou menor foi considerado significativo para selecionar peptídeos e proteínas diferencialmente colhidas entre os diferentes mesoporosos chips de proteômica (poros grandes contra pequenos poros). </li></ol> 6. Os resultados representativos Como mostrado na Figura 1, no presente estudo, fabricada de uma série de películas finas de sílica mesoporosa com uma variedade de nanotextures e exaustivamente explorado oIR utilização em selectiva captura e enriquecer péptidos e proteínas LMW a partir de soro humano. Figura 2a e b mostram os espectros de MS da amostra não processada soro para péptidos na gama de 900 a 10.000 Da e para as proteínas na gama de 3.000 ~ 70.000 Da, respectivamente . Estes espectros ilustrar a supressão do sinal na região LMW devido à presença de bem ionizado, muito abundantes, de elevado peso molecular (HMW) proteínas tais como albumina. Figura 2c, d descrevem os espectros de MS da amostra de soro após fraccionamento pelo L121 MPS (tamanho de poro, 6 nm). A maioria das moléculas grandes têm sido esgotado, resultando em um enriquecimento significativo dos componentes LMW. Como controlo, a mesma amostra de soro foi aplicado sobre uma superfície de sílica não porosa puro para avaliar a especificidade dos filmes finos MPS para a recuperação LMWP. Como pode ser visto na Figura 2e e F, não houve colheita significativa de pepmarés ou proteínas a partir da sílica não porosa. Assim, pode concluir-se que era a arquitectura mesoporoso e não a afinidade superfície da sílica que constitui o factor predominam no enriquecimento de LMWP. Variações controladas com precisão no tamanho dos poros pode ser alcançado através da utilização de copolímeros com diferentes comprimentos de bloco hidrofóbicas. Ao utilizar as proteínas destinadas e mistura péptidos, o efeito do tamanho de poro sobre o péptido LMW e eficácia de recuperação da proteína foi investigada usando MPS filmes finos preparados a partir de quatro surfactantes Pluronic (F127, P123, L121, L121 e mais agente de inchamento) com proporções diferentes de volume dos componentes hidrofílicos e hidrofóbicos para formar tamanhos de poros de 3,7 nm, 5,2 nm, 7,4 nm e 9,0 nm, respectivamente. Esta gama de tamanhos de poros levou à recuperação de um repertório diferente de peptídeos e proteínas partir da mesma amostra de soro através de tamanho e forma de exclusão (Figura 3). Os espectros de proteína em alto peso molecular demonstrate o molecular de corte de cada tipo de chip. Para além da depleção de tamanho-dependente de proteínas HMW, o fraccionamento em chip da solução padrões exibe um diferencial e um enriquecimento selectivo de espécies LMW associados com os tamanhos de poro. O agrupamento de duas vias hierárquico apresentado na Figura 3b mostra o padrão de LMW enriquecimento padrões obtidos com o MSC diferente. Mesmo que todos os péptidos são abaixo da molecular de corte das aparas, há uma correlação positiva entre os tamanhos de poro e do peso molecular das espécies capturados. O MSC com poros grandes, até 9 nm, preferencialmente colher péptidos maiores, enquanto os péptidos mais pequenos são recuperados mais eficientemente por as fichas com poros mais pequenos. A transformação estrutural do arranjo mesoporoso foi realizada por meio do ajuste da concentração do polímero de modelo. O aumento da concentração do polímero modelo resultou em uma curvatura reduzida interfacial entre as fasesda água, o copolímero, eo silicato, consequentemente iniciar a progressão interligados de uma forma esférica e com uma estrutura cilíndrica. Pluronic F127, com o seu elevado peso molecular, possui este elevado grau de periodicidade estrutural. Ao aumentar a concentração de F127 em iniciar solução, diferentes MPS nanoestruturas de película fina periódicas podem ser obtidos a partir nanoestrutura 3D para nanoestrutura 2D. Os 3D cúbicos e favo de mel nanoestruturas hexagonais, possuindo a interconexão nanopore mais desejável e morfologia nanopore mais acessíveis, que apresentam um desempenho superior em selectivamente enriquecendo péptidos LMW do que a estrutura hexagonal 2D, embora eles partilham semelhantes distribuições de tamanho de poro e da mesma moleculares de corte para soro fraccionamento (Figura 4). Nós também simplificado de conjugação a de organo-silano em chips de MPS através da introdução de plasma de oxigénio calcinação para pré-tratamento da superfície do chip. A fim de estudar o efeito qualitativamente electrostática sobre selective enriquecimento on-chip, usamos as proteínas e peptídeos mistura. A análise MS da solução padrões proteômica fraccionado em chips de MPS preparados com L121 e conjugado com os grupos químicos funcionais é apresentada na Figura 5. O carregada positivamente e carregado negativamente os péptidos e proteínas LMW são capturadas no aniónico e os chips catiónicos, respectivamente. A comparação quantitativa de múltiplos chips MPS na recuperação dos péptidos com carga positiva é apresentado na Figura 5a. As fichas com carga negativa e os chips, sem qualquer alteração (com uma carga menor negativo originalmente) exibem enriquecimento significativamente mais elevado para os péptidos do que as fichas modificados com APTES (-NH 2). Inversamente, as fichas carregados positivamente MPS possuir capacidade excepcional para recuperar os péptidos com carga negativa líquida, como demonstrado na Figura 5b. Enquanto α-endorfina não mostra uma mudança significativa due a sua PI em torno de 6. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig1.jpg" /> Figura 1. Princípio da MPS fracionamento fichas e enriquecimento LMW. Depois de amostra manchas na superfície, as proteínas LMW e peptídeos são presos nos poros enquanto as espécies maiores permaneceram fora dos poros e são removidos durante os passos de lavagem. As fracções enriquecidas são então eluído e analisados ​​por MALDI. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig2.jpg" /> Figura 2. Enriquecimento peptídica utilizando os mesoporosos sílica fichas de filme fino. Perfis de MALDI MS, tanto na gama de massa de baixa (900 a 10 000 Da) e da gama de massa de alta (3000 a 70 000 Da) antes (a, b) e depois (c, d) o tratamento de soro nos filmes de sílica mesoporosa finas ( L121, 6 nm). A recuperação molecular é significativamente reduzida quando se utiliza em branco superfícies não porosas de sílica (E, F). <img alt="A Figura 3" src=&quot;/ Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Enriquecimento de corte e dependente do tamanho molecular dos chips de MPS. (A) vista ampliada dos espectros de MALDI demonstrando a característica molecular de corte de cada fichas MPS correlacionando para o tamanho dos poros. (B) agrupamento de duas vias hierárquica das características da mistura de peptídeos entre os chips diferentes. A intensidade da cor vermelho ou amarelo indica a concentração de péptido relativa. Poros maiores melhorada a colheita de péptidos maiores (3600-8500 Da), enquanto que os pequenos péptidos (900-3500 Da) foram preferencialmente recuperado a partir das fichas com poros mais pequenos. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterizações físicas de filmes finos de MPS e recuperação seletiva com nanoestruturas diferentes. Padrões de XRD (a, b, c), TEM (inset a, b, c), Pluronic F127 em diferentes concentrações na solução precursora: 4,0 ×10 M -3 (a), 6,0 × 10 -3 M (b), e 8,0 × 10 -2 M (c). (D) Gráfico de barras da intensidade de detecção ilustrando a recuperação seletiva peptídeos em 3D cúbicos e hexagonais 3D F127 chips de proteômica (CUB e Hex, respectivamente). As diferentes modificações estruturais apresentar um enriquecimento selectivo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig5_lg.jpg"><img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig5.jpg" /></a> Figura 5. Carga específica de recuperação para as fichas com funções de superfície diferentes. Gráfico de barras da intensidade MS de detecção de péptidos capturados selectivamente sobre as fichas funcionalizados. De acordo com o seu ponto iso-eléctrico, os péptidos são positivamente ou negativamente carregado a pH 7,0. (A) péptidos positivos ((1) des-Arg1-A bradicinina, (2) A bradicinina, (3) substância P-amida, (4) neurotensina, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) são especificamente enriquecido no sur carregado negativamentefaces. (B) péptidos negativos ((7) Glu1-fibrinopeptídeo B, (8) α-endorfina, (9) de insulina ACTH (18-39), (10), (11) EGF (12), semelhante à insulina GFII) são especificamente enriquecida nas superfícies carregadas positivamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3876/3876fig6_lg.jpg"><img alt="A Figura 6" src="/files/ftp_upload/3876/3876fig6.jpg" /></a> Figura 6. On-chip de estabilização de soro fraccionado. (A) perfis representativos MALDI de péptidos e proteínas LMW eluída imediatamente após fraccionamento do soro (em cima) ou depois de 3 semanas de no chip de armazenamento à temperatura ambiente (inferior). (B) A partir de cima para baixo: análise de regressão linear das intensidades médios de picos detectados MS em cada repetição em comparação com replicar 1 para recém-fraccionado soro e fraccionado soro 3wk MPS após armazenamento fichas à temperatura ambiente. Equação, CV e coeficiente de determinação (R 2) são indicados.

<ol>
	<li>Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+applications+for+the+early+detection+of+cancer.">Proteomic applications for the early detection of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).</li><li>Etzioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+early+detection.">The case for early detection.</a> Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).</li><li>Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+proteome+for+cancer+biomarkers.">Mining the plasma proteome for cancer biomarkers.</a> Nature. 452, 571-579 (2008).</li><li>Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+proteomics:+written+in+blood.">Clinical proteomics: written in blood.</a> Nature. 425, 905-905 (2003).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+random+sampling+and+estimation+of+relative+protein+abundance+in+shotgun+proteomics.">A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics.</a> Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics:+old,+old+fashioned,+but+it+still+climbs+up+the+mountains.">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains.</a> Proteomics. 2, 3-10 (2002).</li><li>Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+of+the+nanotexture+of+mesoporous+silica+films+and+their+functionalized+derivatives+for+selectively+harvesting+low+molecular+weight+protein.">Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein.</a> ACS Nano. 4, 439-451 (2010).</li><li>Bouamrani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoporous+silica+chips+for+selective+enrichment+and+stabilization+of+low+molecular+weight+proteome.">Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome.</a> Proteomics. 10, 496-505 (2010).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Há evidências de que a região peso molecular baixo do proteoma circulatório é uma fonte rica de biomarcadores de diagnóstico para a detecção precoce da doença. Nesta tecnologia, apresentamos uma série de chips de sílica mesoporosa com diferentes tamanhos de poros, estruturas de poros e modificações para, seletivamente, enriquecem peptídeos e proteínas de baixo peso molecular. Para avaliar a estabilidade da proteína, as fichas de CPM foram incubadas com soro humano, secou-se, após lavagem, e armazenado para 3wk à temperatura ambiente. Os padrões de proteína / péptido obtidos foram comparáveis ​​com as de soro fresco fraccionado (Figura 6a), tal como confirmado pelos resultados da análise estatística mostrou na Figura 6b. A variabilidade dos sinais de pico medido pelo CV médio foi estimado em 12,7% para o soro bruto e em 14,2% para as amostras fraccionados. As variações marginais pode ser devido à variabilidade interna do instrumento MALDI e sugeriu que a Sn-chip pré-tratamento e armazenamento não induziu qualquer alteração significativa dos perfis de proteínas de esclerose múltipla. A mesma experiência foi realizada em silício poroso não. O soro secas recuperado após o armazenamento na superfície de silício foi fraccionado sobre os chips MPS antes da análise MALDI. O pobre perfil MS obtidos demonstraram a vantagem de estabilização da superfície mesoporoso. Em analogia com mecanismos anteriormente postuladas, se a hipótese que as espécies LMW presos no interior das nanoporos foram conservadas da degradação através da exclusão de tamanho de proteases, ou por inibição estérico da sua actividade proteolítica no espaço confinado dos nanoporos. O método baseado em chip de MPS pode ser uma poderosa ferramenta para o peptídeo e proteína LMW perfil do complexo estudo fluidos biológicos. Os chips MPS são barato de fabricar e permitir a produção ampliados para atingir o processamento simultâneo de um grande número de amostras, proporcionando características vantajosas para exploratório de rastreio e biomarcador descoberta.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tetraetoxisilano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 131903 </td><td> 98% </td></tr><tr><td> Giro coater </td><td> Brewer Ciência </td><td> Cee 200X </td><td></td></tr><tr><td> Plasma Asher </td><td> Nordson março </td><td> AP-600 </td><td></td></tr><tr><td> Elipsometria espectroscópica </td><td> JA Woollam Co. </td><td> M-2000DI </td><td></td></tr><tr><td> MALDI-TOF </td><td> Applied Biosystems </td><td> Voyager-DE-STR </td><td></td></tr><tr><td> α-ciano-4-hidroxicinâmico ácido </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> C8982 </td><td> Matriz de MALDI-TOF </td></tr><tr><td> trans-3 ,5-dimetoxi-4-hidroxiácido cinâmico </td><td> Sigma-Aldrich Co. </td><td> 85429 </td><td> Matriz de MALDI-TOF </td></tr><tr><td> Mexa chapa quente </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11-475-30Q </td><td></td></tr><tr><td> CultureWell câmaras lamela </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> GBL103350 </td><td> 3 mm de diam. × profundidade de 1 mm, 3-10 uL, estéril </td></tr><tr><td> Pluronic F 127 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 106-PPO 70-PEO 106 </td></tr><tr><td> Pluronic L121 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 5-PPO 70-PEO 5 </td></tr><tr><td> Pluronic P123 </td><td> BASF </td><td></td><td> PEO 20-PPO 70-PEO 20 </td></tr></tbody></table> A Tabela 1. Propriedades físico-químicas e concentrações concebidos (peso molecular e Iso-Eléctrico ponto) do péptido seleccionado e padrões proteicos.

low molecular weight protein enrichment on mesoporous silica thin films for biomarker discovery

A identificação de biomarcadores em circulação tem um grande potencial para abordagens não invasivos no diagnóstico precoce e prognóstico, bem como para o monitoramento da eficácia terapêutica 1-3. A circulação do proteoma de baixo peso molecular (LMWP), composto de pequenas proteínas lançam a partir de tecidos e células ou fragmentos peptídicos derivados da degradação proteolítica das proteínas maiores, tem sido associado com a condição patológica em pacientes e provavelmente reflecte o estado da doença de 4,5. Apesar destas aplicações clínicas potenciais, o uso de espectrometria de massa (MS) para determinar o perfil da LMWP partir fluidos biológicos tem provado ser muito difícil devido à grande gama dinâmica de proteínas e de péptidos concentrações no soro. 6 Sem amostra pré-tratamento, algumas das proteínas mais abundantes altamente obscurecer a detecção de baixa abundância de espécies no soro / plasma. Actuais proteômica abordagens baseadas, tais como bidimensional em gel de poliacrilamida-elmétodos ectrophoresis (2D-PAGE) e proteómica espingarda são trabalho intensivo de transferência, de baixo e adequação oferta limitada para aplicações clínicas. 7-9 Portanto, uma estratégia mais eficaz é necessário para isolar LMWP a partir de sangue e permitir que o rastreio de elevado de amostras clínicas . Aqui, apresentamos uma maneira rápida, eficiente e confiável sistema de fracionamento multi-baseada em chips de sílica mesoporosa especificamente para enriquecer e LMWP. 10,11 mesoporosos de sílica (MPS) filmes finos com características ajustáveis ​​em nanoescala foram fabricados usando o modelo de copolímero tribloco caminho . Usando modelos de polímero e concentrações diferentes de polímero na solução precursora, as distribuições de poros diferentes de tamanho de poro, estruturas, conectividade e propriedades de superfície foram determinados e aplicados para a recuperação selectiva de proteínas de baixa massa. A análise selectiva dos péptidos enriquecidas em subclasses diferentes de acordo com as suas propriedades físico-químicas vontade enHance a eficiência de recuperação e de detecção de espécies baixa abundância. Em combinação com espectrometria de massa e análise estatística, foi demonstrada a correlação entre as características Nanophase dos filmes de sílica mesoporosa finas ea especificidade e eficácia de colheita de baixa massa proteoma. Os resultados aqui apresentados revelam o potencial da tecnologia baseada em nanotecnologia para fornecer uma poderosa alternativa aos métodos convencionais para a colheita LMWP a partir de fluidos biológicos complexos. Devido à capacidade de ajustar as propriedades do material, a capacidade de produção de baixo custo, a simplicidade e rapidez da coleta de amostra, e os requisitos de amostra muito reduzida para a análise, este romance nanotecnologia irá impactar substancialmente o campo de pesquisa com biomarcadores de proteômica e proteômica clínica avaliação.

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

Nós desenvolvemos uma tecnologia baseada na película fina de sílica mesoporosa para a recuperação selectiva de proteínas de baixo peso molecular e peptídeos a partir de soro humano. As propriedades físico-químicas dos nossos chips mesoporosos foram afinado para proporcionar um controle substancial no enriquecimento de peptídeo e, conseqüentemente, o perfil do proteoma de soro para fins de diagnóstico.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K visualizações.  The Methodist Hospital Research Institute. Nós desenvolvemos uma tecnologia baseada na película fina de sílica mesoporosa para a recuperação selectiva de proteínas de baixo peso molecular e peptídeos a partir de soro humano. As propriedades físico-químicas dos nossos chips mesoporosos foram afinado para proporcionar um controle substancial no enriquecimento de peptídeo e, conseqüentemente, o perfil do proteoma de soro para fins de diagnóstico.

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Desenvolvimento personalizado Ovário de Hamster Chinês hospedar-Cell ensaios de proteína utilizando a Tecnologia micropartícula Acústico Membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Bioengenharia

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Light Fabricação Stage Microscopia de Luz Correlacionados / Microscopia Eletrônica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros para Discovery High Throughput de Biomateriais

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hidrogel nanopartículas colheita de plasma ou urina para detectar proteínas de baixa abundância

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para engenharia de tecidos da pele

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

Fabricação baseada em vara de customizáveis ​​macias robóticos pneumáticas Gripper Aparelhos para a manipulação de tecidos delicados

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...