Os autores gostariam de agradecer a colaboração e as contribuições financeiras da seguinte agência de financiamento da investigação: Alberta gado e de carne Agency Ltd., CRC carne de porco, carne de porco Alberta, Hypor A Hendrix Genetics Companhia e NSERC CRSNG.

De acordo com a Canadian Council on Animal Care orientações e com a aprovação da Política animal Faculdade e Conselho de Acção Social - Pecuária da Universidade de Alberta, porcas prenhes foram sacrificados por funcionários treinados aproximadamente no dia 30 de gestação e os embriões foram coletados. Use luvas de exame em todos os momentos durante os procedimentos. 1. Colheita e armazenamento Amostra <ol><li> Eutanásia porca usando dardo cativo seguido de sangria. Usar luvas de exame para recolher os aparelhos reprodutivos e embriões de cada porca sacrificados. Nota: cobrança rápida de amostras e embriões de transferência para secar gelo ou azoto líquido resultará em tecidos de maior qualidade para outras obras molecular, tais como microarray e qPCR. </li><li> Dissecar o útero e delicadamente separar todos os embriões dentro de suas membranas da placenta extraembryonic da parede uterina subjacente 21. Certifique-se de que não há contaminação dos tecidos maternal. </li><li> Récomprimento do cabo e o peso de todos os embriões viáveis ​​antes da congelação. </li><li> Recolha cada um dos embriões e imediatamente envolvê-lo em uma folha de alumínio antes pressão congelamento com nitrogênio líquido. </li><li> Transferir os embriões congelados de nitrogênio líquido diretamente para a -80 ° C congelador. </li></ol> 2. Os embriões Moagem <ol><li> Rotular todos os tubos de amostra (15 ml), com a identificação da amostra necessária para o número de amostras a serem analisadas. </li><li> Encha o recipiente térmico com gelo seco para metade e inserir o tubo de amostra pré-rotulado no gelo seco. </li><li> Usar luvas de inverno com um outro par de luvas de exame em cima para transferir os almofarizes e pilões pré-refrigerados de -80 ° C freezer para secar recipiente de gelo. </li><li> Coloque o embrião congelado dentro da argamassa sobre o gelo seco. </li><li> Pour azoto líquido adequado para cobrir o embrião e moê-lo com o pilão em um pó fino. </li><li> Transferir o pó embrião para um tubo de amostra pré-marcado com um microspatula (Figura 1) e colocar o tubo num congelador de -80 ° C. </li><li> Use uma argamassa pré-refrigerado limpa e pilão para cada embrião e alterar as luvas de exame após a moagem cada embrião para evitar a contaminação cruzada entre as amostras. </li></ol> 3. ADN genómico de preparação utilizando modificação de sódio Hidróxido Método <ol><li> Etiqueta de todos os tubos de microcentrifugação (1,5 ml) necessárias para o número de amostras a serem analisadas. </li><li> Transferir os tubos de amostra contendo embrião em pó a partir do congelador -80 ° C para um recipiente com gelo seco antes de se iniciar. </li><li> Pipetar 180 l de NaOH 50 mM (hidróxido de sódio) para cada tubo de microcentrífuga pré-rotulados. </li><li> Ligar uma incubadora e de pré-aquecimento a 95 ° C. </li><li> Usar um palito para transferir a quantidade correcta de pó de embrião (cerca de 5-10 mg) (Figura 2) a partir do tubo de amostra para um tubo de microcentrífuga de pré-marcado contendo a solução de NaOH 50 mM. </li><li> puxe up o mesmo palito lentamente para visualizar o lisado de ADN como um pegajoso, pegajosos, substância transparente semelhante branco (Figura 3). </li><li> Transferir os tubos de microcentrífuga com lisado de ADN para a incubadora pré-aquecido a 95 ° C durante cinco minutos. Transferir imediatamente o tubo a uma caixa de isopor cheia de gelo. </li><li> Adicionar 20 ul de Tris-HCl 1 directamente para dentro do tubo de microcentrífuga e misturá-lo batendo suavemente no tubo. Usar um papel de pH para assegurar que o pH é cerca de 8,0 (Figura 4) antes da centrifugação. Nota: Ao lidar com um grande número de preparações de amostra, é aceitável para escolher aleatoriamente algumas amostras para verificar o pH. </li><li> Centrifuga-se o tubo com o lisado de ADN a 2.000 xg numa microcentrífuga durante dois minutos à temperatura ambiente para remover os restos de tecido não dissolvido. </li><li> Transferir 150 ul do sobrenadante claro topo para um novo tubo ou placas de 96 poços. Nota: O lisado de ADN claro está pronto a ser usado como um modelo em computadorR reacção e é estável a 4 ° C durante duas semanas, ou pode ser mantida a -20 ° C durante um ano. </li></ol> Iniciadores de PCR específicos de sexo 4. Projeto <ol><li> Obter números de acesso para o sexo Porcina região determinante Y (SRY) (NM_214452.3) e e genes ligados ao X proteína dedo de zinco (ZFX) (XM_005673501.1) a partir do site NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov /. </li><li> Copiar e colar esses números de acesso NCBI para uma ferramenta de desenho de primers online. Nota: A melhor informação iniciadores incluindo o comprimento, Tm e% de GC, bem como o tamanho do produto de PCR (pb) será gerado no ecrã do computador (Figura 5). </li><li> Validar a especificidade destes iniciadores, utilizando o programa de nucleótidos BLAST (Blastn) contra a base de dados genómico porcino corrente 104 para garantir que estas sequências são apenas localizado no cromossoma X e Y para SRY e ZFX respectivamente (Figura 6). </li></ol> 5. Genomic DNA PCR Diretamente de DNA Lysates <ol><li> Usoapenas 1 ul de lisado de ADN como um molde para uma reacção de PCR de 15 uL. Nota: Um método de rastreio de alto rendimento para placas de 96 poços de PCR pode ser realizada de maneira semelhante, utilizando uma pipeta de canais múltiplos. </li><li> Faça o seguinte apenas para a primeira PCR: preparar um tubo de PCR para o controlo negativo sem modelo e dois tubos adicionais para os controlos positivos pela adição de 1 ul (0,5 ng) de ADN genómico porcino conhecida sexo obtidos comercialmente. Mais tarde, incluem uma amostra a partir da última análise sexagem sucesso como um controlo positivo e executado em conjunto com a nova reacção de PCR para a determinação do sexo. </li><li> Usar qualquer mistura pronta enzima PCR HotStart e preparar uma mistura principal por primers adição e nucleases água livre, dependendo do número total de reações de PCR. Adicionar 1 ml de lisado de ADN para um tubo de PCR pré-existente com 14 ul da mistura principal de PCR. Adicionar iniciadores de tal modo que a concentração final dos iniciadores de dois genes específicas do sexo é de 0,3 uM no total de 15 ul de PCR reaction. </li><li> Defina-se o seguinte programa de PCR num termociclador: 95 ° C durante 3 min, 35 ciclos cada uma com um passo de 20 seg de fusão 98 ° C, seguido por um passo de emparelhamento de 15 segundos a 65 ° C, seguido por um passo de alongamento de 15 seg a 72 ° C. Num passo final, incubar as reacções durante 1 min a 72 ° C e continuar a incubar a 4 ° C até à retirada do tubo de PCR por electroforese em gel de verificação para determinar o sexo. Nota: As condições de PCR e de optimização são de acordo com o manual do kit de PCR mencionado na Tabela Materiais. </li><li> Adicionar a quantidade adequada de mancha de gel de DNA não-tóxico verde- SYBR fluorescente quando se prepara um 2% gel de agarose TBE. Nota: O brometo de etídio pode ser substituído por mancha fluorescente estufa, se ele não está disponível. </li><li> Adicionar 1,5 uL de corante de carga (10x) para o tubo de PCR e misturar bem por pipetagem do tampão de reacção de PCR para cima e para baixo. </li><li> Carga de 10 ul de amostra para o poço e run gel de agarose com ajustes de tensão adequadas (aparelho de gel pequena a 100 V, aparelho de gel de 96 poços a 150 V até que a banda de corante é executado a meio caminho através do gel). </li><li> Observar e ajustar as intensidades de bandas sob a configuração de luz fluorescente usando um scanner a laser e capturar uma imagem do gel. Nota: Imager gel comum pode ser substituído para o gel com brometo de etídio. </li><li> Determinar o sexo dos embriões de suíno através da identificação de embriões com uma banda como uma fêmea e duas bandas como um macho (Figura 7). </li></ol>

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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+different+dietary+energy+sources+during+folliculardevelopment+on+subsequent+fertility+of+cyclic+gilts.">Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts.</a> Animal. 8, 293-299 (2014).</li><li>Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+programming+of+postnatal+development+in+the+pig.">Prenatal programming of postnatal development in the pig.</a> Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A maioria dos protocolos existentes relacionadas com DNA embriões digitação sexo suína só são adequados para fase inicial estágio de pré-implantação 15,16. Nós temos desenvolvido com sucesso um protocolo adequado para triagem de embriões suínos durante o final de gestação. Baseado em estudos com estágios de desenvolvimento semelhantes de embriões provenientes de estudos anteriores 6,18, o presente protocolo é considerado mais seguro e de baixo custo. E...

O porco doméstico tornou-se um tema de pesquisa fundamental no desenvolvimento, genética e nutrição em ambos os sectores humanas e animais. O potencial de porcos como modelo para a investigação biomédica humana pode ser atribuído às suas semelhanças fisiológicas. Na pecuária, a manipulação da proporção entre os sexos pode aumentar a eficácia dos programas de selecção e melhoramento genético 1. Sexagem de embriões individuais é uma ferramenta fundamental usada em muitas investigações experimentais, incluindo mas não limitado a genótipo, epigenética e X inactivação de dimorfismo sexual durante o desenvolvimento embrionário precoce 2. Estudos em camundongos sugerem que a dieta materna e outros fatores podem resultar em desequilíbrio entre os sexos 3. Em suínos, as causas do sexo rácio desequilíbrio incluem raça paterna 4, capacidade uterina 5, e estado metabólico da porca 6. Uma vez que as diferenças observadas em embriões e ninhadas pode ser influenciada por SExual dimorfismo, os pesquisadores devem estar cientes do sexo do embrião e relações sexuais antes de tirar conclusões sobre a sua pesquisa. O desenvolvimento de ferramentas e protocolos eficientes para a sexagem de embriões de suínos no dia 30 do desenvolvimento será discutido aqui. Vários métodos de tipagem sexo têm sido desenvolvidos para estudos genéticos em organismos modelo e gado. Particularmente na pecuária, a identificação de embriões masculinos e femininos é uma prática muito comum para melhorar a seleção genética para programas de melhoramento. Embriões precoces cariótipo no porco usando Giemsa 7 ou as intensa fluorescência 8,9 técnicas têm sido utilizadas para tipagem sexo. No entanto, estes métodos são demorados e não é adequado para o rastreio de grandes números de embriões com rapidez e precisão. O método sexo tipagem mais eficaz é a amplificação de DNA usando uma polimerase de ADN estável ao calor e um par de iniciadores. sexagem de DNA pelo método de PCR é mais específico, rápido e sensível, oomente requerendo uma pequena quantidade de materiais celulares. O primeiro sexagem de embriões com base em PCR foi realizado em seres humanos 10, e mais tarde nos ratos 11, 12 bovinos, búfalos, ovelhas 13 14 embriões pré-implantação. No porco, o método de tipagem de ADN mais rapidamente do sexo foi estabelecida para os embriões pré-implantação através de um único par de Y-chromosome iniciadores de ADN específica 15. No entanto, os iniciadores de PCR mais comuns para a determinação do sexo foram selecionados a partir do cromossomo Y do gene SRY específica do sexo masculino 16 e os não-sexo região discriminativo de um gene zinc-finger localizado na X e Y cromossomo 17. Subsequentemente, estes iniciadores foram utilizados para determinar o sexo dos embriões do dia 30 no estudo com uma melhor especificidade dos primers para detectar apenas o cromossoma X de um gene de dedo de zinco. O ADN genómico a partir de embriões pré-implantação de suíno pode ser extraído por exposição de um blastocisto intacto para tamponar com proteinase K 16 ou por tomar uma biópsia de algumas células da clivagem antecipada individual embriões 15 e usá-los para PCR direta. No entanto, a libertação de ADN a partir de sangue de porcino, cabelo, tecidos ou um grande conceptus ao longo de alguns centímetros de tamanho não é efectivamente feito usando o método de proteinase K. Métodos de extração de DNA para estes materiais foram estabelecidas usando ou demoradas protocolos de fenol / clorofórmio 6 ou kits baseados coluna caro 18. A fim de evitar o uso de produtos químicos potencialmente tóxicos, há uma tendência para o desenvolvimento de métodos de extracção de ADN de baixo custo, simples e livre de fenol. Este tipo de protocolo para o isolamento de ADN genómico por PCR qualidade do rato 19 e 20 de peixe-zebra tecidos foi estabelecida usando hidróxido de sódio quente e tris (HOTSHOT). Este estudo fornece um protocolo para obter DNA com pares de primers duplex modificados Hotshot e redesenhado para o sexo PCR digitando diretamente a partir de lisados ​​celulares de dia 30 embriões de suínos comalta precisão.

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&amp;nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig female and male genomic DNA</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 &amp;amp; GP-160-M5</td><td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 laser scanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>other imaging system can be used</td></tr><tr><td>Free Soft Nitrile Examination Gloves</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>any other examination glove can be used</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, solid&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>heat resistant</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>Use as a incubator for 95 &amp;#176;C , don&#039;t need to use the heater</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>Autoclaved before use each time.</td></tr></tbody></table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

A investigação sobre a programação pré-natal no porco mostrou que o sexo do embrião ou feto em desenvolvimento pode influenciar o resultado do desenvolvimento. Portanto, a capacidade de determinar o sexo de um embrião é necessário em muitas experiências particularmente em relação ao desenvolvimento precoce. O presente protocolo demonstra uma preparação de baixo custo, rápida e não-tóxico de ADN genómico de porco para uso com a PCR. Dia 30 embriões devem ser humanamente recolhido de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Política de animal Institucional e Comissões de bem-estar para o presente protocolo. A preparação de todo o embrião para esta técnica sexagem baseado na PCR envolve simplesmente moer o embrião congelado até um pó fino usando um almofariz pré-arrefecido e um pilão. ADN por PCR qualidade é libertado a partir de uma pequena quantidade de pó de embriões através da aplicação de uma incubação a quente em um reagente de lise alcalina. Em seguida, a solução de ADN é misturado com tampão de neutralização e utilizado directamente para PCR. Dois pares de iniciadores são gerados para detecdeterminado sexo t determinação região do cromossoma Y (SRY) e região ZFX do cromossoma X com alta precisão e especificidade. O mesmo protocolo pode ser aplicado a outros embriões alongados (dia 10 ao dia 14) anteriores ao Dia 30. Além disso, este protocolo pode ser realizada com placas 96-brotaram quando o rastreio de um grande número de embriões, tornando viável para automatização e de alta digitação sexo rendimento.

Um resultado representativo de determinação do sexo de 345 lisados ​​de ADN de rastreio por PCR é mostrado na Figura 7 e sumariados na Tabela 1. Como pode ser visto na Figura 7, a temperatura de iniciadores de recozimento a 65 ° C representa a condição óptima neste protocolo de PCR gerando intensidade semelhante e t...

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Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K visualizações.  University of Alberta. This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

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Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Biologia do Desenvolvimento

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genética

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to laboratories for studies to further our understanding of marine mammal reproduction. Heterologous IVF, a replacement for homologous IVF, could provide a means to test the sperm fertility potential; to study gamete physiology and early embryo development; and to avoid the use of valuable dolphin oocytes, which are difficult to obtain. Here, we present protocols that have been successfully used to collect and cryopreserve dolphin spermatozoa. The collection of semen is performed by manual stimulation on trained dolphins. Cryopreservation is accomplished using a TRIS egg-yolk based extender with glycerol. In addition, we present a protocol that describes heterologous IVF using dolphin spermatozoa and bovine oocytes and that verifies the hybrid nature of the resulting embryo using PCR. Heterologous fertilization raises questions on fertilization and can be used as a tool to study gamete physiology and early embryo development. In addition, the success of heterologous IVF demonstrates the potential of this technique to test dolphin sperm fertilizing capacity, which is worth further examination.

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Here, we present protocols that have been successfully used for dolphin spermatozoa collection, cryopreservation, and heterologous IVF performance using bovine oocytes.

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolha, criopreservação e heterólogo fertilização In Vitro

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage that forms the placenta. This method, however, requires specialized skills, is invasive, and suffers from false positives and negatives because the chromosome numbers in the TE and the inner cell mass (ICM), which develops into the fetus, are not always the same. NICS, a technology requiring sequencing of DNA that released into the culture medium from both TE and ICM, may offer a way out to these problems but has previously been shown to have limited efficacy. The present study reports the full protocol of NICS, which includes culture medium sampling methods, whole genome amplification (WGA) and library preparation, and NGS data analysis by analysis software. Considering the different cryopreservation times in different embryo laboratories, embryologists have two methods for collecting embryo culture medium that can be selected according to the actual conditions of the IVF laboratory.

The present study reports a protocol for chromosome screening of human embryos that uses spent culture medium, which avoids embryo biopsy and enables chromosome ploidy identification using NGS. The present article presents the detailed procedure, including the preparation of culture medium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) library preparation, and data analysis.

Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Isolamento e genotipagem de embrião de camundongo gastrulado para sequenciamento de célula única

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autor em destaque: um pipeline para analisar embriões mutantes específicos da linhagem em resolução de célula única

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Resumo

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Sequenciamento de RNA de célula única de embriões de camundongos inteiros mutantes: do epiblasto ao fim da gastrulação

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