Research in Spagnoli laboratório. é financiado pela Associação Helmholtz, FP7-IRG-2008-ENDOPANC concessão e ERC-2009-Começando Grant hepatopâncreas.

O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir da técnica originalmente descrita em Percival e Slack 9 e optimizados para a microscopia confocal. 1. Revestimento de pratos de vidro cultura de fundo Os passos que se seguem devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. <ol><li> Explantes pancreáticas são cultivadas em placas de Petri de 35 mm com 20 mm de diâmetro de vidro de micropoços de fundo (por exemplo MatTek Corporation). Use um prato fundo de vidro por explante e cultura para toda a duração da cultura. No dia antes da dissecção e isolamento dos brotos pancreáticos, revestimento das microcavidades de vidro de fundo com a fibronectina. </li><li> Diluir fibronectina estéril em água de cultura de células para um grau 50 ug / ml de concentração final e adicionar um volume mínimo de la (~ pi 150) para o micropoço de 20 mm das placas Mattek cobrindo toda a superfície do vidro (Figura 1E). Coloque os pratosnum refrigerador 4 ° C por incubação durante a noite. </li><li> No dia da dissecção, aspirar a fibronectina, lavar a microplaca com água de grau de cultura de células e adicionar um volume mínimo de 150 ul de BME (Basal Eagle Médium) suplementados com meio de Pen / Strep (1%), glutamina (1% ) e 50 ug / ml de gentamicina [Medium Dissection]. Deixe os pratos revestidos no fluxo laminar até estar pronto para placa explantes. </li></ol> Se nem todos os pratos de fibronectina-revestidos são usados, eles podem ser armazenados durante um período máximo de 1 semana a 4 ° C. Não deixe que os pratos secar, encha-os com meio de dissecção e colocá-los na geladeira. Além de fibronectina, explantes pancreáticas foram cultivadas com sucesso em vários substratos, tais como laminina 9, matrigel 10,11 ou membranas microporosas 12. Devido aos seus efeitos sobre a ramificação, usamos fibronectina 9 como substrato. 2. Dissecção de DBud pâncreas orsal de E11.5 - E12.5 embriões de camundongos <ol><li> Cronometrado grávidas camundongos fêmeas no dia embrionário (E) 11,5 ou 12,5 são sacrificados e os embriões são coletados por meio de instrumentos de dissecação previamente limpas com etanol 70%. Coloque o útero dissecado em 10 cm placas contendo PBS gelado suplementado com 50 ug / ml de gentamicina. </li><li> Sob estereomicroscópio com iluminação de cima, o útero separado em segmentos de embriões individuais utilizando pequenas tesouras ou pinças Dumont, delicadamente descascar o músculo do útero e remoção dos embriões individuais, que estão rodeados pela decídua. Use técnicas de dissecação padrão embrião 13 para expor os embriões e retire o saco vitelino e âmnio. Subsequentemente, remover a parte superior do corpo do embrião (acima do fígado), e a região da cauda. Isto irá permitir que a exposição de órgãos internos (Figura 1B). Transferir o corpo médio dos embriões em placas de 10 cm, contendo gelada BME meio de dissecção. </li><li> Agoratransiluminação usar apenas abaixo para visualizar e dissecar o broto pancreático dorsal, ao microscópio estereoscópico. Suavemente, abra o meio-corpo do embrião, fazendo uma incisão lateral com uma pinça. Localize o estômago e baço. O broto pancreático dorsal está ligado lateralmente à região posterior do estômago (Figura 1C). Usando fórceps Dumont, dissecar afastado do broto pancreático dorsal a partir de estruturas adjacentes, tais como o estômago e do baço, mas deixando algumas mesênquima em torno do epitélio (Figura 1D). Utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, a transferência do broto isolado em uma placa de Petri de 35 mm contendo meio de dissecção gelado BME suplementado com 10% soro fetal de vitela [Meio de Cultura]. Repita essas etapas até que todos os pâncreas são isolados. Se pâncreas de diferentes genótipos são isolados, mantê-los separados usando Nunc quatro poços. </li></ol> 3. Revestimento e Cultura de explantes pancreáticas Plat finalção dos explantes é efectuada em ambiente de cultura de tecido e / ou em estreita proximidade com o tecido incubadora de cultura para minimizar o movimento físico das culturas. <ol><li> Sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar substituir o meio de dissecção BME nos pratos fibronectina revestidos com Mattek ~ ul 150 de BME meio de cultura previamente aquecido a 37 ° C. </li><li> Cuidadosamente, transferir os explantes pancreáticas em pratos revestidos Mattek um explante (por placa) de culturas de longo prazo, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro. Para assegurar a difusão durante a cultura, no mesênquima em torno dos explantes podem ser ligeiramente rasgada, se necessário, com uma agulha fina. </li><li> Suavemente, coloque as culturas num incubador de cultura de tecido (37 ° C, 5% CO 2) durante algumas horas para permitir que os explantes de anexar os micropoços com fundo de vidro. Uma vez que se encontram ligados, encher os pratos Mattek com 1,5 ml a 2 ml de meio de cultura de BME pré-aquecida a 37 ° C. O dia da dissecção é referido como o dia 0. </li><li> Homemipulation das culturas de explantes do pâncreas é realizada sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. O meio de cultura BME é alterado todos os dias, menos que os requisitos experimentais ditar calendário diferente (por exemplo, a incubação de explantes com agentes químicos). Os explantes podem ser cultivadas nestas condições durante 5 dias até uma semana. </li></ol> 4. Todo-mount Protocolo imunofluorescência para explantes pancreáticas Todos os passos do protocolo de imunofluorescência (a partir de fixação de imagem) são realizados no prato MatTek mesmo, o que produz melhores imagens do que um prato de plástico de fundo. Após a fixação, as culturas de explantes pancreáticas não precisam de ser mantidas sob condições estéreis. <ol><li> Aspirar BME meio de cultura e lava-se o explante, uma vez com 2 ml de PBS 1X. </li><li> Para a fixação do explante substitua com 2 ml de PBS gelado paraformaldeído a 4% (PFA), e introduzir a cápsula em gelo durante 20 min. Redemoinho a placa suavemente de tempo paratempo, mas evitar plataformas de balanço, como o explante pode separar. </li><li> Remover PFA e lavar os explantes três vezes com 2 ml de 1X PBS durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente (RT). </li><li> Bloco com 2 ml de solução de bloqueio (1X PBS + 0,1% de Triton-X + Donkey 3% de soro) durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Diluir o anticorpo primário em solução de bloqueio e adicionar 150 ul ~ da diluição directamente na microplaca de 20 mm das placas Mattek cobrindo toda a superfície dos explantes para incubação durante a noite a 4 ° C. Para minimizar os movimentos físicos, adicionar o anticorpo primário para os explantes directamente na câmara fria (4 ° C). Para evitar a evaporação, antes de se adicionar o anticorpo, colocar as placas Mattek numa câmara húmida. </li><li> No dia seguinte, remover a solução de anticorpos e lavar três vezes com 2 ml de 1X PBS + 0,1% de Tween-20 (PBT), durante 30 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Diluir o anticorpo secundário em solução de bloqueio [de acordo com as recomendações do fabricante; usamos corantes Alexa Fluor de burro anti secundáriocorpos de diluição 1:750] e adicionar 150 ul ~ da diluição directamente na microplaca de 20 mm das placas Mattek, cobrindo toda a superfície dos explantes, durante 1-2 horas de incubação à temperatura ambiente no escuro. Para contracoloração nuclear, a Hoechst incluem, juntamente com a diluição de anticorpo secundário. Para evitar a evaporação, antes de se adicionar o anticorpo, colocar as placas Mattek numa câmara húmida. </li><li> Lavar três vezes com 2 ml de 1X PBS + 0,1% de Tween-20 (PBT), durante 30 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> Antes da montagem, lavar uma vez com 1X PBS para remover o Tween-20. Montar, adicionando uma gota de meio de montagem aquoso (com anti-desbotamento) para o micropoço de 20 mm das placas Mattek. Gentilmente, cobrir o explante com uma lamela de vidro. Evite bolhas de ar. </li><li> Os explantes em placas Mattek podem ser visualizados por microscopia de contraste de fase normal ou de microscopia confocal, de acordo com os objectivos da experiência. Para análise por microscopia confocal, usamos um Zeiss LSM 700 configuração invertida. Configure lasers apropriados para fluoróforos nosed. Seleccionar um objectivo que será a imagem da área desejada do explante pancreático. Um objectivo da água de imersão-10X é adequado para manter o explante inteiro no campo de visão. Um objectivos 40X água ou de imersão em óleo são adequados para se concentrar em regiões específicas do explante pancreática com maior resolução. Os explantes podem ser opticamente seccionado e, em seguida, o Z-adquirido pilhas reconstruída em 3D, utilizando software apropriado. </li></ol> 5. Live-célula de imagem Protocolo de explantes pancreáticas <ol><li> Configuração de câmara ambiental: usar um gabinete ambiental e uma câmara de incubação pequeno [com a temperatura e controle de CO 2] que se senta no palco microscópio. Cultura adequado do pâncreas embrionário requer uma temperatura estável de 37 ° C e numa atmosfera controlada de 5% de CO 2 humidificado. Câmaras adequadas estão disponíveis a partir de vários fornecedores (Por exemplo, Zeiss, Nikon, Olympus). Montar a caixa de aquecimento e transformá-lo em umpelo menos t 1 hr antes de imagem comece a permitir que o equipamento para aquecer e equilibrar teor de CO 2 a 5%. </li><li> Por lapso de tempo de imagem de culturas de explante pancreáticas, usamos um LSM 700 microscópio invertido Zeiss. Para lasers e seleção objetiva ver ponto 4.10. </li><li> Deixe o explante pancreático anexar bem para o prato com fundo de vidro antes de iniciar a criação de imagens ao vivo. [Nós geralmente realizar imagem ao vivo a partir do Dia 1]. Em uma câmara de fluxo laminar, aspirar e substituir o meio de explante com meio fresco de cultura de BME para começar com as melhores condições de nutrientes. </li><li> Suavemente transferir os explantes para a sala de microscópio e colocar o prato MatTek na câmara de incubação para o suporte de amostras de um microscópio confocal. </li><li> Prepare o objectivo (por exemplo, adicionar óleo ou água médio de acordo com a escolha da objectiva de imersão) e concentrar-se na região de interesse no explante. Feche a câmara ambiental corretamente. Para evitar a evaporação durante lapso de tempoaquisição com água de imersão-objectivos, em lugar de água, recomenda-se a utilização de fluidos de imersão viscosas que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Zeiss Immersol W). </li><li> Configure intensidade do laser, os parâmetros Z-stack de aquisição e intervalo de tempo (ver também discussão para solução de problemas). Iniciar a experiência. </li><li> Depois de imagem, Z exportação pilhas e todos os pontos de tempo e analisá-los usando o software adequado (por exemplo ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Resultados representativos Brotos pancreáticos dorsais (juntamente com o mesênquima envolvente) foram dissecados a partir de embriões de rato E11.5 e E12.5 entre e plaqueadas directamente em pratos de vidro de fundo de cultura (Figura 1). Os vasos sanguíneos estão presentes no mesênquima em torno do epitélio e podem ser visualizadas por imunocoloração para o marcador endotelial PECAM 12 (dados não mostrados). Após dois dias de cultura und, explantes pancreáticoerwent crescimento significativo e começou a organizar-se em estruturas ramificadas epiteliais, cujos núcleos foram positivos para o fator de transcrição de pâncreas, Pdx1 (Figura 2A-C). A média z de espessura de explantes pancreáticos no dia 3 de cultura é 60-80 ^ m. A superfície eo volume dos explantes pode ser medida utilizando software apropriado (por exemplo, Huygens). Análises da morfologia e imunofluorescência mostrou que os explantes pancreáticas cultivadas utilizando este protocolo recapitulado diferenciação in vivo pancreático precoce e eventos morfogenéticos 5,10,11,14 (Figura 2). Explantes pancreáticos no dia 4 de cultura foram submetidos a &quot;ponta e tronco&quot; típico segregação do epitélio 8, exibindo CPA1 + células progenitoras nas pontas dos ramos epiteliais (Figura 2C) e + insulina diferenciadas e + glucagon células organizadas como aglomerados dentro do tronco (Figura 2D ). Além disso, o pancreatic epitélio em culturas ex vivo demonstraram a organização do citoesqueleto celular adequada e polaridade, com localização apical de F-actina (Figura 2E, a verde) e b1-integrina nas membranas basais (Figura 2E, a vermelho). Para estudar pancreático ramificação em tempo real, os explantes de embriões pancreáticos foram isolados a partir da estirpe de ratinhos duplo-cor fluorescente repórter membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mT / mG; estirpe de ratinho está disponível no Laboratório Jackson) (Figura 3). Ainda imagens de um vídeo de lapso de tempo de explantes mT / mG pancreáticas cultivadas em cultura são mostrados na Figura 3. A localização da proteína fluorescente mT a estruturas de membrana descreve a morfologia das células e permite a resolução de finos processos celulares, permitindo controlar a remodelação e migração de células ao longo do tempo. Depois de uma experiência de 12 horas de lapso de tempo o MT sinal de fluorescência permanece viável e deteCTable, embora a sua intensidade é reduzida, provavelmente devido a fotoenvelhecimento (Figura 3). Soluções técnicas para evitar ou reduzir o fotoenvelhecimento e fototoxicidade são discutidos na seção Discussão. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática da dissecação dorsal pâncreas broto de embrião de rato E12.5. (A) imagem de Brightfield E12.5 embrião de rato. A parte superior do corpo do embrião (acima do fígado), e a região da cauda são removidos para isolar o meio-corpo (B). As incisões são mostrados por linhas pontilhadas vermelho. (C) Outros resultados de dissecção em exposição do estômago e do duodeno região (indicado pela caixa tracejada). O broto pancreático dorsal (ver círculo pontilhado vermelho) está na base do estômago e ao lado do primórdio baço. O broto pancreático dorsal dissecado (D) é transferida com uma pipeta de Pasteur para a micropoços de uma placa de fundo de vidro contendo meio de cultura de BME (E, F). Abreviaturas: STO (estômago), sp (baço), dp (broto pancreático dorsal), duo (duodeno). Barras de escala, 1000 ^ m (A, C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Figura 2. Todo-mount análise confocal de imunofluorescência de culturas de explante pancreáticas. (A) as imagens de campo claro de explantes pancreáticos no dia 1 e no dia 2 de cultura ex vivo. Linha pontilhada vermelha indica o início da ramificação do epitélio. (B) a reconstrução 3D de todo-mount imunomarcação para Pdx1 no dia 3 de pâncreas cultura. Explantes pancreáticas mostrou túbulos de Pdx1 + células submetidos a extensa ramificação por 48 horas de culturas. (C) imunomarcação Whole-mount do dia explante pancreático 3 com anticorpos contra o marcador de membrana basolateral da E-caderina (Ecad), marcador de ponta progenitor, carboxipeptidase 1 (CPA1) e fosfo-Histona H3 (phh3). A maior parte da mitose ativa phh3 + células colocalize nas pontas periféricos com CPA1 + células. L tracejadaines indicam ponta dos ramos. (D) imunomarcação inteiro de montagem para os marcadores de linhagem endócrinas, insulina (Ins) e glucagon (Gluca) no dia 3. Setas amarelas indicam grupos de Ins + e + Gluca células. Inset (D &#39;), uma maior ampliação de um dos do aglomerado de células endócrinas. (E) imunomarcação Todo-mount do dia explante pancreático 3 para Pdx1, β1 integrina (β1int) e F-actina (Fato). As células mesenquimais (asteriscos) intercalados entre Pdx1-células epiteliais positivas. As imagens mostradas C, D e E são únicos confocal secções ópticas de Z-série. Barras de escala, 100 um (A, B), 50 uM (CE). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem ao vivo de células Representante do ex explante pancreático vivo culta. (AD) quadros de um filme de lapso de tempo de um explante de pâncreas de uma mT / mG embrião transgênico mouse. Tempo de formação de imagens é mostrado em horas: minutos. O explante foi fotografada a partir de dia 1. Z-stack imagensforam adquiridas com uma objectiva de 40x de imersão em óleo a cada 12 min durante um total de 15 horas. As linhas tracejadas indicam ponta dos ramos e de fronteira entre epitélio e mesênquima. Barra de escala, 50 mm.

<ol>
	<li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas.">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li><li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreas+organogenesis:+from+bud+to+plexus+to+gland.">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development.">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li><li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endoderm+to+pancreas:+a+multistep+journey.">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li><li>Hick, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands:+a+role+for+SDF-1.">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li><li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis.">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li><li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification.">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li><li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis.">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li><li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label.">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li><li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas.">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li><li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging.">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li><li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas.">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma vez que o destino é especificado pancreático, de células progenitoras do pâncreas sofrer proliferação extensiva, a diferenciação e a morfogénese para eventualmente formar um órgão funcional maduro e 2,4. No presente, como a ramificação ocorre no pâncreas e como ele é ligado a proliferação e diferenciação de células progenitoras é em grande parte desconhecida. Culturas de explantes de pâncreas representa um sistema ideal para elucidar esses processos ex vivo 5,9,11.</sup...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Anticorpos: Carboxipeptidase E-caderina F-actina Glucagon Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfo-Histona H3 </td><td> Abd Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hibridoma banco Sinalização celular </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Médio Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Água de grau de cultura de células </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Placas de cultura (com fundo de vidro), de 35 mm </td><td> MatTek Corporação </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Donkey soro </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal de vitelo Ouro </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Estoque sol. 1 mg / ml em água de grau de cultura de células </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> 4-bem multiplacas </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópios: Microscópio confocal invertido (LSM 700) Estereomicroscópio (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Objetivos: C Apochromat-10X / 0,45 W M27 (work. dist 1,8 mm;. Profundidade de imagem ~ 100 mm); Apochromat C-40X / 1,2 W Corr M27 (work. dist 0,28 milímetros;. ~ Profundidade de imagem 50 mm) Transiluminação partir de baixo e de fibra óptica de iluminação a partir de cima </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Roth </td><td> 0.335,3 </td><td> Solução-mãe de 20% </td></tr><tr><td> Pasteur Pipeta (vidro), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Mantido em c estérils condições </td></tr><tr><td> As placas de Petri, 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Mantidos em condições estéreis </td></tr><tr><td> Primavera Tesoura lâmina de 8 mm curvo </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> Foreceps relojoeiro Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

O pâncreas controla as funções vitais do nosso corpo, incluindo a produção de enzimas digestivas e regulação dos níveis de açúcar no sangue 1. Embora na última década muitos estudos têm contribuído para uma fundação sólida para a compreensão organogênese pâncreas, importantes lacunas persistem em nosso conhecimento da formação do pâncreas precoce 2. Uma compreensão completa dos eventos iniciais vão fornecer informações sobre o desenvolvimento do órgão, mas também de doenças incuráveis ​​que visam o pâncreas, como o diabetes ou câncer de pâncreas. Finalmente, esta informação vai gerar um modelo para o desenvolvimento de terapias de substituição de células no contexto da diabetes. Durante a embriogénese, o pâncreas origina distintas excrescências embrionárias da endoderme foregut dorsal e ventral no dia embrionário (E) 9,5 no embrião de rato 3,4. Ambas as excrescências evaginate no mesênquima circundante como epitélios sólidobotões L, que se submetem a proliferação, diferenciação e ramificação para gerar um órgão totalmente madura 2,5,6. Evidências recentes sugerem que o crescimento e diferenciação de linhagens de células, incluindo pancreáticas produtoras de insulina das células β, depende do tecido adequado arquitetura remodelação, epitelial e posicionamento de célula dentro do epitélio pancreático ramificação 7,8. No entanto, como a ramificação ocorre morfogénese e é coordenada com a proliferação e diferenciação no pâncreas é em grande parte desconhecida. Isto é em parte devido ao facto de que o conhecimento actual sobre os processos de desenvolvimento baseou-se quase exclusivamente na análise de amostras fixadas, enquanto que os eventos morfogenéticos são altamente dinâmico. Aqui, apresentamos um método para dissecar e cultura embrionárias de camundongos pancreático ex vivo gemas em pratos de vidro de fundo, o que permite a visualização direta do pâncreas em desenvolvimento (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente concebido para a microscopia confocal laser scanning e, em particular, de imagem ao vivo de células. Explantes pancreáticas podem ser preparados não apenas a partir de embriões de rato de tipo selvagem, mas também a partir de estirpes de murganhos geneticamente modificados (por exemplo transgénico ou knockout), permitindo tempo real estudos de fenótipos mutantes. Além disso, este sistema de cultura ex vivo é útil para estudar os efeitos de compostos químicos sobre o desenvolvimento pancreático, permitindo a obtenção de dados quantitativos sobre a proliferação e crescimento, alongamento, ramificação, tubulogenesis e diferenciação. Em conclusão, o desenvolvimento de um método de pâncreas ex vivo cultura explante combinada com imagens de alta resolução fornece uma plataforma forte para observar eventos morfogenéticos e diferenciação à medida que ocorrem dentro do embrião de rato em desenvolvimento.

Watch this Scientific Journal Video about A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas at JoVE.com

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma excelente<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema para estudar vários aspectos do desenvolvimento do pâncreas, incluindo a diferenciação morfogênese e crescimento. Explantes broto pancreático pode ser cultivada por vários dias e usado em uma variedade de aplicações diferentes, incluindo todo-mount imunofluorescência e imagem ao vivo.

Um Sistema de<em&gt; Ex vivo</em&gt; A cultura de Pâncreas embrionárias

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

a-system-for-ex-vivo-culturing-of-embryonic-pancreas

Research

JoVE Journal

Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.6K visualizações.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. Aqui, nós descrevemos um método para a cultura de isolamento e manipulação de pâncreas de rato embrionário. Isto representa uma excelente Ex vivo Sistema para estudar vários aspectos do desenvolvimento do pâncreas, incluindo a diferenciação morfogênese e crescimento. Explantes broto pancreático pode ser cultivada por vários dias e usado em uma variedade de aplicações diferentes, incluindo todo-mount imunofluorescência e imagem ao vivo.

Vídeo: A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Um sistema para a cultura de células epiteliais pigmentadas da íris para estudo da regeneração Lens em Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Uma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...