The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O&#8217;Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children&#8217;s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Todos os ratos utilizados nestes estudos eram ratinhos CD-1 obtidos de Charles River Laboratories. Experiências de cultura anteriores foram também realizados em outras estirpes, tais como C57BL / 6J (dados não mostrados), mas qualquer estirpe pode ser utilizada. Fêmeas adultas grávidas foram aproximadamente 2-3 meses de idade e foram sacrificados por meio de inalação de CO2, seguido por deslocação cervical e toracotomia bilateral antes da remoção do embrião. Os ratos foram alojados em conformidade com as diretrizes do NIH, e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Hospital Medical Center de Cincinnati Children animal Institucional. 1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos <ol><li> Prepara-se uma solução de etanol a 70%. Água deionizada Autoclave (para fazer as câmaras humidificadas e para fabrico de soluções / diluição). Esterilizar instrumentos de dissecação (pinças, tesouras, e 27 g de seringas de agulha) por pulverização para baixo com etanol 70%. </li><li> Preparar10X de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo cálcio e magnésio (80 g NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2,4 g de KH 2 PO 4, 6,75 ml de 1 M de CaCl2, 3,75 ml de 1 M MgCl2 ). Agita-se a dissolver-se em 1 L de água estéril e autoclavada em seguida o filtro com papel de filtro. Dilui-se 10 vezes com água para fazer 1X PBS. </li><li> Inactivar pelo calor soro fetal de bovino (FBS) a 55 ° C durante 30 minutos e filtra-se esterilizar com um filtro de seringa de 0,22? M. </li><li> Preparar 38 ml de 1X meio de cultura completo (DMEM completo chamado, cDMEM), que consiste de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% de FBS filtrado diluição inactivado pelo calor e 1/100 de estoque de penicilina-estreptomicina. Isso geralmente devem ser usadas frescas, mas pode ser armazenado a 4 ° C durante 1 mês. </li><li> Reconstituir o receptor tirosina Kinase Inhibitor II (TKI II) em DMSO para uma concentração de reserva de 5 mg / ml, e diluir com estoque cDMEM para fazer uma solução de trabalho. O con definitivacentração para este estudo é 1,875 mg / ml em cDMEM. De acordo com as recomendações da empresa, soluções de reserva são estáveis ​​por até 6 meses a -20 ° C. Quanto a soluções de trabalho, fazer fresco e utilizar no mesmo dia. Nota: A concentração da droga na solução de trabalho deve ser duas vezes maior do que a concentração final desejada (uma vez que será diluída duas vezes na gotícula). Ao mesmo tempo, preparar o mesmo volume de cDMEM contendo o mesmo volume de DMSO para o tratamento de &quot;controlo&quot;. </li><li> Prepare os reagentes de digestão da cauda (NaOH 50 mM e 1 M de Tris-HCl [pH 8,0]) separadamente em água destilada. </li><li> Faça um balanço dos iniciadores de PCR XY 25 mM (XY Atacante 5&#39;-TGG TGA AGC TTT CTT TGA G-3 &#39;e XY reversa 5&#39;-CCG CTG TCT CCA AAT TTG G-3&#39;), juntamente com água livre de nuclease. </li><li> Preparar tampão 50X TAE (242 g de Trizma base, 57,1 mL de ácido acético glacial, 100 ml de 0,5 M de EDTA, pH 8,5, e adicionar água a 1 L fio volume final). Preparar tampão de corrida TAE 1X (20 ml 50X TAE diluída com água até 1 L de volume total). </li><li> Para criar uma solução de agarose a 2,5% (0,625 g de agarose, 0,5 ml 50X TAE Buffer, 24,5 ml de água), solução de agarose calor no microondas até ferver, em seguida, deixe esfriar até cerca de 55-65 ° C (capaz de tocar). Quando esfriar, adicione 2 ml de solução de brometo de etídio a 1%, e despeje gel. CUIDADO! O brometo de etídio é um agente mutagênico e teratogênico; por favor, use luvas de borracha nitrílica e protocolo de segurança adequado ao manusear. Em alternativa, outros agentes de gel de resolução potencialmente menos tóxicos ou corantes podem ser utilizados. </li><li> Preparar solução de bloqueio (PBS com 0,1% de Triton X-100, 10% de soro fetal de bovino [FBS], e 3% de albumina de soro bovino [BSA]) por imunofluorescência. </li><li> Preparar a solução de lavagem (PBS com 0,1% de Triton X-100, 1% de FBS, e BSA a 3%) para imunofluorescência. </li><li> Prepare PbTx (PBS com 0,1% de Triton X-100) por imunofluorescência. </li><li> Prepare as câmaras de incubação para cuLTURE. Preencha grandes pratos (100 mm de diâmetro) de Petri com 35 ml de água autoclavada. Coloque perto de onde dissecção e culturas será realizada. </li></ol> 2. Isolamento de Fetal Testes de Mus musculus <ol><li> Verifique o rato fêmea para plugues vaginais todas as manhãs. Meio-dia no dia em que é detectado o rolhão vaginal é considerado E0.5. Euthanize o mouse fêmea grávida em E11.5, de uma forma consistente com os protocolos de animais aprovados. </li><li> Spray para baixo abdômen rato com etanol 70%. </li><li> Abra a pele da barriga e do peritoneu com uma incisão em forma de V usando tesoura fina e puxe retalho de tecido para trás para expor os órgãos internos. </li><li> Localize os ovários em ambas as extremidades do corno uterino. Com uma tesoura, cortar no ovário e do tecido conjuntivo para separar o útero contendo os embriões a partir do corpo da mãe. </li><li> Abrir a parede uterina cortando cuidadosamente o lado oposto da placenta, expor os sacos de gema. Seja cuidadoso para não puncture saco vitelino de embriões para evitar danificar ou perder. </li><li> Corte perto da placenta para remover os sacos de gema contendo o embrião e colocá-los num prato contendo PBS com cálcio e magnésio. A presença de iões de cálcio e de magnésio ajudará a moléculas de adesão celular de suporte para manter a arquitectura do tecido e evitar que o tecido que adere às ferramentas de dissecação. </li><li> Com uma pinça, remover o saco vitelino e âmnio do embrião por punção cuidadosamente o saco vitelino para criar um orifício no qual o embrião pode deslizar para fora. Uma vez que o embrião está fora do saco vitelino, o corte do cordão umbilical. </li><li> A partir deste ponto em diante, usar um microscópio localizado num capuz de cultura de tecido estéril. Retire a cabeça do embrião e descarte por beliscar com uma pinça de cada lado do pescoço. </li><li> Retire a cauda e coloque em um novo tubo de microcentrífuga para análise XY PCR para determinar o sexo do embrião. Nota: Embora seja óptima para gónadas cultura o mais rapidamente possível após a colheita, é também possível remover ADN da cauda e executar XX / XY genotipagem antes da cultura, de modo que o sexo de cada embrião é conhecido e apenas o sexo desejado precisa de ser cultivadas. Enquanto a genotipagem está a ser feito, os embriões podem ser mantidas separadas (de modo que eles podem ser rastreados) a 4 ° C ou sobre gelo até estar pronta para a cultura. Uma ressalva é que este período fora no útero ou de cultura de condições podem potencialmente afectar a viabilidade para a cultura ou desenvolvimento posterior durante a cultura. </li><li> Prenda o embrião em decúbito dorsal contra a parte inferior da placa de cultura fixando as axilas de embrião com um par de fórceps (geralmente a pinça na mão fraca). Manter esses fórceps no lugar para segurar o embrião ainda durante todo o processo de dissecação. </li><li> Em conjunto com outro par de fórceps, retire a pele cobrindo abdômen e remover suavemente fígado, intestinos e outros órgãos para expor a parede traseira do corpo. </li><li> Como as gónadas será localizada na parede do corpo para trás em ambos os lados da aorta dorsal,um grande vaso sanguíneo que corre ao longo da linha média do corpo, por baixo do cume colher urogenital com uma pinça fechadas e remover o cume urogenital abrindo os fórceps e levantando-se. Como as gônadas serão livremente fixado à parede, tenha cuidado para não puxar para cima muito rápido, sem retirar essas conexões ou as gônadas pode esticar, causando danos aos órgãos. </li><li> Mova o cume urogenital em cDMEM em um prato para se aclimatar tecido a mídia. </li><li> Separa-se o complexo gónadas-mesonephros do resto do rebordo urogenital utilizando agulhas 27 G. Use uma agulha para cortar, pressionando para baixo e usar o outro para orientar o tecido corretamente para permitir a separação ideal. Evite usar um movimento de corte contra o fundo do prato, como agulhas afiadas irá criar pedaços de plástico que pode furar o tecido. Certifique-se de manter os mesonephros completamente ligados à gônada. </li></ol> 3. A cultura de Gonad com um inibidor da pequena molécula <ol><li> Definir dois 20 μl pipetas de 15 ul cada. Cortar cerca de 1-2 mm de uma das pontas de pipeta barreira usando uma lâmina de barbear limpo, esterilizado para a transferência das gônadas e adição de controle cDMEM, enquanto a outra pipeta será usado exclusivamente para cDMEM tratado com o fármaco. </li><li> Alinhar com gónadas seu eixo longo paralelo para a ponta da pipeta de modo que eles podem ser facilmente pipetada utilizando a ponta de corte. Tenha cuidado com gônadas degola para o interior da ponta da pipeta. </li><li> Rotular um lado que a gotícula de controlo e o outro como a gota contendo o fármaco. Apenas duas gotas pode caber em uma tampa prato de 35 mm. Certifique-se de que os rótulos sobre tampas coincidir com os rótulos em microtubos contendo cauda do tecido. </li><li> Pipetar 15 ul de cDMEM contendo um único gónada em uma gota na tampa de uma pequena (35 mm) (prato de cultura de usar somente as tampas, como os fundos são demasiado altos para se ajustar dentro de uma câmara humidificada placa de Petri). Colocar duas gotas contendo gónadas separadas em ambos os lados do prato, FR bem separadosom uma outra. Verificar sob o microscópio para assegurar que as gónadas tenham sido transferidas para as gotículas. </li><li> Para a gotícula designada como controlo, adicionar um adicional de 15 ul de DMSO contendo cDMEM (feito no passo 1.5) para fazer uma gota com um volume total de 30 ul. Utilize apenas a pipeta de &quot;controle&quot; que não vai entrar em contato com a droga. </li><li> Para a outra gotícula (amostra tratada com drogas), adicionar 15 ul de TKI-II contendo cDMEM para fazer uma gota com um volume total de 30 ul. Utilizar apenas a pipeta designada para as amostras tratadas com droga. </li><li> Utilizando a pipeta, espalhar-se as gotículas de um padrão circular em expansão até que eles são cerca de 15-18 mm de diâmetro e da gónada é colocado aproximadamente no meio. Orientar a gônada para que ele fique do seu lado e da gônada e mesonephros são facilmente distinguíveis. Orientar o pulmão, de modo que os dois lóbulos estabelecer plana. <ol><li> Apesar de o diâmetro das gotículas podem variar ligeiramente, garantir que gônadas não são floating e são mantidos no lugar pela tensão superficial. Certifique-se de que as gotas não tocam um no outro, ou o lado da tampa. Sem a tensão superficial, os órgãos vão crescer sobre a tampa durante a cultura e achatar, distorcendo assim a morfologia do órgão. </li></ol></li><li> Cuidadosamente coloque a tampa prato de cultura contendo as gotículas na posição vertical sobre a superfície da água no grande (100 mm) humidificador prato. Assegurar que não existem bolhas de ar por baixo da parte inferior da tampa e que é deitado sobre a superfície da água. Não inverter a tampa e tenha cuidado para não deixar a água tocar o topo da tampa, onde as gotas estão localizados. </li><li> Para criar uma pequena câmara humidificada, cobrir imediatamente com a tampa do prato maior do humidificador para delimitar as culturas gônadas. Agir o mais rápido possível para minimizar qualquer evaporação da mídia. Certifique-se de que o prato menor tem espaço entre ele ea tampa do prato maior para se movimentar livremente; caso contrário, a condensação pode fazer um selo e ba troca de ar de bloqueio para o tecido. </li><li> Uma vez que duas pequenas tampas são colocadas no interior da câmara, colocar imediatamente a câmara para dentro da incubadora. Incubam-se as culturas durante 48 horas de gotículas numa atmosfera humidificada com CO 2 incubadora a 37 ° C. </li></ol> 4. Polymerase Chain Reaction para determinar o sexo de embriões <ol><li> Adicionar as caudas embrionárias a parte inferior de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar a cada tubo 200 ul de NaOH a 50 mM. </li><li> Coloque a 95 ° C durante 15 minutos ou até que o tecido está completamente dissolvido. </li><li> Adicionar 50 ul de 1M Tris-HCl e vortex levemente e brevemente. </li><li> Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, fazer um novo PCR master mix multiplicando cada volume ao número total de amostras: 0,5 ul de solução de primário de 25 um, com 2,5 uL 10X tampão Taq, 0,5 ul de dNTPs 10 mM (nucleótidos), 19,3 ul de nuclease água livre, 0,2 ul Taq DNA polimerase. Misture bem. </li><li> Adicionar 23ul de PCR Master Mix para PCR tubos contendo 3 ul de lisado de caudas digeridos. </li><li> Flick tubos para misturá-los, em seguida, realizar uma breve centrifugação para trazer as amostras para o fundo do tubo. </li><li> Execute programa XY (Short) PCR (Tabela 1). </li><li> Coloque as amostras com corante (5x) e escada em um gel de agarose a 2,5% em tampão TAE 1X. </li><li> Executar a electroforese em gel de agarose até XX e XY bandas pode ser resolvido. </li><li> Imagem do gel com a imagem de captura de luz UV e. </li><li> Analisar o vs bandas específicas do cromossomo Y X-específica cromossomo (cromossomos X = 331 pares de bases [bp] e XY = 302 bp) 13; XY amostras (male) terá duas bandas de 331 e 302 pb, enquanto XX amostras (feminino) aparecerá como uma única banda 331 pb. </li></ol> 5. Whole Imunofluorescência Mount Organ Dia 1: <ol><li> Retirar as gónadas a partir da cultura, utilizando uma pipeta de 1000 mL com uma ponta de corte. Se desejado, podem sercolocada num prato de PBS para lavar meios e reagentes. Colocar em PBS num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Quanto menor o tamanho do tubo vai economizar reagentes e torná-lo mais fácil de manter o controle de amostras no tubo. <ol><li> Certifique-se de manter o controle e amostras tratadas, bem como amostras XX e XY, em tubos separados e removê-los da cultura com conjuntos separados de pipetas para evitar a contaminação potencial da droga. </li></ol></li><li> Lavam-se as gónadas duas vezes com PBS. Deste ponto em diante, este protocolo pode usar 1X PBS sem cálcio e magnésio. Lavá-los, permitir que as gônadas para desviar para o fundo do tubo (pela gravidade) e, em seguida, remover o líquido acima. Tenha cuidado para não perder gônadas pipetando muito perto deles. </li><li> Remover o máximo possível de PBS do tubo. Adicionar 250 uL de paraformaldeído a 4% em PBS contendo 0,1% de Triton X-100, e deixar incubar O / N a 4 ° C num agitador rotativo. Alternativamente, esta fixação pode ser feita durante 2 horas a 4 ° C num agitador rotativo. CUIDADO! Paraformaldehyde é uma substância tóxica, então siga o protocolo de segurança ao manusear. </li></ol> Dia 2: <ol start="4"><li> Lavar as gônadas duas vezes em 250 ul PbTx em RT. </li><li> Lavam-se as gónadas 3 vezes com 250 ul de PbTx durante 10 minutos cada, à TA num agitador rotativo. </li><li> Bloquear as gônadas, pelo menos, 1 hora em 250 mL solução a RT em uma cadeira de balanço de bloqueio. </li><li> Corar as gónadas o / n a 4 ° C num agitador rotativo em 250 uL de anticorpo primário diluído em Solução de Bloqueio. </li></ol> Dia 3: <ol start="8"><li> Lavar as gônadas duas vezes em 250 mL Solução de Lavagem. </li><li> Lave as gônadas 3 vezes com 250 mL Solução de Lavagem por 10 min cada em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço. </li><li> Bloquear as gônadas 1 hora em 250 mL de bloqueio Solução na RT em uma cadeira de balanço. </li><li> Cobrir o tubo de microcentrífuga com folha de alumínio para proteger os anticorpos secundários fluorescentes da luz. </li><li> Incubar as gônadas 2-4 horas à temperatura ambiente no arocker em 250 uL de anticorpo secundário diluído em Solução de Bloqueio contendo Hoechst 33342. Alternativamente, executar anticorpo secundário e Hoechst 33342 incubação O / N a 4 ° C no balancim. </li><li> Lavar as gônadas duas vezes em 250 ul PbTx. </li><li> Lavam-se as gónadas 3 vezes em 250 ul de PbTx durante 10 minutos cada, à TA num agitador rotativo. </li><li> Usando uma pipeta de ponta de corte, transferir gônadas em um slide com líquido mínimo. Retire o excesso de líquido com pipeta, mas certifique-se que o tecido não seque. </li><li> Orientar as gônadas na forma desejada com uma pinça, e rapidamente adicionar uma gota de meio de montagem para montar as gônadas no slide. Certifique-se os casacos de mídia de montagem todas as amostras completamente; é fundamental para evitar que as amostras sequem. </li><li> Use lamelas (número 1,5 estilo) de tamanho apropriado para cobrir suavemente amostras. Vamos montar propagação mídia entrar em contato com a superfície inteira da lamela. Se necessário, muito pressionar ligeiramente nos cantos de modo que a lamelanão existem grandes bolhas de ar. </li><li> Selar as lâminas com unhas polonês claro em torno das bordas para reduzir a evaporação do meio de montagem. Loja slides montados no escuro a 4 ° C. </li></ol>

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Biol. 927, 479-488 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+functional+sperm+in+cultured+neonatal+mouse+testes.">In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes.</a> Nature. 471, 504-507 (2011).</li><li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system.">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este estudo demonstra todo um método de gotícula ex vivo de órgãos que tem muitas aplicações potenciais para o estudo do desenvolvimento fetal. Esta técnica pode ser usada para vários órgãos, e permite ao investigador para abordar questões biológicas que são difíceis de analisar utilizando abordagens in vivo, devido à inacessibilidade dos embriões e potencial letalidade embrionária. Este método de cultura tem benefícios adicionais em relação às outras abordagens in vitro ...

Regeneração de órgãos in vivo em seres humanos é muito limitada; por conseguinte, a engenharia de tecidos, o desenvolvimento dos tecidos e órgãos individuais de células doadas por um hospedeiro, é cada vez mais atraente uma terapia potencial para a substituição de órgãos. No entanto, para esta estratégia terapêutica para ser bem sucedido, os fatores e interações celulares envolvidos na morfogênese do órgão deve ser cuidadosamente estudado e bem-compreendido. Devido à incapacidade para estudar o desenvolvimento de órgãos específicos com abordagens tradicionais, os investigadores voltaram-se para alternativa embrião inteiro ou culturas de órgãos inteiros. Kalaskar et al. 1 têm demonstrado que ex vivo toda a embriogênese cultura produz resultados comparáveis ​​(em 58% dos embriões cultivados) no desenvolvimento do útero, o que sugere que ex vivo métodos de cultura são uma alternativa viável para estudos de organogênese. Um sistema de cultura de órgão individualizado, tal como este ex vivo droPlet sistema de cultura, permite a toda a análise de órgãos independente de efeitos sistémicos, enquanto permite a manipulação de uma via de sinalização específica ou interacções celulares através de adição de reagentes farmacológicos ou anticorpos. Tradicionalmente, o estudo do desenvolvimento dos órgãos do feto tem sido limitada às tecnologias transgénicos e knockout do rato, em adição aos reagentes farmacológicos entregues maternalmente. No entanto, existem problemas técnicos envolvendo essas técnicas e tratamentos in vivo; a maioria das preocupações giram em torno dos efeitos de influenciar vários órgãos simultaneamente, que muitas vezes resulta em letalidade embrionária. Uma preocupação adicional dos estudos manipulando o desenvolvimento do feto é farmacologicamente o efeito materno de drogas no desenvolvimento embrionário no útero (por exemplo, metabolismo materno do fármaco antes de alcançar o embrião) e se tais reagentes podem passar através da barreira da placenta. A técnica de cultura de órgão inteiro descritoaqui foi adaptado a partir de um primeiro protocolo descrito por Maatouk et al. 2, em que gônadas fetais inteiras são incubadas ex vivo em culturas de gotículas na posição vertical. Uma vantagem significativa da cultura gônadas fetais é que os inibidores de pequenas moléculas podem facilmente acessar todo o órgão por difusão simples. . DeFalco et ai demonstraram que utilizando este método ex vivo gota cultura em conjunto com inibidores de moléculas pequenas podem ser usados ​​para estudar processos e das interacções que ocorrem durante o desenvolvimento das gónadas 3 sinalização; estes processos seria difícil de examinar in vivo, devido aos desafios técnicos (por exemplo, a passagem das drogas através da placenta ou letalidade de afectar vários órgãos utilizando abordagens genéticas ou farmacológicos). A cultura gota não é apenas uma melhoria em certos aspectos mais na experimentação útero, mas também é uma melhoria em relação in vitro e ex visistemas VO bem. A utilização de linhas de células para estudar a morfogénese é extremamente difícil porque lhes faltam os tipos de células diferentes, não têm componentes críticos da matriz extracelular (ECM) que permitem a formação de arquitectura de órgãos, e podem exibir artefactos em cascatas de sinalização. Embora a engenharia de tecidos fez melhorias significativas na criação de andaimes simulando ECM, a falta de conhecimento em relação aos quais são os sinais necessários para cada tipo celular durante a organogénese torna difícil construir um sistema do órgão in vitro. Outros sistemas ex vivo foram previamente estabelecido para estudar a organogênese, ou mais especificamente morfogênese, e tem sido muito bem sucedida para geração de imagens ao vivo de órgãos fetais em agar 4, transwells 5, 6 filtros, e outras matrizes de andaime 7,8. A vantagem do sistema de cultura de gotícula é que ele permite o estudo da morfogénese, proporcionando a capacidade de utilizar menos reagentes, que são Often caro, mas dando também a tensão da superfície de órgãos, o que é importante para o crescimento e capacidades de sinalização 9. No rato, a morfogênese testículo inicial ocorre entre embrionário (E) encena E11.5 e E13.5; estas fases compreendem a janela de tempo óptimo para factores que influenciam a diferenciação específicos do sexo examinar. Entre os processos críticos que ocorrem durante a formação dos testículos são a geração de arquitectura cabo de testículo e a formação de uma rede vascular específico do testículo. Utilizando este conjunto de órgãos ex vivo sistema de cultura gota, uma é capaz de alterar a vascularização específicos de macho e testículo inibir a morfogénese, através da utilização de um inibidor de molécula pequena que bloqueia a actividade dos receptores para o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); Remodelação vascular mediada por VEGF é crítico para o desenvolvimento dos testículos 10-12. Esta técnica pode ser aplicada com sucesso para outros órgãos e pode ter como alvo tempo específicojanelas de desenvolvimento. Whole-mount imagens de órgãos permite a visualização de estruturas vitais, bem como mudanças estruturais e celulares decorrentes da administração de vários inibidores. Importante, este sistema é vantajosa na medida em que o pesquisador pode ignorar os potenciais efeitos de confusão de administração da droga materna ou perturbação sistémica in vivo durante estratégias gene alvo. Assim, todo esse órgão ex vivo sistema de cultura gota pode melhorar significativamente a capacidade de compreender as interacções e de sinalização que ocorrem especificamente dentro de determinados órgãos durante o desenvolvimento fetal.

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Strip 0.2 ml PCR Tubes &amp;amp; Detached Flat Caps</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Denville</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;l SHARP Precision Barrier Tips</td><td>Denville</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe with 27 gauge needles</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringe</td><td>BD</td><td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;M PES syringe filter</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture Dish</td><td>Falcon/Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Galaxy 14 S CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td>Nuare</td><td>NU-425-400</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td></td></tr><tr><td>SMZ445 stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Absolute 200 proof Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XY PCR Primer&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>1% Ethidium bromide solution</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer</td><td>Denville</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Chloride (HCl)</td><td>Fisher</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation</td><td>Bioexpress</td><td>0332-100g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filtered</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>Heat-inactivate before using</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Use at 1:100</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>Use at dilution: 1:4,000</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9661S</td><td>Use at dilution: 1:250</td></tr><tr><td>Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>H1399</td><td>Use at 2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-165-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-605-153</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>Use at dilution: 1:500</td></tr></tbody></table>

using ex vivo upright droplet cultures of whole fetal organs to study developmental processes during mouse organogenesis

Investigando organogênese in utero é um processo tecnicamente desafiador em mamíferos placentários, devido à falta de acesso aos reagentes para embriões que se desenvolvem dentro do útero. Um método de cultura ex vivo gota vertical recentemente desenvolvido fornece uma alternativa atractiva para os estudos realizados in utero. O ex vivo cultura gota fornece a capacidade de examinar e manipular interações celulares e diversas vias de sinalização através da utilização de vários compostos de bloqueio e de activação; Além disso, os efeitos de vários reagentes farmacológicos no desenvolvimento de órgãos específicos podem ser estudados sem efeitos secundários indesejados da administração sistémica de fármacos no útero. Em comparação com outros sistemas in vitro, a cultura gotícula não só permite a capacidade para estudar tridimensional morfogénese e interacções célula-célula, a qual não pode ser reproduzida em linhas de células de mamíferos, mas também requer significativamente menos reagents do que outro ex vivo e in vitro. protocolos Este trabalho demonstra adequada do rato fetal e dissecção do órgão técnicas de cultura verticais gota, seguido por imunofluorescência órgão inteiro para demonstrar a eficácia do método. O método ex vivo gota cultura permite a formação de arquitectura órgão comparável ao que se observa in vivo e pode ser utilizado para estudar processos de outro modo difíceis de estudo devido a letalidade embrionária em modelos in vivo. Como um modelo de sistema de aplicação, um inibidor de molécula pequena vai ser utilizado para sondar a função de vascularização na morfogénese testicular. Este ex vivo gota método de cultura é expansível para outros sistemas de órgãos fetais, como pulmão e potencialmente outros, embora cada órgão deve ser extensivamente estudado para determinar quaisquer modificações específicas do órgão para o protocolo. Este sistema de cultura de órgãos proporciona flexibilidade na experimentação de órgãos fetais, e resulta obtained usando esta técnica vai ajudar os pesquisadores a obter insights sobre o desenvolvimento fetal.

A cultura ex vivo permite que uma gotícula de manipular órgãos inteiros, tais como a gónada, para estudar as interacções celulares e dinâmica. A Figura 1 mostra de uma forma passo a passo como preparar uma cultura E11.5 gonadal gota. Os primeiros passos do protocolo de cultura incluem a remoção inicial do útero contendo embriões de rato a matriz (Figura 1A e 1B). Após a remoção do útero da mãe, a parede uterina é cortado e os embriões são libertados a partir ...

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Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

12.4K visualizações.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Biologia do Desenvolvimento

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids represent useful models to study the mechanisms that control stem cell self-renewal and differentiation in mammals, including primary ciliogenesis and ciliary signaling. Primary ciliogenesis is the dynamic process of assembling the primary cilium, a key cell signaling center that controls stem cell self-renewal and/or differentiation in various tissues. Here we present a comprehensive protocol for the immunofluorescence staining of cell lineage and primary cilia markers, in whole-mount mouse mammary organoids, for light sheet microscopy. We describe the microscopy imaging method and an image processing technique for the quantitative analysis of primary cilium assembly and length in organoids. This protocol enables a precise analysis of primary cilia in complex three-dimensional structures at the single cell level. This method is applicable for immunofluorescence staining and imaging of primary cilia and ciliary signaling in mammary organoids derived from normal and genetically modified stem cells, from healthy and pathological tissues, to study the biology of the primary cilium in health and disease.

Three-Dimensional Imaging of Organoids to Study Primary Ciliogenesis During ex vivo Organogenesis

Stem cell-derived organoids facilitate the analysis of molecular and cellular processes that regulate stem cell self-renewal and differentiation during organogenesis in mammalian tissues. Here we present a protocol for the analysis of the biology of the primary cilium in mouse mammary organoids.

Organoids are stem cell-derived three-dimensional structures that reproduce ex vivo the complex architecture and physiology of organs. Thus, organoids ...

Genética

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony forming units (CFU-Es). After CFU-Es, cells are morphologically recognizable and generally termed terminal erythroblasts. One of the challenges for the study of terminal erythropoiesis is the lack of experimental approaches to dissect gene functions in a chronological manner. In this protocol, we describe a unique strategy to determine gene functions in the early and late stages of terminal erythropoiesis. In this system, mouse fetal liver TER119 (mature erythroid cell marker) negative erythroblasts were purified and transduced with exogenous expression of cDNAs or small hairpin RNAs (shRNAs) for the genes of interest. The cells were subsequently cultured in medium containing growth factors other than erythropoietin (Epo) to maintain their progenitor stage for 12 hr while allowing the exogenous cDNAs or shRNAs to express. The cells were changed to Epo medium after 12 hr to induce cell differentiation and proliferation while the exogenous genetic materials were already expressed. This protocol facilitates analysis of gene functions in the early stage of terminal erythropoiesis. To study late stage terminal erythropoiesis, cells were immediately cultured in Epo medium after transduction. In this way, the cells were already differentiated to the late stage of terminal erythropoiesis when the transduced genetic materials were expressed. We recommend a general application of this strategy that would help understand detailed gene functions in different stages of terminal erythropoiesis.

We present an in vitro mouse fetal liver erythroblast culture system that dissects the early and late stages of terminal erythropoiesis. This system facilitates functional analysis of specific genes in different developmental stages.

Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Imunologia e Infecção

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Recapitulando a transição de amamentação in vitro usando organóides intestinais fetais

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental processes and modelling kidney disease. However, the models are limited by a lack of vascularization and functionality. To address this, an improved protocol for the method of xenografting cells and tissues to the chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo to gain vascularization and restoration of blood flow was developed. The grafts are overlaid with custom-made minireservoirs that fix the samples to the CAM and supply them with culture medium that protects the grafts from drying. The improved culture method allows xenografts to grow for up to 9 days. The manuscript also describes how to provide optimal conditions for long-term confocal imaging of renal organoids and organotypic cultures using the previously published Fixed Z-Direction (FiZD) method. This method gently compresses an embryonic organ or organoid between a glass coverslip and membrane in a large amount of medium and provides excellent conditions for imaging for up to 12 days. Together, these methods allow vascularization and blood flow to renal organoids and organotypic kidney cultures with improved confocal imaging. The methods described here are highly beneficial for studying fundamental and applied functions of kidneys ex vivo. Both methods are applicable to various types of tissues and organoids.

This work describes two methods for studying organ development, an improved xenotransplantation setup on chorioallantoic membrane (CAM) from avian embryos that allows for vascularization of cultured embryonic organs and organoids and a novel fixed z-direction organ culture method with modified experimental conditions that allows for high-resolution time-lapse confocal imaging.

Otimização da Cultura Organóide Renal e Organotípica para Vascularização, Desenvolvimento Estendido e Imagem Microscopia Aprimorada

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

Ex Utero Cultura de Embriões de Camundongos de Pregastrulation a Organogênese Avançada

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

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Biologia

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

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Neurociência

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

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