Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

NOTA: Todos os procedimentos foram aprovados pelo The Royal Victorian Eye and Ear Research &amp; Comitê de Ética do Hospital de animal (RVEEH AEC; # 10-199AB). Os assuntos foram tratados de acordo com o National Health and &quot;Código australiana de Boas Práticas para o cuidado e uso de animais para fins científicos&quot; do Conselho de Pesquisa Médica (2013) e &quot;Prevenção da Crueldade contra os Animais Act&quot; (1986, e alterações). Todos os procedimentos de avaliação e eletrofisiológicas cirúrgicos, clínicos foram realizados sob anestesia e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. 1. A enucleação e Fixação NOTA: Siga o procedimento de enucleação e fixação descritos em detalhes no manuscrito companheiro 16, tomando cuidado extra em torno de cabos de dispositivos ou portas de vitrectomia, se presente. Resumidamente, este envolve: <ol><li> Transcardialmente perfuse o assunto com soro fisiológico morno seguido de buffe neutro frioformalina vermelho. </li><li> Amarre suturas para o globo ocular para servir como pontos de referência. </li><li> Enuclear o olho 16, mantendo os cabos do dispositivo e qualquer apego patches / guias. </li><li> Post-fixar o olho em solução de Davidson para 18 - 36 h. </li><li> Transferir para etanol a 50% para de 6 - 8 horas. </li><li> Transferir para etanol a 70% e refrigerar (4 ° C) até dissecção. </li></ol> 2. remoção do eléctrodo e Dissection. NOTA: Nem todos os implantes epirretiniana terá o mesmo fator de forma, mas, em geral, haverá um conjunto de eletrodos e alguma forma de material de suporte flexível e moldável. Os dispositivos que são pregados à retina apresentam um buraco onde o tack tack de metal penetra na matriz e parte de trás do olho, mantendo-los juntos. <ol><li> Visualize o implante e o ponto em que é fixada à retina. <ol><li> Usando uma lâmina de 15 graus fazer uma incisão trans-corneal circunferencial e retire a tampa da córnea para expose a íris subjacentes e lente. </li><li> Usando uma lâmina de 15 graus, as fibras zonulares disinsert da lente e remover a lente na sua globalidade, a exposição da câmara posterior com o implante epiretiniana e a aderência do metal in situ. </li></ol></li><li> Dependendo do implante e o estudo a ser realizado, remover os componentes estranhas antes de posterior dissecação. NOTA: No presente exemplo, a matriz epiretiniana sendo avaliada consistiu de um pacote hermético eléctrodo diamante e electrónica protótipo alojado dentro de um veículo conformada de silicone (produzida em casa; referem-se a 20). <ol><li> Aqui, extrair cuidadosamente o pacote de eletrodo de diamante por dissecção bem com um bisturi. Deixar o corpo do implante de silicone juntamente com a aderência da retina e os restos da fiação de platina (Figura 2). Se uma matriz / casas incorporado não é parte do projeto do dispositivo sob investigação, então omitir esta etapa (2.2). </li></ol></li><li> Cuidadosamentedissecar uma amostra que inclui a aderência tecido circundante e na orientação desejada. Use tesouras de dissecação fina para cortar tiras de espessura total a partir da parte posterior do olho, incluindo a esclerótica, coróide e retina. Tomar uma amostra, que dá uma secção transversal longitudinal da aderência, que mostra todas as camadas da retina adjacente à aderência (Figura 2) NOTA: A orientação desejada para a amostra pode ser diferente, dependendo do resultado específico desejado. Por exemplo, se se pretende analisar a proximidade dos danos aderência ao disco óptico, em seguida, o disco óptico devem ser incluídos dentro da amostra. </li></ol> 3. A desidratação, a incorporação, montagem, Grinding, coloração, e Imagem <ol><li> Desidratar a amostra ao longo de três dias em estágios progressivos de etanol: <ol><li> Desidratar a amostra em etanol a 70% duas vezes durante 2 horas. </li><li> Desidratar a amostra em etanol a 80% durante 2 horas e, em seguida, duas vezes por S / N. </li><li> Desidratar a amostra em etanol de 90% para 2 hr twice. </li><li> Desidratar a amostra em etanol a 100% durante 2 horas e, em seguida, duas vezes por S / N. </li></ol></li><li> Desidratar a amostra em 100% de acetona, durante 2 horas, duas vezes. <ol><li> Retirar a amostra a acetona e observá-lo sob um microscópio de luz que faça secar em temperatura ambiente. Transferir a amostra para epóxi (consulte o passo 3.4), pouco antes de começar a enrolar / colapso. NOTA: remover líquido dos tecidos moles resulta em células desmoronados e encolhimento. Uma apreciação de quando ocorre a ondulação tecido / colapso é desenvolvido com a experiência. </li></ol></li><li> Prepare resina epoxi de grau médico de acordo com as instruções do fabricante. Para curar a resina, utilizar ou 55 ° C durante 1 h ou 24 horas à temperatura ambiente. Colocar em uma câmara de vácuo durante ~ 5 min a ~ 50 mbar para remoção de bolhas de ar. Regular o vácuo manualmente como um vácuo excessivo fará com que a mistura de epóxi para ferver e desgaseificação não ocorrerá de forma eficaz NOTA: Execute o passo 3.3 concorrentemente com o passo 3.2. </li><li> Incorporar o sample em resina epóxi transparente. Mergulhe o tecido do olho em epóxi desgaseificado em um recipiente lacrado adequada e deixa O / N à temperatura ambiente para a cura. </li><li> Tome cuidado para incorporar a amostra na orientação desejada (Figura 2), redimensionando e re-incorporação ao bloco epoxi curada. Re-incorporar o bloco redimensionada contendo o tecido do olho de modo a que o eixo do comprimento da aderência é orientada paralelamente ao fundo do molde (copo amarelo - Figura 3A). </li><li> Monte a resina em um suporte de amostra de moagem e moagem da amostra (230-250 rpm com água em, moagem manual) usando papel de carboneto de silício (começando com 800 grade; Figuras 3C e 3E). </li><li> Para a coloração, molhe a superfície do solo em toluidine mancha azul por 3-5 min, ou até que a mancha se desenvolve (Figura 3F). </li><li> Enxágüe com água da torneira (Figura 3G). </li><li> Imagem da superfície do solo da amostra com um escopo dissecção de alta potência para visualizar as camadas celulares daretina (Figura 3H). Aplicar uma gota de água destilada sobre a superfície de topo do epóxi em cima da amostra para suavizar o difracção na interface ar-epoxi. Use uma fonte de luz de fibra óptica &quot;pescoço de ganso&quot; para iluminar a amostra. </li><li> Repita os passos 3,6-3,9, cada tempo de moagem de distância uma espessura pré-definido de amostra (incremento exacto e reprodutível mínima moagem de suporte da amostra é de 20 mm). </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. 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Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Técnicas histológicas padrão são incapazes de processar implantes de metal duro em situ devido às limitações na corte desses objetos com metal, vidro ou até mesmo lâminas de diamante. Em nosso companheiro papel 16, nós mostramos que o uso de uma técnica de fixação de olhos toda modificada poderia reduzir a delaminação da retina artificial. No manuscrito actual, os já estabelecidos afiação e polimento técnica de visualização implantes cocleares 21-23 in situ foi modificada para próteses de retina. A aderência de titânio, usado para proteger um conjunto de eletrodos na retina, epiretinally, foi incorporado em epóxi, juntamente com o tecido do olho ao redor. Este bloco de resina foi então orientada de forma adequada e terreno progressivamente / polido, a fim de revelar a morfologia do tecido adjacente ao tack metal. Imagens da superfície polida do bloco em diversas profundidades foram tomados com um microscópio de dissecção poderoso. Esta técnica é útil para: visualização e Avaliado coming a resposta do tecido adjacente ao implante epirretiniana; para avaliar o trauma cirúrgico associado com a implantação do implante; para determinar a reacção biológica para os componentes de metal duro; e para medir a distância entre o implante e a superfície da retina. Esta técnica será útil em estudos de segurança futuras para visualização em situ da região adjacente a um tack retinal ou outros (por exemplo, metálico) objetos duros no olho. Isto tem aplicação direta na avaliação da segurança pré-clínica de próteses pregado na retina epiretinally. Também pode ser útil para avaliar o dano no tecido da retina em regiões em contacto com os implantes localizados na localização sub-retiniana. Existem várias maneiras de verificar se a técnica foi realizado corretamente. Em cada fase, a retina deve permanecer ligado ao das camadas exteriores do olho. Se houver descolamento de retina artifactual bruto, isto pode índicoscomeram um problema com a fixação. Quando a amostra é incorporado e re-orientada na resina final bloquear a retina, deve ser quase ortogonal com a cara de moagem do bloco; isso vai minimizar o corte oblíquo. É útil para verificar que o número de etapas de moagem incrementais (de tamanho conhecido passo) necessário para percorrer um objecto (tal como uma aderência da retina) correlacionar em conformidade com as dimensões do objecto. A técnica pode ser optimizada de várias maneiras. Arranhões na superfície do bloco de epóxi associado com o processo de moagem pode ser reduzida progressivamente com polimento grau mais fino. Para o presente estudo, foram utilizados 800, 1000, 1200, 2400, 4000 e papel de carboneto de silício de grau. Pasta de diamante, também poderia ser usado para melhorar o acabamento da superfície. Um acabamento de superfície mais fino dá uma imagem de qualidade superior, mas ao custo de tempo de polimento adicional. Outra consideração importante para melhorar o resultado desta técnica é a escolha e qualidade do optics e iluminação utilizada para a captura de imagem. Outras manchas histológicas básicas - particularmente manchas de Nissl, pode ser usado no lugar do azul de toluidina, mas podem exigir uma maior optimização. Algumas manchas irá manchar a resina, bem como o tecido (por exemplo, eosina), por conseguinte, um polonês raso pode ser necessário após a coloração de fundo para remover a descoloração. Manchas especializadas, corantes fluorescentes e de coloração imuno-histoquímica não foi tentada, mas a menos que um resultado muito específico for desejado, o tempo necessário para realizar estas manchas em cada nível de moagem é susceptível de ser proibitivo. No entanto, pode ser possível marcar o tecido como um todo, antes da etapa de incorporação (passo 3.4) 24. A principal limitação desta técnica é que uma vez que a região de interesse foi moído distância, ele não pode ser reactivado, por conseguinte, é prudente capturar muitas imagens (possivelmente redundantes) com uma variedade de ampliações em cada fase de rectificação e polimento. Étambém importante o uso de pequenos incrementos para cada ajuste de profundidade de moagem. Outra limitação desta técnica é que o aumento de resolução óptica e comparado com o tecido montada sobre uma lâmina de vidro e visualizados com um padrão (transmissão) microscópio de luz. Para efeitos de criação de protótipos e avaliar a segurança de um dispositivo de implante novela, a avaliação patológica bruta é de interesse primário. Esta técnica proporciona um método eficiente para a observação de danos clinicamente relevantes associados com uma aderência da retina. Com a prática, o tempo total necessário para coletar moagem, polonês e fotografar uma dada amostra (uma vez incorporados) é comparável ao tempo que seria necessário para a seção de um bloco de parafina ou de congelação. Há também a possibilidade de as técnicas actuais para ser alargado a outras aplicações fora do âmbito dos implantes de retina. Esta técnica é adequado para avaliar o tecido adjacente a um implante de disco, onde a extracção do implante é não feasible ou prejudicaria a interface. Por exemplo, esta técnica poderia ser expandida para avaliar implantes feitos a partir de metal (por exemplo, a platina, o nitinol, etc.) que não podem ser cortados com as técnicas histológicas convencionais, tais como alguns cerebral profunda ou eléctrodos de nervos periféricos, cânulas para administração de fármaco, os stents vasculares ou próteses ortopédicas.

Retinite pigmentosa (RP) é uma doença hereditária que provoca a perda generalizada de fotorreceptores, que são as células na camada mais externa da retina responsável pela transdução de luz, sob a forma de fotões, em actividade neural. É importante ressaltar que pacientes com RP normalmente têm neurônios residuais das outras camadas de sua retina que ainda são funcionais. Próteses de retina são capazes de restaurar alguma visão limitada a esses pacientes, orientando esses neurônios sobreviventes com estimulação elétrica para ativar seu 1,2 via visual. Resultados da Percepção de ensaios clínicos têm mostrado resultados promissores início e, recentemente, alguns dispositivos foram aprovados para uso comercial. Atualmente, existem três principais localizações anatômicas em que as próteses de retina clínicos foram posicionados: epiretinally 3,4, 5,6 e subretinally suprachoroidally 7,8. Diferentes dispositivos utilizam diferentes materiais e sua forma é personalizadopara o local em que estão implantados. No entanto, todos eles criar percepções visuais ativando os neurônios remanescentes da retina com pulsos elétricos. Existe o potencial para qualquer próteses médicas para danificar o tecido circundante devido a efeitos mecânicos da colocação inicial ou forças permanente subsequentes. No caso de estimuladores implantáveis, tais como as próteses da retina, há a consideração adicional, que os parâmetros eléctricos devem situar-se dentro dos limites de segurança. A segurança do paciente é fundamental, por isso os dispositivos devem ser rigorosamente testados em estudos pré-clínicos antes de avançar para a criação de uma clínica 9-15. Em nosso artigo companheiro, foi descrito um método para avaliar a histopatologia localizada do olho ao redor de um implante posicionado no espaço suprachoroidal 16. No presente artigo, são apresentadas uma técnica para a visualização de tecido ocular em torno de um conjunto de eletrodos presos ao retina epiretinally, em uma pré-clínica (felinha) modelo (Figura 1). A localização epiretiniana é a posição mais comumente utilizado para a localização de uma prótese visual. Conjuntos de eléctrodos situados aqui são tipicamente fixado à retina de metal com uma aderência que penetra em todas as camadas do olho 17-20. Antes de as técnicas descritas na presente manuscrito, que era difícil de avaliar com precisão a retina e outros tecidos que circundam imediatamente uma aderência. Fixação padrão olho usando formalina tamponada neutra resultou em danos na retina artefacto devido ao movimento diferencial da retina e esclera contra o ponto fixo da aderência. Portanto, qualquer dano real causado pela aderência e matriz epirretiniana não pôde ser observado com precisão. Além disso, o corte do tecido do olho não pode ser realizada com a aderência da retina in situ como objectos metálicos não pode ser facilmente cortada com aparelhos histológico tradicional; removendo a aderência antes do processamento histológico também foiindesejável como esta também conduziu a danos na retina artificial. O objetivo do presente estudo foi duplo: 1) reduzir retinal artefato descolamento de modo que qualquer dano causado pela aderência ea matriz implante epirretiniana pode ser avaliado de forma confiável; e 2) para visualizar a arquitectura da retina adjacente à aderência sem removê-la. A fim de alcançar este objectivo 1, uma nova técnica de fixação foi utilizada (tal como descrito no artigo associado 16), o que reduz a delaminação da retina artificial. A fim de cumprir o objectivo 2, modificamos um mergulho, moagem e polimento técnica, desenvolvida originalmente para observação in loco de eletrodos de implante coclear 21-23. Os métodos descritos neste manuscrito permitir a visualização da retina circundante e ao lado de um tack in situ, minimizando os danos da retina artifactual e, portanto, permitindo a avaliação precisa de qualquer dano potencial causado pela aderência e matriz epirretiniana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

O protocolo de fixação reduziu substancialmente descolamento artifactual e delaminação da retina 16. Orientação do espécime dentro do bloco epoxi foi conseguida consistentemente usando o processo de incorporação de duas etapas descrito. O processo de moagem incrementais exigido um nível moderado de destreza manual para obter os melhores resultados, mas foi ajudado pelo titular ajustável espécime que proporcionou um bom controle sobre a resolução de incremento. Em todos os casos (n = 5), a aderência foi localizado e terra / polido com resultados desejáveis ​​e consistentes. O retinae adjacente às tachas foram resolvidos e coradas de forma adequada. Polimento da superfície do bloco de resina epoxi com um grau P # 800 papel de carboneto de silício era suficiente para a imagem da macroestrutura celular do tecido embebido. Papel de melhor qualidade, ou pasta de diamante podem ser usadas para polir a superfície posterior, em qualquer profundidade, se desejado. Um microscópio de dissecção e de fibra óptica &quot;pescoço de ganso&quot; lighfonte t verificou-se ser adequado para imagiologia da superfície do bloco de solo e a amostra de tecido embebido. A posição da fonte de luz foi variado por tentativa e erro para descobrir uma localização e ângulo que deu a melhor iluminação e contraste através do microscópio. A adição de uma gota de água destilada sobre a superfície do bloco, por cima da amostra, era útil para reduzir a luz caminho de difracção e / ou distorções lisas na interface ar-epoxi. A Figura 4 mostra exemplos de imagens de tecido da retina visualizadas imediatamente adjacente a uma retina de titânio alinhavar usando esta técnica. Descolamento da retina e não-artefactual de dobragem pode ser visto de ambos os lados do silicone (Figura 4A). O eixo de aderência é visível incorporado em silicone; o chefe do tack penetrou na retina e esclera. Há descolamento da retina não artefactual na retina não corado ambos os lados do silicone (Figura 4C). A técnica tem mostrado que, neste exemplo, o there é desorganização da retina adjacente à aderência e compressão da retina de um lado devido a um ângulo oblíquo de inserção. Note-se que as imagens apresentadas são meramente ilustrações do sucesso da técnica, não é representativo de aderência-dano histopatológico em geral. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figura 1. Colocação de um conjunto de eléctrodos epiretiniana. (A) Representação esquemática do olho que mostra uma secção transversal ampliada da parte posterior da esclera, coróide e retina degenerada (falta fotorreceptores). Um conjunto de eletrodos é retratada em azul, aposta epiretinally. (B) assistida por computador desenho de um conjunto de eletrodos epirretiniana. uma, em circuito integrado (&quot;chip&quot;) e um pacote de eletrodo; b, titânio tack da retina; c, habitação silicone de grau médico; d, ponto de saída de chumbo. Painel A modificado de um illustrati originaisem uma cortesia da Bionic Vision Australia, copyright Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figura 2. remoção do eletrodo e dissecção do olho. High Dynamic Range fotografias macro de um olho felino enucleated com tack epirretiniana in situ. (A) Publicar fixação com fixador de Davidson para preservar a arquitetura da retina 16, o olho enucleado foi dissecado. O pacote conjunto de eléctrodos foi removido a partir do suporte de silicone (contorno quadrado a tracejado indica o local original da disposição de eléctrodos) com a aderência (seta) e corpo do implante de silicone restante. (B) O olho foi dissecada com a secção transversal longitudinal adjacente ao tacha(Linha a tracejado). A aderência continua encravada na parede posterior da ocular (seta), estabilizado predominantemente pela esclera. A secção de tecido contendo a aderência foi preparado por incorporação de resina de moagem e (segmento direito), enquanto que a secção que contém a retina sob o conjunto de eléctrodos foi preparado removido para processamento histológico convencional 16 (segmento à esquerda). A régua com incrementos de 0,5 milímetros é mostrado na borda inferior de cada painel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figura 3. embedment Epoxy e moagem do tack e tecido da retina. Fotografias da epoxy incorporado e amostra de tecido alinhado, moagem, de coloração e de imagem da aderência e tecido da retina. (A) A tac<html> k amostra foi incorporado em um bloco de resina epóxi. Usando o molde, a amostra foi orientada de modo que o plano longitudinal seja paralela ao fundo do molde. (B) O bloco de epoxi curada que contém a amostra de aderência. (C) O bloco epoxi foi montado num suporte de amostra de moagem, pronto para moer . (D) A amostra foi orientada seções para imaged do tecido chão conter as camadas celulares da retina e eixo longitudinal da aderência. (E) A amostra foi moído usando papel de carboneto de silício em um moinho rotativo. (F) A superfície do solo de o bloco foi corado com azul de toluidina para identificar as camadas da retina. (G) O bloco foi lavado em água corrente para remover o excesso de corante. (H) O toluidine azuis camadas da retina manchado e aderência foram fotografadas usando um espaço da alta dissecção powered. ad / 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figura 4. imagens de alta potência e baixa da aderência e da retina. Em vários pontos durante as imagens processo de moagem foram tiradas com um escopo de dissecação, mostrando seções longitudinais do tack (asterisco) que penetram através do olho e que saem da esclera (&#39;S&#39; ), silicone (haxixe) e Azul de Toluidina e retina imaculada (&#39;R&#39;) adjacente. Note que esses são imagens de exemplo apenas para demonstrar a presente técnica de visualização, e não são representativos de todos os implantes ou aderência resultados inserção histologia epirretiniana. Restos térreo da fiação de platina são visíveis em painéis AD (&quot;W&quot;). (A) de baixa potência, imagem imaculada do tack penetrar a retina e esclera. (B) Alta imagem alimentado do descolamento de retina e dobrando na retina unstained adjacente à transportadora silicone imagem A. (C) imagem de baixa potência em, no centro do eixo de rumo. <strong&gt; (D) imagem do centro da aderência na imagem C. (E) Em uma amostra separada de alta potência, com nenhuma transportadora silicone, uma imagem de alta alimentado de toluidina retina manchado por baixo do punho tack é mostrado, imediatamente antes da moagem do eixo tack (F) toluidine normal azul arquitetura retinal manchado (GCL: camada de células ganglionares da retina; INL: camada nuclear interna; ONL: camada nuclear exterior; PR: fotorreceptores; T: felino tapetum lucidum). visualizada usando a mesma técnica de moagem . Barras de escala em cada painel são: A e C = 2 mm; B e D = 500 mm; E = 200 um; F = 100 pm.

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Técnicas de processamento Olhos implantados com uma Retinal Prosthesis para localizada análise histopatológica: Parte 2 Epirretiniana implantes com tachas da retina

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.4K visualizações.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Vídeo: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Técnicas de Processamento de Olhos implantados com uma prótese de retina para análise histopatológica localizada

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Medicina

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

Quantitativa de autofluorescência de Avaliação de Doenças da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A Passo a Passo Protocolo de Cirurgia sub-retiniana em Coelhos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Um Modelo aguda da retina para a Avaliação sanguíneos da retina barreira Descumprimento e potenciais fármacos para o tratamento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Estudando a Diabetes através dos olhos de um peixe: Microdissection, visualização e análise do tg(fli:EGFP) adulto vasculatura da retina de Zebrafish

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are now available for the shoulder, hip, ankle and the first metatarsalphalangeal joint. While providing pain reduction and clinical improvement, progressive degenerative changes of the opposing cartilage are observed in many patients. The mechanisms leading to this damage are not fully understood. This protocol describes a tribological experiment to simulate a metal-on-cartilage pairing and comprehensive analysis of the articular cartilage. Metal implant material is tested against bovine osteochondral cylinders as a model for human articular cartilage. By applying different loads and sliding speeds, physiological loading conditions can be imitated. To provide a comprehensive analysis of the effects on the articular cartilage, histology, metabolic activity and gene expression analysis are described in this protocol. The main advantage of tribological testing is that loading parameters can be adjusted freely to simulate in vivo conditions. Furthermore, different testing solutions might be used to investigate the influence of lubrication or pro-inflammatory agents. By using gene expression analysis for cartilage-specific genes and catabolic genes, early changes in the metabolism of articular chondrocytes in response to mechanical loading might be detected.

This protocol describes the preparation, biotribological testing, and analysis of osteochondral cylinders sliding against metal implant material. Outcome measures included in this protocol are metabolic activity, gene expression and histology.

Testes biotribológicos e Análise de Cartilagem Articular Deslizando contra Metal para Implantes

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Indução e Análise do Estresse Oxidativo em Células Epiteliais de Pigmento Epitelial Humano Transposon-Transfected Da Bela Adormecida

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Transplante de Epitélio de Pigmento De Retina em um modelo de primata não humano para doenças degenerativas da retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...