This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com a lei de proteção animal Alemão (TierSchG). Os ratos foram alojados e tratados de acordo com as boas práticas animal, definidos no FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) eo corpo bem-estar animal nacional GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). O animal comitê de bem-estar, da Universidade de Freiburg, bem como as autoridades locais (Regierungspräsidium Freiburg) aprovou todas as experiências com animais. 1. Handling Animal, Preparação e indução da inflamação <ol><li> Use 4-6 semanas de idade ratos macho com uma faixa de peso de 16-20 g. Nota: Se eles os ratinhos mais velhos são mais pesados ​​ou apresentam excesso de gordura que envolve o recipiente, o que limita a observação microscópica. </li><li> Esterilizar todas as ferramentas e mesa microscópio antes da cirurgia. </li><li> Injectar 20 mg / kg de LPS (lipopolissacárido) intraperitonealmente quatro horas antes da microscopia no rato vivo para induzir uma Inflamm bacterianação. </li><li> Pré-aquecer uma solução salina a 0,9% num banho-maria a 37 ° C para humidificar a câmara de plástico e o tecido mesentério. </li><li> Anestesiar o rato com injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) imediatamente antes do procedimento de microscopia. Anestesia alternativos podem ser utilizados, por exemplo, 2% a inalação de isoflurano. Confirme anestesia adequada pela perda de resposta à estimulação reflexa (dedo do pé ou cauda pitada com pressão firme). </li><li> Depilar o abdome utilizando uma máquina de barbear e remover cabelo solto com gaze saturada com etanol 70%. </li><li> Aplicar veterinário pomada sobre os olhos do mouse para evitar a secura, sob anestesia. </li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Esterilizar os abdome utilizando etanol a 70%. Este método não é um método de estéril e pode ser letal no final da experiência. </li><li> Executar uma laparotomia mediana: Abra a pele abdominal usando uma pinça pequenos, curvos e uma tesoura pequena. Identificar o epivasos gastrical e abrir o peritoneu na região da linea alba, para proteger os vasos. </li><li> Aplicar algumas gotas de solução salina pré-aquecido para dentro da cavidade abdominal para manter o tecido húmido. </li><li> Etiqueta de leucócitos e plaquetas fluorescência por injecção de 50 ul de rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbitalmente, tal como descrito antes 9,10. </li><li> Exteriorizar um laço de lugar ileumand-lo em uma placa de Petri com um diâmetro de 10 cm e certifique-se de manter o tecido úmido, aplicando a 37 ° C pré-aquecido solução salina (0,9%) a cada dois minutos. </li></ol> 3. Microscopia intravital <ol><li> Colocar o rato sob o microscópio e trazer a veia mesentério com um diâmetro de 200-300 uM no centro de visão. Escolha uma embarcação sem arredores gordura visível. </li><li> Não toque nos vasos mesentério evitando assim a estimulação do endotélio. Pega o loop íleo cautela. </li><li> Visualize interações celulares do endotélio sanguecom um microscópio invertido ou vertical e uma câmera usando um software de microscópio. Grave sangue interações celulares do endotélio para 1 min em 4 veias diferentes por mouse. </li><li> Eutanásia o rato por luxação cervical após a conclusão de experiências de imagiologia. </li></ol> 4. Análise <ol><li> Realizar a análise off-line e cego para todos os parâmetros. Realizar análise usando qualquer programa de software adequado. </li><li> Confirme condições estáveis ​​e interindividually comparáveis ​​fluxo sanguíneo em alta resolução tempo cine-clips (taxa de quadros máxima) com foco no fluxo de glóbulos intraluminal. </li><li> Quantificar o número de leucócitos de rolamento. Therefor desenhar uma linha vertical através da veia e contar todos os leucócitos atravessam esta linha em 1 min. </li><li> Determinar a velocidade de rolamento através da medição do tempo de um único leucócitos tem de passar por uma distância de 50 mm, enquanto estavelmente rolando sobre o endotélio. Para fazer isso, desenhe duas linhas verticais em uma distância de 50 mm ttravés da veia. <ol><li> Medir o tempo de um representante de leucócitos deve começar a partir de uma linha para a other.Calculate a velocidade dos leucócitos dividindo-se 50 mm através do tempo necessário (mm / s). </li></ol></li><li> Medir a adesão de leucócitos em um campo de 0,04 mm2. Para fazer isso, desenhar um quadrado com o comprimento de 200 um lado para dentro da veia. <ol><li> Conte os leucócitos aderentes firmes, definidos como nenhum movimento visível durante 30 segundos, dentro deste quadrado. </li></ol></li><li> Contar o número de plaquetas ligadas a um dos leucócitos para quantificar interacções plaquetas-leucócitos. </li></ol>

<ol>
	<li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells.">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li><li>Atherton, A., Born, G. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions.">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aqui, descrevemos a preparação e realização de microscopia intravital das veias mesentério de ratos in vivo. Este método nos dá a oportunidade de observar as interações leucócito-endotélio e plaquetas-endotélio 11 diretamente no organismo vivo. Como uma resposta rápida a inflamação do endotélio é ativado e interage com leucócitos e plaquetas, resultando em rolamento, adesão e transmigração 12. Mas também os leucócitos interagem com plaque...

O objectivo deste protocolo é descrever uma técnica simplificada de microscopia intravital das veias mesentério em ratos vivos para observação direta da interação leucócito-endotélio e leucócitos-plaquetas em condições inflamatórias. Microscopia intravital foi desenvolvido para estudar as interacções leucócito-endotélio in vivo sob condições inflamatórias 1,2, o que não é trivial, mas importante para compreender o recrutamento de leucócitos inflamatórios e função. O método que nós descrevemos nesse protocolo foi desenvolvido com base em publicações anteriormente publicados. Semelhante a visualização de incorporação de plaquetas num trombo crescente 3 e em paralelo com o que foi anteriormente publicado 4, uma veia mesentério exteriorizada é examinada por microscopia de luz transmitida. Existem vários outros modelos de microscopia intra-vital, como o músculo cremaster de ratos 5 ou fígado de rato e ratos 6. Microscopia intravital da veia mesentério foi desenvolvido e aplicado em estudos anteriores por vários grupos. Temos usado essa técnica para observar diferenças no recrutamento de leucócitos entre camundongos selvagens e hydroxylase1 triptofano (TPH1) - / - ratos, que são deficientes de serotonina não-neuronal e compararam os resultados aos camundongos cujos serotonina de plaquetas foi farmacologicamente esgotados por longo prazo aplicação a um inibidor seletivo da recaptação da serotonina fluoxetina 7. Examinamos, também, interações leucócito-endotélio após o tratamento com fluoxetina aguda 8. Neste protocolo nos concentramos em microscopia intravital das veias mesentério, porque este modelo pode ser realizada rapidamente, e permite medições válidas de interação leucócito-endotélio e plaquetas-leucócitos. Isto é muito mais difícil e em microscopia intravital de outros órgãos, tais como o osso, fígado, pele, músculo cremaster ou demorada. O modo del descrito aqui é ideal para a avaliação reprodutível de interacção célula-célula inflamatória após challengeing-o com um estímulo inflamatório, tal como a injecção intraperitoneal de lipopolissacarídeos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;989-38-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2637&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy of leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions in mesenterial veins in mice

Microscopia intravital é um método que pode ser usado para investigar processos diferentes em regiões diferentes e vasos em animais vivos. Neste protocolo, descrevemos microscopia intravital das veias mesentério. Esta pode ser realizada num curto período de tempo com resultados reprodutíveis mostrando interacções leucócito-endotélio in vivo. Nós descrevemos um ambiente inflamatório após LPS desafio do endotélio. Mas neste modelo pode-se aplicar muitos tipos diferentes de condições inflamatórias, como bactérias, química ou biológica e investigar a administração de drogas e seus efeitos diretos sobre o animal vivo e seu impacto sobre o recrutamento de leucócitos. Este protocolo foi aplicado com sucesso a um número de diferentes tratamentos dos ratos e dos seus efeitos sobre a resposta inflamatória nos vasos. Descrevemos a visualização de leucócitos e plaquetas por fluorescência rotulando-os com rodamina 6G. Além disso, qualquer imagem específica pode ser PErformed usando moléculas fluorescente etiquetado alvejados.

Uma visão geral da configuração experimental descrito neste protocolo é demonstrado na Figura 1. Ela mostra um rato com um íleo-ciclo exteriorizado e seus navios, o que pode ser observado em microscopia intravital. A Figura 2 mostra certo grau de activação em animais não tratados devido a o procedimento em si. Mas não há quase nenhum rolamento lenta ou adesão firme dos leucócitos em comparação com os ratinhos tratados com LPS. A Figura 2 também mostra os ...

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Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Interações Intravital Microscopia de leucócito-endothelial e plaquetas-leucócitos em mesenterial Veias Ratos

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K visualizações.  Heart Center, University of Freiburg. This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.