This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

Todos os aspectos da pesquisa animal foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê Animal Care Institucional e uso apropriado. Todos os procedimentos experimentais em animais vertebrados descritos aqui foram aprovadas sob as diretrizes da Universidade Médica da Comissão (MUSC) Institutional Animal Care e Uso da Carolina do Sul (IACUC). Seleção 1. Modelo <ol><li> Manter o modelo animal em um viveiro de baixo ruído com guarda de rotina por protocolos institucionais até estar pronto para uso. Em pesquisas com animais instalações (ARFs), manter a estabilidade de vibração, amortecimento de ruído, iluminação diurna, espaço de preparação, acabamentos de superfície, vedação e calafetagem, e ventilação que cumprem as normas do NIH. Nota: Institutos Nacionais de Saúde (NIH) diretrizes para ARFs e manutenção de um baixo ruído viveiro pode ser revista em: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ </li><li> Para todos os experimentos, use a orelha direita como na orelha experimental. A orelha esquerda serve como um controlo intra-animais e não é alterada cirurgicamente. </li><li> Inspecione o modelo animal pré-operatório para detectar sinais de infecção do ouvido médio ou externo. Sinais potenciais podem incluir a drenagem de fluido ou pus do ouvido, tecido inflamado pavilhão auricular, e / ou letargia do animal. Isso é incomum, mas se observou, evitar mais cirurgias e tratar o animal de forma adequada. </li></ol> 2. Os procedimentos pré-operatórios <ol><li> Anestesiar o animal 30 minutos antes da cirurgia e quaisquer procedimentos perioperatórios via intraperitoneal (IP) de injecção de cetamina (100 mg / kg ip) e xilazina (20 mg / kg IP). Suplemento anestesia, conforme necessário, tal como avaliado por um reflexo positivo de igual pitada, com uma dosagem inferior de cetamina (25 mg / kg ip) e xilazina (5 mg / kg IP). Determinar a dosagem em conformidade com os protocolos institucionalmente permitidos para camundongos com idade de ajustamentos adequados dose. </li><li> Verifique se há plena sedation do modelo. Verifique se há um estágio 3 plano de anestesia para a totalidade do protocolo descrito marcada por uma taxa de respiração regular, a falta de reflexo de endireitamento (em ratos), e falta de pedal e palpebral (toe-pitada) reflexos. Manter o animal a este nível de anestesia. Isso é fundamental para a minimização da dor e do movimento intra-operatória, sangramento e vazamento de líquidos intersticiais durante a cirurgia. </li><li> Manter a temperatura do corpo do animal a 37,5 ° C com uma almofada de aquecimento de circuito fechado. </li><li> Administrar analgesia através de injecção subcutânea de buprenorfina. Deliver buprenorfina (0,1 mg / kg SQ uma vez 30 minutos antes da cirurgia) como analgesia para minimizar qualquer desconforto cirúrgico. Dosagem de base e as alternativas adequadas ao modelo selecionado em protocolos institucionalmente aprovados. Uso de antibióticos não é necessário se boa técnica asséptica tem sido praticada. Os animais recebem analgesia pós-operatória se há sinais de dor e sofrimento. </li><li> Execute physiologic testes pré-operatório. Execução de tronco encefálico (ABR) o teste auditivo e / ou produto de distorção testes de emissões optoacoustic (EOAPD), tanto no pré-operatório e apenas antes do sacrifício do animal serve como uma medida objetiva para o efeito do agente ototóxico escolhido em audição do mouse. </li></ol> 3. Preparação cirúrgica e Posicionamento <ol><li> Esterilizar todos os instrumentos de pré-operatório por normas institucionais. Prepare instrumentos cirúrgicos e campo de uma forma consistente, estéril, e organizada para evitar esforços desnecessários e movimento durante o procedimento. Instrumentos típicos exigida inclui tesouras de dissecação afiados, vários pares de pinças metálicas com dicas de joalheiro, um picador de otológica, uma cureta otológica, e uma unidade de eletrocautério bipolar (Figura 1). </li><li> Prepare e esterilizar mechas de papel feitas de labwipes com antecedência pelo corte de um pequeno pedaço triangular da limpeza (~ 0,7 em x 1,25 em x 1.75 in) e torcendo-a com força entre o polegar eo indicador de uma mão (~ 1,25 in). Criação de um pavio extremamente fina firmemente torcida é fundamental para o sucesso do procedimento. Preparar um total de 15-20 mechas antes da cirurgia (Figura 2). </li><li> Use uma broca de dentista para perfurar rapidamente o osso da bula timpânica de uma forma controlada. O uso de uma broca de mão dental acionado por correia com uma ponta de 1 ou 2 mm cônico é preferível. Um microscópio operatório é necessário para completar o protocolo. (veja o Passo 4.7) </li><li> Pré-desenhar 0,2 ml de uma solução aquosa contendo o agente ototóxico seleccionado dentro de uma seringa de tuberculina de 1 ml com um 28 g, 1/2 &#39;agulha. Tipicamente uma gota (~ 10 ul) do agente é suficiente para encher completamente o RWN rato. A metálico, agulha ponta da seringa sem corte facilita a administração do agente, evitando danos às estruturas subjacentes por uma ponta afiada de bisel. Expelir o ar no interior da seringa como bolhas pode inadvertidamente encher o RWN e / ou prevenir adequadaaplicação do agente à janela redonda si. </li><li> Retire a pele da pele pós-auricular usando cortadores de higiene elétricos. Retire a pele em uma zona que se estende desde o vinco aurículo-cefálica rostralmente ao caudal cintura escapular. Estender a remoção do cabelo do dorsal, na linha média sagital ao ângulo mandibular lateralmente. Remoção adequada da pele é fundamental para a manutenção de um campo cirúrgico limpo e claro. Escove suavemente recortes de sítio cirúrgico pretendido. </li><li> Esterilizar a pele da área preparada por protocolos institucionais. Aplicar betadine (povidona / iodo) alternadas com etanol topicamente de um modo circular durante 2 min. Outros agentes podem ser substituídos por diretrizes institucionais. </li><li> Colocar o animal sobre uma superfície plana para manter o posicionamento do corpo constante durante o processo. Utilize uma pequena almofada de aquecimento colocada por baixo do corpo para a plataforma para controlar a temperatura do corpo durante o processo para manter a temperatura corporal do animal em 36-38 ° C. Não overheat o animal, pois isso pode levar a leve a lesões cutâneas graves e / ou eutanásia cedo. <ol><li> Fixe a cabeça do animal através de um aparelho de suporte de bloco de mordida / cabeça. Utilizar um 0,5 cm por 2 cm bloco de mordida usinado de latão com buracos de 2-4 mm de diâmetro perfurados por ela em intervalos de 5 mm ao longo do eixo longo. Abra a boca do animal em todo este acessório e se encaixam os incisivos centrais superiores em um dos buracos, dependendo do tamanho do animal. Aperte levemente uma pequena braçadeira sobre o dorso do focinho do animal para segurá-la no lugar (Figura 3). </li><li> Confirmar que o suporte de bloco / cabeça da mordida está rigidamente ligado ao centro de um braço articulado em forma de U (Figura 3). Fixe uma haste de 1 centímetro de largura para o braço esquerdo do &quot;U&quot; e usar haste como um descanso principal do lado esquerdo (o lado direito é o lado operacional). </li><li> Uma vez firmemente fixado no suporte de cabeça, gire o mouse para uma posição de decúbito lateral esquerdo. Posicione o corpo carefully na superfície plana de funcionamento para garantir que será estável durante todo o procedimento e evitar a tensão de torção indevida sobre as vértebras cervicais. </li></ol></li><li> Posicione um microscópio cirúrgico capaz de 4x, 10x, 20x e sobre o campo cirúrgico. Confirmar que o microscópio pode manter a sua posição de um modo mãos-livres tal como este é ideal para o protocolo cirúrgico de duas mãos discutido abaixo. </li><li> Coloque uma unidade de cautério habilitado para bipolar com peça de mão do joalheiro de ponta fina em uma posição que está imediatamente disponível para a assistência na cauterização de pequenos vasos e dissecção do tecido. Isto pode também ser necessário um sangramento mais pesado deve ser encontrado. </li></ol> 4. Abordagem Cirúrgica <ol><li> Sob ampliação microscópica, use uma tesoura afiada ou uma lâmina de bisturi para criar uma incisão postauricular 1-1,5 cm, cerca de 6-8 mm caudal ao vinco auriculocephalic. No ratinho adulto, uma incisão de linha média dorsallateralmente a um ponto perto do ângulo de mandíbula é adequada. Evitar o corte cuidadosamente profundamente para preservar estruturas vasculares subjacentes. </li><li> Realizar cuidadosa dissecação romba através da camada de gordura subcutânea que pode ser de espessura variável. A gordura pode ser removida de forma segura, se necessário para uma melhor exposição. Tome cuidado ao dissecar em uma direção ventral-medial como a veia jugular externa atravessa esta área e danos a essa estrutura pode causar grandes quantidades de perda de sangue e inundações do campo cirúrgico. Controlar qualquer sangramento excessivo com esponjas de gelatina absorvíveis e / ou bolinhas de algodão. Use cautério bipolar para um sangramento mais pesado. </li><li> Uma vez que a camada de gordura é adequadamente dividido, expor a musculatura do colo do útero. Nota estruturas importantes, incluindo o corpo grande músculo dos cleidomastoideus centralmente no interior do campo cirúrgico exposto, a veia jugular externa ventralmente, e o tecido da parótida rostral sobrepondo o ângulo de mandíbula. Um marco importante é um pequeno nervo branch (XI do nervo craniano) que circunda o bordo posterior / dorsal do cleidomastoideus estender rostral para o pavilhão auricular (Figura 4). </li><li> Suavemente retrair o corpo muscular cleidomastoideus em uma direção posterior / dorsal (Figuras 4, 5). Gentilmente dividir a fáscia transparente que envolve o corpo muscular. De um modo semelhante, a retrair suavemente parótida e veia jugular externa na frente (anterior / ventral) o sentido (Figura 5). </li><li> Com boa retracção do corpo de músculo cleidomastoideus, a cúpula brilhante do periósteo bula timpânica entrará em vista (Figura 6). No aspecto caudal do bula, a inserção de um músculo do colo do útero mais profundo, o sternomastoideus, vai entrar em vista (Figura 6). Preservar o nervo facial, que se torna visível na parte dorsal e rostral aspecto da cúpula bula. Coloque um afastador de auto-retenção (titânio estéril shaft-- incorporado em silicone descartáveiscolar) antes da perfuração. </li><li> Com a técnica de duas mãos, gentilmente dividir o periósteo bula, com diatermia bipolar para expor o osso subjacente. Utilizando uma pinça ou uma cureta otológica, gentilmente elevar e empurre o periósteo numa direcção periférica para expor amplamente a cúpula bula. Nota: Etapa 4.6 é crítica para maximizar a visão cirúrgica do espaço do ouvido médio. Utilize manipulação dos tecidos moles meticuloso e delicado para evitar sangramento e / ou vazamento de fluido intersticial na cavidade bula após a perfuração. </li><li> Após uma cúpula de bolha com uma exposição adequada, faça um furo piloto 2 milímetros através do osso bula com uma broca cirúrgica dental entre a margem caudal da cúpula e da linha visivelmente opaca (representando a membrana timpânica) que se estende em todo o aspecto rostral da bolha (Figura 7). Tome cuidado para perfurar somente através do osso para preservar as estruturas subjacentes, como a artéria estapediano. Perfurar um segundo furo piloto nas proximidades para facilitar un-cobertura do osso bula (&lt;forte&gt; Figura 7). </li><li> Usando um par de fórceps ponta do joalheiro, uncap o osso bolha em um dorsal e direção caudal (Figura 8). Retirar o osso de forma fragmentada sob alta ampliação. Não perfurar a artéria estapediano, que fica logo abaixo da tampa bula, como sangramento desta artéria pode comprometer o procedimento. Minimizar a quantidade de osso removido para evitar a entrada excessiva de líquidos para o ouvido médio, enquanto ainda permitindo excelente visualização e acesso ao nicho da janela redonda (Figura 8). </li></ol> 5. Rodada Janela de Aplicativo de ototóxicos Agent <ol><li> Fazer ajustes rotacionais sutis para suporte da cabeça para trazer o RWN diretamente à vista. O RWN normalmente está localizado no aspecto dorsal e caudal do espaço da orelha média e aparece como um recuo do tipo copo do osso cápsula ótica. Na maioria dos casos, a artéria estapediana corre 1-2 mm ventral / rostral a esta. O RWN às vezes pode ser tucked perifericamente sob uma angulação aguda da cúpula bula. Em tais casos, o posicionamento cuidadoso da cabeça do animal é primordial. <ol><li> Usando os pavios de papel preparados no pré-operatório, remover todo o fluido visível na orelha média e RWN até osso seco é visualizado. Nota: Este é o passo mais importante de todo o protocolo, como a ~ 10 ul (1 gota) de agente ototóxico aplicada ao RWN pode facilmente ser diluído por este fluido. </li></ol></li><li> Sob ampliação máxima, use uma agulha de calibre fino em uma seringa de 1 ml de tuberculina para aplicar uma gota (~ 10 l) de agente ototóxico diretamente ao RWN, enchendo-o completamente. Tome cuidado para não perturbar a artéria estapediano e observar de perto para a substituição de uma pequena reflexão da luz na base de um nicho seque com um maçante e nebulosas menisco fluido como um indicador de que o nicho é preencher corretamente. <ol><li> Permitir que o agente para descansar dentro do RWN para o tempo de exposição de aproximadamente 10 min. Depois disto, completamente Wick o agente e substituí-la por uma nova aplicação do mesmo agente. Determinar repetições de aplicação de acordo com as especificações do agente. O tempo total de exposição a este processo varia, tipicamente, entre 30 a 60 min. </li><li> No final do procedimento, pavio completamente afastado do agente de uma última vez e aplicar o agente de fresco para RWN. Deixar a bula destapados e utilizar uma pinça para fechar o tecido mole sobre o local cirúrgico. </li></ol></li><li> Selar local da cirurgia ao nível da pele com uma 4-0, a sutura de monofilamento não absorvível. Colocar o animal em uma gaiola de recuperação / estação. Monitorar a condição clínica do animal na sequência de regularidade da operação. Manter o animal em condições ambientais adequadas, incluindo a habitação com roupa de cama macia e suplementação com alimento macio, para minimizar o estresse. Determinar os procedimentos futuros e condições pós-operatórias de acordo com os protocolos IACUC institucionais. </li><li> Use protocolos IACUC institucionais para esterilizar instrumentoss antes de usar no próximo animal. Permitir tempo resfriamento adequado entre o uso de instrumento. </li></ol> 6. Os procedimentos pós-operatórios e Coclear colheita Tissue <ol><li> Tal como descrito no passo 2.5, realizar o teste fisiológico da audição no pós-operatório em pontos desejados e antes do sacrifício. Realizar procedimentos pós-operatórios de acordo com objetivos experimentais. Sacrificar o animal em qualquer dia de pós-operatório desejado. </li><li> Após a anestesia completo através de injeção IP, conforme exigido por protocolos institucionais IACUC, sacrificar o animal. Usando uma tesoura afiada, decapitar animais apenas caudal ao occipital. Acentuadamente abrir a caixa craniana com uma tesoura ao longo da dorsal e ventral e se espalhou amplamente. Delicadamente retire o tecido cerebral para expor os ossos temporais. Nota: Uma série de procedimentos para investigação de alterações pós-exposição na cóclea pode ramificar a partir deste ponto e será mencionado na seção de discussão. Determine o método de investigação mais relevant para os fins experimentais. Se microscopia eletrônica está prevista após a cóclea são seccionadas, utilize o cateterismo cardíaco pré-fixar o tecido. Isso está além do escopo desta discussão e tem sido abordado de forma aprofundada em outros lugares. 13 </li><li> Corte os ossos temporais para fora da base do crânio com a tesoura e imediatamente colocado em solução fixadora. Imergir ossos directamente em paraformaldeído a 4% durante 1,5 h à TA. Monitorar tempo de fixação, como a longa duração pode limitar o resultado da análise histológica em etapas posteriores. Descalcificar dissecados ossos por um período de tempo variável via submersão em 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). </li></ol>

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Sem competindo interesses financeiros. Os autores não têm nada a revelar.

Os resultados de protocolo e representativos acima descritos foram obtidos em um modelo de rato CBA / CaJ incluindo ambos os sexos. Esta linhagem consanguínea está bem estabelecido como um padrão &quot;boa audição&quot; e modelo de &quot;envelhecimento normal&quot; na investigação auditiva. 16-23 Descrição do uso deste protocolo em outros modelos de mamíferos está além do escopo deste texto. O leitor deve observar, no entanto, que a técnica de aplicação RWN oferece várias vantagens para estudar o ouvido interno de mamífero. Destes, o mais notável é que evita a interrupção direta da estrutura anatômica delicado e gradientes bioquímicos que existem dentro das paredes da cápsula ótica. Procedimentos como cocleostomia e implantação de bombas de infusão têm a propensão para violar diretamente estruturas da orelha interna levando a mudanças nos limiares permanentes; um facto que deve ser tido em consideração quando se analisam os resultados. O rompimento das estruturas da parede lateral da cóclea por meto invasivads podem também limitar o uso de agentes ototóxicos, como a furosemida ou heptanol, cujo específica zona de efeito é restrito para esse local. 15,24 abordagens não-invasivas alternativas, como a injeção trans-timpânica e injeção parenteral têm sido atormentado por resultados não confiáveis ​​e / ou toxicidade sistémica para o modelo animal. Este método de aplicação tem provado para evitar ambos estes deficiências, alcançando um nível de consistência aproximando-se dos métodos mais invasivas discutidas acima. Outras vantagens desta técnica incluem é a sua ampla aplicabilidade para um número de modelos animais e viabilidade de incorporar em uma infra-estrutura existente de laboratório. Relativamente a este último, sem reagentes ou produtos químicos especializados são necessários para além dos agentes ototóxicos escolhidos, anestésicos e analgésicos. Agentes ototóxicos são tipicamente utilizados a uma concentração fixa e misturou-se num grande volume suficiente de solução (5 ml) para durar longos períodos de tempo consideraring cada aplicativo usa cerca de 10 ul (em ratos). Assim, após a aquisição inicial de fontes e instrumentos, os investigadores são relativamente livre de preparação morosa solução ou substituição frequente de materiais. Esta técnica também oferece reduções do tempo operatório, que pode ser significativo quando comparado com os processos que envolvem a implantação de bombas de infusão perilinfáticos ou cocleostomias. Ao atingir um nível de competência técnica, o tempo médio de conclusão da incisão inicial de fecho foi tipicamente de 20 minutos a 1,5 horas dependendo da duração de exposição desejada para o agente ototóxico. Três ou quatro cirurgias podem facilmente ser concluída em um único dia, permitindo uma maior eficiência e aumento do potencial para a obtenção de resultados bem sucedidos. Como descrito acima, esta técnica pode também ser facilmente aplicadas a uma variedade de modelos de roedores, incluindo ratinhos, ratos, cobaias e gerbos. As limitações deste método são centradas namoderadamente íngreme curva de aprendizado necessária para dominá-lo e diminuiu os resultados esperados até proficiência técnica é atingido. Como será discutido em maior detalhe abaixo, pequenos erros durante o acesso cirúrgico ou insuficiente visualização do campo operatório, quase invariavelmente, levam a um resultado fraco. Achados sutis que um novato pode não reconhecer, como uma espessa bolha de ar bloqueando o acesso sub-milímetro do agente para a membrana da janela redonda ou fluido intersticial diluir o agente, ter tempo para apreciar e desenvolver as habilidades psicomotoras necessárias para corrigi-los. No entanto, com desempenho repetido do procedimento esses obstáculos são facilmente superadas e constituem um desafio técnico para os investigadores menos assustador do que alguns dos métodos invasivos acima mencionados. Finalmente, esta técnica está associada com a limitação relativa que a lesão coclear só pode ser induzida em um único ponto no tempo durante a exposição cirúrgica. Isto pode ser superado para um certo grau, Através do enchimento do RWN com esponja de gelatina absorvível embebido no agente como foi descrito por Heydt et al 10. A esponja de gelatina absorvível vai reabsorver ao longo do tempo, mas pode permitir um período de exposição mais longo do que é alcançável por meio de aplicação de uma solução aquosa sozinho. Para que um investigador para perceber as vantagens desta técnica e evitar as armadilhas, é fundamental reconhecer os dois elementos críticos desta técnica: 1) a manter consistentemente visualização do espaço da orelha média e RWN; e 2) a capacidade de manter o campo cirúrgico livre de líquido e / ou sangue intersticial. Ao atingir o primeiro destes, a importância de um titular de cabeça adequada não pode ser mais enfatizado. Fixação segura da cabeça do animal garante uma visão estável sob o microscópio; a importância do que se torna facilmente evidente quando instrumentação subtil muda drasticamente o posicionamento das estruturas sob ampliação. Um bom htitular ead que pode girar em torno do eixo rostral-caudal do animal também facilita a mudanças dinâmicas importantes na linha do investigador do site. Muitas vezes, a alguns milímetros de rotação em torno deste eixo pode significar a diferença entre a visualização do RWN e visualização de somente o osso cápsula ótica. A capacidade de mudar constantemente vista também é fundamental para garantir fluido intersticial está devidamente removido das profundezas do nicho e também que o agente ototóxico é totalmente removido entre aplicações como discutido na Parte 5. Em nossa experiência, sangue, condensação, ou fluido intersticial que penetra no espaço do ouvido médio tem a capacidade de interferir com a experiência inteira. Isto não é surpreendente, já que a pequena quantidade de agente ototóxico aplicada à janela redonda (~ 10 l) pode facilmente ser diluído ao entrar em contato com o mesmo pequenos volumes de líquido estranho. Por esta razão, a dissecção cirúrgica meticulosa, destapar fragmentada da bula timpânica e preservat cuidadoion da artéria estapédico são equivalentes a uma resultados experimentais bem sucedidas. Se as etapas críticas acima são observados e os resultados esperados ainda não são alcançados, solução de problemas deve começar. Em nossa experiência, muitas vezes é útil para executar variações de teste de dois elementos processuais. O primeiro é o de modificar a frequência com que o agente ototóxico é reabastecido na janela redonda. Dependendo do agente a ser utilizado, o tempo total de exposição é entre 30 minutos e 1 hora, com o que a absorção completa e subsequente substituição do agente a cada 10 min. Se expondo por períodos mais curtos, o aumento da exposição total pode permitir que o agente de mais tempo para se difundir através da membrana da janela redonda. A exposição adicional e reabastecedor também pode ajudar a evitar a diluição indesejada do agente ototóxico por sangue, condensação, ou intersticial, como discutido acima. O cuidado deve ser mantido ao utilizar esta abordagem, no entanto, uma vez que tende a aumentar o risco de inadvertidaly lesando a artéria estapediano e / ou introdução de fluido intersticial para o RWN. Esta técnica é significativo em que ela oferece às investigações da fisiologia e fisiopatologia coclear. Esta técnica minimamente invasiva permite estudo detalhado dos processos bioquímicos delicado e tem sido equivalente em aprofundar nossa pesquisa teve como objetivo avaliar o potencial regenerativo coclear. 12,24 Essa abordagem cirúrgica e exposição também é reproduzido através de uma variedade de outras técnicas do ramo, e os resultados bem sucedidos utilizando este método têm sido relatados em estudos de implantação de células-tronco coclear. 14 Uma grande parte permanece desconhecido sobre a cóclea, no entanto, esta técnica, juntamente com o arsenal mais amplo disponível para pesquisadores, ajudará a estreitar essa lacuna de conhecimento.

Os investigadores têm utilizado uma grande variedade de modelos animais para estudar a função normal do sistema auditivo, bem como a fisiopatologia da perda de audição. Estes modelos também são muito úteis para a realização de estudos de intervenção contra vários processos patológicos e servir de base para aplicações de translação em seres humanos. Para a maioria das pesquisas envolvendo a cóclea e suas vias auditivas associadas, algum grau de danos ou perturbações devem ser introduzidos no sistema. Muitas vezes, o dano é intencionalmente destinado a criar uma lesão específica, permitindo que os investigadores a estudar o efeito de que a lesão na função normal, bem como a capacidade coclear para recuperar dele. Ao seleccionar um modelo animal em particular e / ou a técnica (s) para a introdução de dano, um número de factores deve ser considerado para conseguir os melhores resultados possíveis. Vários modelos animais podem responder de forma diferente a intervenções, enquanto os efeitos diretos e indiretos de uma técnica pode serinteiramente deletério para o resultado desejado. Na maioria dos casos, o protocolo ideal danos ouvido interno poderia evitar a toxicidade sistémica, rapidamente e com fiabilidade produzir danos, criar uma lesão precisa e consistente, e ser de sobrevivência para permitir um estudo mais aprofundado das alterações funcionais, celulares e moleculares. Idealmente, esses métodos também preservaria a microarquitetura e gradientes eletroquímicos delicadas da cóclea, na medida do possível. Até à data, os investigadores tiveram sucesso em estabelecer um número de técnicas para induzir lesões do ouvido interno. A maioria destes implica expor a cóclea a um agente ototóxico sistemicamente ou por via cirúrgica. As técnicas incluem a injecção parenteral, injecção intra-peritoneal, a injeção trans-timpânica, injeção endolinfático sac e cocleostomia com perfusão perilinfática. Estas técnicas têm sido utilizados para introduzir uma variedade de agentes ototóxicos, tais como a furosemida, a gentamicina, a ouabaína, e heptanol 1-5.Embora bem sucedido na criação de lesões cocleares específicos, as técnicas acima também reconheceram limitações. Injecções sistémicas podem ser altamente tóxico para o animal e pode ser associado com insultos cocleares não intencionais e resultados inconsistentes. Este último defeito também tem sido associada com injecções trans-timpânica. Técnicas como a cocleostomia e perfusão perilinfática, enquanto capazes de induzir lesões rápidas e altamente confiáveis, estão diretamente invasiva à estrutura do ouvido interno e função. Muitas das abordagens cirúrgicas são também associados a um alto grau de dificuldade técnica e pode requerer deixando objetos estranhos no animal, como um infusor micropump. 2-4,6-8 Nenhuma técnica única está livre de falhas, e os investigadores devem escolher métodos cuidadosamente para atender suas necessidades experimentais. Aqui, descrevemos, em detalhes, o nicho da janela redonda (RWN) técnica de aplicação para a entrega tópica de agentes ototóxicos em ratos adultos. Fiprimeiro descrito por Husmann et ai, em 1998, ao estudar o efeito da gentamicina em degeneração de células pilosas sensitivas em um modelo aviário, esta técnica mostrou ser capaz de produzir lesões significativamente mais fiáveis ​​do que a aplicação de gentamicina sistémico, evitando as toxicidades associadas. 9 Desde então, uma número de outros pesquisadores, incluindo nosso laboratório, têm utilizado esta técnica com grande sucesso. Em 2004, Heydt et al. adaptado para um modelo de ratinho e descrita uma maior capacidade para controlar o tamanho da lesão, preenchendo o RWN com esponja de gelatina absorvível embebido em concentrações variáveis ​​de gentamicina. 10 Palmgren et al., em 2010, estudaram os efeitos ototóxicos de beta-bungarotoxina, um potente elemento no veneno das faixas de Taiwan caixa, através da aplicação de uma forma aquosa do mesmo para o RWN de ratos adultos. 11 Além disso, um número de estudos anteriores de nosso laboratório utilizada a abordagem da janela redonda para estudar os efeitos ototóxicos de furosemidae, ouabaína, e heptanol. 5,6,12-15 Os resultados destes estudos têm demonstrado a importância de fluido coclear e homeostase de íons de audição normal, descobriram células capacidade proliferativa no gânglio espiral e parede lateral da cóclea, e aumentado o nosso entendimento da relacionada com a idade perda auditiva. A seguinte abordagem envolve o acesso cirurgicamente no ouvido médio através de uma incisão retroauricular e destelhamento parcial da bula timpânica óssea. Isto permite uma excelente exposição do RWN membrana e para o qual um agente ototóxico seleccionado pode ser aplicado directamente. O agente líquido, em seguida, piscinas no oco do tipo copo do RWN (ou lentamente drena a partir de um portador de gelatina esponja absorvível saturada lotaram o RWN) e difunde através da membrana da janela redonda no espaço perilinfático do vestíbulo coclear. Sem cocleostomia direta é feita nesta abordagem. As vantagens desta técnica incluem a preservação da orelha interna microarquitetura, evasãode toxicidade sistêmica, o subsídio de um intra-animal controlo orelha, o início rápido de efeito, degeneração seletiva em certos tipos de células da cóclea (por exemplo., Tipo I espiral neurônios do gânglio com exposição ouabaína e tipo coclear II fibrocytes induzidos pelo tratamento de heptanol), e resultados reprodutíveis / fiáveis. Esta técnica pode ser aplicada, com algumas alterações entre outras espécies de roedores, incluindo ratos, cobaias e gerbos. Inconvenientes incluem uma curva de aprendizagem técnica íngreme e a limitação relativa de insulto ototóxico que é limitada a um único ponto no tempo.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">1-Heptanol 98%</td>
			<td rowspan="2">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2805&#160;</td>
			<td rowspan="2"><a>PubChem Substance ID 24895536</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637&#160;</td>
			<td>Concentrate 100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Ketamine HCl)</td>
			<td>10ml</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased Injectable</td>
			<td rowspan="2">Lloyd Laboratories</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td rowspan="2">Concentrate 20mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280&#160;</td>
			<td>Concentrate 0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Buprenorphine HCl)</td>
			<td>5 ampules per box</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Skin Prep Solution</td>
			<td rowspan="2">Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__">MDS093941&#160;</a></td>
			<td rowspan="2">1 Quart screw top bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Povidone-Iodine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sterile Saline</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For mixing solutions and injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>32192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Acoustics Environment Sound Booth</td>
			<td>Industrial Acoustics Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Surgical Head Holder</td>
			<td>Custom Made &#8211;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Please see Figure 3</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical University of South Carolina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch</td>
			<td rowspan="3">World Precision Instruments</td>
			<td rowspan="3">555801L</td>
			<td>Maximum spread 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90N Dental Belt Driven Hand Drill&#160;</td>
			<td>Emesco</td>
			<td>N/A (Vintage Item)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle Size6</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>MEDC-011990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade&#160;</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td rowspan="2">SKU: 097-7215</td>
			<td rowspan="2">50 Blades/Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via ACE Surgical Supply Code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Jewelers Forceps&#160;</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>MIL17304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Curved</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__">DYND04026&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__">DYND04025&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stevens Tenotomy Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111">MDG3222111&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.00</td>
			<td>Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kimwipes Delicate Task Wipers&#160;</td>
			<td rowspan="2">Kimtech Science</td>
			<td rowspan="2">CODE 34155&#160;</td>
			<td rowspan="2">White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>House Ear Curette, 6&#8221; shaft, light angle</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486">MDG0396486&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201">IIS34201&#160;</a></td>
			<td>Substitutions may be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton pellets #3 4mm</td>
			<td>Richmond</td>
			<td>Manufacturer Code 100108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroSurgical Unit 100 E M/M</td>
			<td>Elmed</td>
			<td>List No. 52-5770</td>
			<td>Bipolar and Monopolar Capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5&#8221; length needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>Product Number: 329410</td>
			<td>Optional for delivery of Ototoxic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G, blunt tip, 1&#8221; length needle</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>Product Code 8881202397</td>
			<td>For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Mask</td>
			<td>U-line</td>
			<td>S-10478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exam Grade Nitrile Surgical Gloves</td>
			<td>U-line</td>
			<td><a href="http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free">S-12549</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Hair Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multiple models may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1&#160;13mm 3/8 circle needle</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>1855G</td>
			<td>Substitutions may be made.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td rowspan="2">Fisher</td>
			<td rowspan="2">01-812054</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Dry Sterilizer</td>
			<td rowspan="3">ROBOZ</td>
			<td rowspan="3">Germinator TM 500</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse round-window approach for ototoxic agent delivery: a rapid and reliable technique for inducing cochlear cell degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Em um estudo recente por Stevens et al utilizando o protocolo anterior, camundongos adultos CBA / CaJ de ambos os sexos foram expostas via rodada janela difusão de heptanol. 15 Heptanol é uma junção de lacuna un-acoplador conhecido por produzir alvo, lesão recuperável para as células do parede lateral coclear. O objectivo do estudo foi o de produzir um modelo fiável para danos coclear alvo, permitindo a investigação de regeneração pós-cirúrgica de quaisquer elementos danificados. Limiares auditivos pré-cirúrgica e pós-cirúrgica serviram como um ponto de extremidade funcional. Microscopia e técnicas de coloração imuno-histoquímica foram usadas para estudar alterações morfológicas. Aumentos significativos em limiares ABR foram observados nos ratinhos tratados com heptanol (Figura 9). Os animais de controlo que receberam a cirurgia sham, com entrega de solução salina em vez de heptanol, não demonstraram mudanças significativas limiar em qualquer freqüência testada. Immunostaining contra uma retificação para dentrocanal de potássio (Kir) 4,1 serviu como um método indireto para a visualização de danos / recuperação de estruturas cocleares. Isto demonstrou diferenças altamente reprodutíveis entre tratamento e controle ouvidos. Em geral intensidade de coloração foi marcadamente diminuída dentro da estria vascular (STv) e entre fibrócitos do ligamento espiral (SLF), 1-3 dias após a exposição heptanol, denotando uma grande quantidade de danos em função destas áreas. Houve uma diminuição em particular no Kir 4.1 intensidade de coloração nas áreas de Tipo II e Tipo IV SLFs (Figura 10) e STV (Figura 11). Evidência de integridade nuclear interrompido e cromossómico condensação / bolhas típicas da apoptose celular também foi observada em counterstains nucleares nestas áreas cocleares (Figura 10). Vacuolizados zonas de Kir 4.1 a coloração marcadamente resolvido em 7 dias e estavam ausentes inteiramente por 14 dias. Quando Kir 4.1 intensidade da coloração foi quantificada nas áreas de STV, orelhas tratadas demonstraram uma initicalha ai seguida por uma mudança significativa (p &lt;0,05) de volta para o controlo da intensidade de 7 dias após a exposição heptanol (Figura 12). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" /> Figura 1. Instrumento configurar. Representação de pré-cirúrgica set-up da instrumentação. Todos os equipamentos devem ser de fácil acesso dentro do campo cirúrgico estéril. Instrumentação típica inclui 2 tesoura afiada dissecção, 2-3 em linha reta e / ou pinça curva do joalheiro ponta com curetas de orelha, picaretas otológicos eixo curvado (substituído com Rosen pega mais tarde - não apresentado), e uma unidade eletro-cautério com uma pinça fina do joalheiro ponta curvada headpiece. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53131 / 53131fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fornecimentos cirúrgicos. Suprimentos adicionais para a manutenção do meio ambiente RWN. Recortes labwipe esterilizados para a formação de pavio de papel (à esquerda), papel firmemente formado Wicks feita a partir de toalhetes esterilizados de laboratório (centro), e 4 pelotas mm de algodão (direita) são usados ​​para limpar o excesso de líquido e inundações sangue no nicho da janela redonda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" /> Figura 3. titular cabeça Animal. Imagem que descreve o suporte de cabeça e bloco de mordida. Os buracos no bloco caber e proteger os incisivos centrais superiores. A braçadeira é apertada suavemente sobre o focinho dorsal para proteger o animal no lugar. O uso de um suporte de cabeça é crítica para OUTC cirúrgico com sucessoome. Idealmente, este deve ser capaz de rodar em torno do eixo rostral-caudal do animal para otimizar vistas cirúrgicas da bula durante o procedimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" /> Figura 4. Cleidomastoideus m.. Gráfico esquemático que representa a anatomia de base da musculatura cervical roedor e sua associação com a veia jugular externa. O músculo cleidomastoideus é o músculo mais prontamente identificados durante a abordagem cirúrgica. A liberação da fáscia envolvente seguido de retração posterior / dorsal do corpo do músculo irá direcionar a dissecção cirúrgica para a bula timpânica (círculo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver al</a>versão Arger desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" /> Figura 5. Área de Exposição cirúrgica. Descreve a exposição após a dissecção através das camadas de gordura cutâneos e subcutâneos. Marcos estruturais da nota incluem um ramo da XI nervo craniano que recobre o músculo cleidomastoideus (A), a veia jugular externa (B), e os tecidos expostos parótida (C). O ramo cranial XI nervo é muitas vezes associada a uma pequena embarcação e deve ser dividida antes de prosseguir. Direita para a esquerda na imagem corresponde ao eixo rostral-caudal do animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" /> Figura 6. A exposição do bulla. A exposição da bula timpânica após retração da cleidomastoideus e estruturas adjacentes. Marcos notáveis ​​incluem o corpo do músculo cleidomastoideus (A) reflecte posteriormente / dorsalmente, o nervo facial (B), e a cúpula brilhante do periósteo bula timpânica (C). Além disso, note a inserção do músculo sternomastoideus no aspecto caudal esquerdo da bula timpânica (asterisco). A presença do nervo facial no aspecto dorsal e rostral da bolha é um marco fundamental para a verdadeira identificação da bula. Direita para a esquerda na imagem corresponde ao eixo rostral-caudal do animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" /> Figura 7. Expor rodada janela nicho eu. Imagem que descreve o tympanic bula totalmente exposto após dissecção do periósteo sobrejacente. O orifício piloto é o melhor colocado no meio do caminho entre a borda caudal da cúpula bula e uma linha opaca sutil visualizado dentro do aspecto rostral da bula (representando a membrana timpânica). Um segundo buraco piloto adjacente pode facilitar mais fácil un-cobertura do osso bula. Evitar a perfuração profunda deve ser feita de modo a não ferir a artéria estapédico subjacente. A, objeto metálico escuro na parte inferior da imagem é o afastador de tecido mole de titânio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" /> Figura 8. Expor janela redonda nicho II. Bula timpânica não nivelada com a exposição do nicho da janela redonda (seta) e artéria estapediano (estrutura vermelho1-2 mm lateral ao nicho) como visto sob ampliação de 20x. O nicho muitas vezes coloca em posição dobrada sob o ângulo agudo formado pela cúpula bula com a cápsula ótica no aspecto caudal do cúpula. É imperativo que a visualização completa do nicho ser conseguido antes da aplicação do agente ototóxico ou wicking. Remoção óssea excessiva durante uncapping também deve ser evitado como líquido intersticial / sangue tende a inundar a cavidade quando grandes buracos foram criados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" /> Figura 9. Os resultados representativos -. Heptanol perda auditiva induzida e recuperação audiometria de tronco cerebral média (ABR) limiares (dB SPL) plotados em função do tom pipfreqüência. As medições são agrupados de acordo com pré-exposição (Black-Control) e pós-operatório (POD) 1, 7 e 14 (vermelho). As barras de erro representam SEM. Figura foi re-plotada de Stevens et al. 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" /> Figura 10. Os resultados representativos - Targeted lesão coclear após exposição heptanol parte I. Alterações do potássio Inner Retificador (Kir) Canal 4.1 coloração dentro da estria vascular (STV) de orelhas tratadas com heptanol e controlar ouvidos. (A) Normal Kir 4.1 coloração típica de orelhas controle com afinidade celular estrial forte para Kir 4.1 (verde). (B) orelha tratamento no 1º dia do PO. Vacuolizados grandes zonas de decrfacilitado afinidade Kir 4.1 são vistos dentro da STV (Setas), juntamente com uma diminuição global na STV Kir 4.1 intensidade da coloração. Os núcleos são contrastadas com iodo de propidio (vermelho) (B). Barra de escala = 15 mm. Figura foi re-plotada de Stevens et al, 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" /> Figura 11. Os resultados representativos - Targeted lesão coclear após exposição heptanol parte II Alterações no ligamento espiral (SL) de heptanol ouvido tratado em relação ao controle ouvido.. (A) Normal Kir 4.1 coloração (verde) dentro do SL típico de ouvido com controle de tipo aparentemente normais II fibrócitos do ligamento espiral (II). (B) t heptanolorelha reated com diminuição acentuada na intensidade Kir 4.1 coloração na área de tipo II fibrócitos ligamento espiral, perturbação nuclear e cromossómico de condensação / bolhas consistentes com apoptose (setas). Os núcleos são contrastadas com iodo de propidio (vermelho). Barra de escala = 15 mm. Figura foi re-plotada de Stevens et al, 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" /> Figura 12. Os resultados representativos -. Recuperação de intensidade de coloração coclear após exposição heptanol A média de luminescência relativa de Kir 4.1 coloração traçada em função do dia de pós-exposição. Luminescência relativa é calculado como Kir 4.1 intensidade reflexiva sob microscopia confocal em heptanol deleiteorelhas ed tomado como uma percentagem do mesmo em orelhas de controlo. Nota POD14-28 dados são reunidas como um único ponto na curva. Os círculos a cheio representam os valores médios, enquanto as barras de erro representam o erro padrão da média. Foi demonstrada uma recuperação significativa de luminescência relativa entre POD 7 e datas posteriores (teste t de Student p &lt;0,05), o Asterisk. Figura foi re-plotada de Stevens et al., 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K visualizações.  Medical University of South Carolina. Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible. 

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The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

O Trier Protocolo de teste de estresse social para induzir Estresse Psicológico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Medicina

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &amp;#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

O α-teste: Rapid livre de células CD4 enumeração Utilizando saliva total

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

This is a compact visual description of a combination of surgical technique and device for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. While the technique is demonstrated in the animal, the procedure is FDA-approved and currently being used for stem cell transplantation into the spinal cords of patients with ALS. While the FDA has recognized proof-of-principle data on therapeutic efficacy in highly characterized rodent models, the use of large animals is considered critical for validating the combination of a surgical procedure, a device, and the safety of a final therapy for human use. The size, anatomy, and general vulnerability of the spine and spinal cord of the swine are recognized to better model the human. Moreover, the surgical process of exposing and manipulating the spinal cord as well as closing the wound in the pig is virtually indistinguishable from the human. We believe that the healthy pig model represents a critical first step in the study of procedural safety.

Short visual description of the surgical technique and device used for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. The technique is demonstrated in the animal but is entirely translatable and currently being used for human application.

Técnica cirúrgica para entrega da Medula Espinhal de Terapias: Demonstração de Processo em Göttingen porquinhos

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Técnicas de processamento Olhos implantados com uma Retinal Prosthesis para localizada análise histopatológica: Parte 2 Epirretiniana implantes com tachas da retina

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Um procedimento cirúrgico para ressecção do mouse Rib: Um Modelo de Grande Escala Repair longo osso

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of brain stimulation presents several potential advantages compared to other techniques, as it is noninvasive, cost-effective, broadly deployable, and well-tolerated provided proper equipment and protocols are administered. Even though tDCS is apparently simple to perform, correct administration of the tDCS session, especially the electrode positioning and preparation, is vital for ensuring reproducibility and tolerability. The electrode positioning and preparation steps are traditionally also the most time consuming and error-prone. To address these challenges, modern tDCS techniques, using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes, reduce complexity and setup time while also ensuring that the electrodes are consistently placed as intended. These modern tDCS methods present advantages for research, clinic, and remote-supervised (at home) settings. This article provides a comprehensive step-by-step guide for administering a tDCS session using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes. This guide demonstrates tDCS using commonly applied montages intended for motor cortex and dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) stimulation. As described, selection of the head size and montage-specific headgear automates electrode positioning. Fully assembled pre-saturated snap-electrodes are simply affixed to the set position snap-connectors on the headgear. The modern tDCS method is shown to reduce setup time and reduce errors for both novice and expert operators. The methods outlined in this article can be adapted to different applications of tDCS as well as other forms of transcranial electrical stimulation (tES) such as transcranial alternating current stimulation (tACS) and transcranial random noise stimulation (tRNS). However, since tES is application specific, as appropriate, any methods recipe is customized to accommodate subject, indication, environment, and outcome specific features.

When administering transcranial direct current stimulation (tDCS), reproducible electrode preparation and placement are vital for a tolerated and effective session. The purpose of this article is to demonstrate updated modern setup procedures for the administration of tDCS and related transcranial electrical stimulation techniques, such as transcranial alternating current stimulation (tACS).

Técnica atualizada para estimulação elétrica transcraniana confiável, fácil e tolerada, incluindo estimulação transcraniana de corrente direta

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...

A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore potential treatment options. This mouse model allows researchers to induce significant lymphedema lasting at least 8 weeks. Lymphedema is induced using a combination of fractioned radiotherapy and surgical ablation of lymphatics. This model requires that the mice get a dose of 10 Gray (Gy) radiation before and after surgery. The surgical part of the model involves ligation of three lymph vessels and extraction of two lymph nodes from the mouse hindlimb. Having access to microsurgical tools and a microscope is essential, due to the small anatomical structures of mice. The advantage of this model is that it results in statistically significant lymphedema, which provides a good basis for evaluating different treatment options. It is also a great and easily available option for microsurgical training. The limitation of this model is that the procedure can be time consuming, especially if not practiced in advance. The model results in objectively quantifiable lymphedema in mice, without causing severe morbidity and has been tested in three separate projects.

This animal model enables researchers to induce statistically significant secondary lymphedema in the hindlimb of mice, lasting at least 8 weeks. The model can be used to study the pathophysiology of lymphedema and to investigate novel treatment options.

Um método revisado para induzir o linfedema secundário no hindlimb dos ratos

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...