Este método poderia verificar RNAs de guia em embriões, testar questões de desenvolvimento precoce ou criar camundongos editados. Quaisquer avanços no CRISPR Cas9 poderiam ser usados com este método. A principal vantagem deste método é que é fácil de aprender e usa reagentes que estão disponíveis para laboratórios que têm acesso a camundongos.
No futuro, esta técnica seria útil para corrigir uma doença ou mutação na prole de um animal de companhia ou animal importante para a agricultura. Esse método é mais adequado para gerar modelos de mouse. Em nosso laboratório, temos usado variações desse método para investigar os eventos que envolvem a fertilização e o desenvolvimento precoce da pré-implantação, especificamente, a regulação gênica na potência embrionária.
A parte mais desafiadora é usar a agulha de vidro para mover embriões de placa para placa. Demonstrando este procedimento será Chantal Diallo, uma especialista em pesquisa no meu laboratório. Para iniciar a coleta e o processamento do embrião, coloque a rata eutanasiada de costas e borrife etanol a 70% no abdômen para ser aberto cirurgicamente.
Para abrir a cavidade abdominal e remover os ovidutos, corte a camada da pele com uma tesoura cirúrgica e localize os ovários. Em seguida, remova cirurgicamente ambos os ovidutos, localizados proximais aos ovários, e coloque-os em gotículas individuais de 50 microlitros de M2 mais BSA médio. Sob um microscópio estéreo, use pinças de dissecção para cortar a ampola do oviduto para liberar os complexos cumulus-ovócitos, ou COCs, contendo oócitos, em seguida, para evitar o transporte de detritos, transfira e combine cada cumulus-ovócito para uma única gota de 50 microlitros de M2 mais BSA com uma pipeta manipulada ajustada para 20 a 30 microlitros.
Em seguida, para remover as células cumulus dos zigotos, transfira COCs com um pouco de meio extra para uma gota de 100 microlitros M2 mais hialuronidase e misture suavemente por pipetagem até que os embriões estejam visivelmente separados das células cumulus muito menores. Para diluir a hialuronidase e eliminar as células cumulus soltas, use uma pipeta operada pela boca para mover os zigotos para uma gota fresca de 50 microlitros M2 mais BSA. Em seguida, para corroer a zona pelúcida do embrião e reduzir os obstáculos físicos adicionais para a entrega de reagentes, transfira os embriões para uma gota pré-aquecida de 100 microlitros de Tyrode, ou solução AT, em uma placa de 60 milímetros.
Observe continuamente os zigotos sob um microscópio estéreo até que 30% da zona pelúcida seja erodida e, em seguida, para diluir o AT, passe os embriões através de quatro gotículas de 50 microlitros de M2 mais BSA. Em seguida, determine um número apropriado de embriões que foram processados, contando-os sob o microscópio estéreo. Diluir a BSA passando os embriões através de duas gotículas de 50 microlitros de meio sérico reduzido.
Em seguida, pipete bucal de 25 a 30 embriões em uma gota de 10 microlitros de meio sérico reduzido e, em seguida, use uma pipeta portátil para adicionar 10 microlitros do complexo ribonucleoproteína ou RNP. Diluir o glicerol viscoso do complexo RNP e homogeneizar a amostra pipetando 10 vezes ou até que a mistura não apresente mais viscosidade. Em seguida, pipete 20 microlitros de embrião e mistura de RNP em uma cubeta de eletroporação de 0,1 centímetro, evitando bolhas, em seguida, para entregar os reagentes de edição no zigoto, eletroporate os embriões usando um protocolo de onda quadrada de 30 volts, 4 a 6 pulsos com 3 milissegundos de comprimento de pulso e intervalos de pulso de 100.
Em seguida, adicione 50 microlitros de M2 mais BSA no topo da cubeta para lavar os embriões da cubeta e pipetar suavemente essa mistura para um prato. Para a cultura de embriões, transfira 20 a 30 zigotos para uma gota de KSOM mais BSA em uma placa de cultura pré-equilibrada e mova os embriões para a gotícula. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono com 95% de umidade.
No dia seguinte, transfira apenas embriões de duas células para uma nova gota de mistura de KSOM mais BSA e devolva a placa à incubadora. Deixe ou descarte os embriões mortos ou não fertilizados. Antes da genotipagem, lave os embriões de blastocisto de mórula com duas gotas de DPBS para diluir os componentes do meio que possam interferir com uma reação de PCR.
Usando uma pipeta bucal, transfira embriões individuais para um poço de uma tira de PCR de 8 poços e adicione 10 microlitros de tampão de lise. Em seguida, para lisar os embriões, programe um termociclador a 55 graus Celsius por 4 horas, depois inative a proteinase K com uma incubação de 10 minutos a 95 graus Celsius. Neste estudo, um exemplo de estratégia para atingir o locus tirosinase de camundongo como um controle positivo, incluindo desenhos de oligo e estratégias de genotipagem para junção final não homóloga e reparo direcionado por homologia são mostrados.
Ao entregar um único guia, ou sgRNA, a entrega de RNPs foi de até e incluindo 100% nas linhagens de camundongos C57 preto 6J e C57 preto 6N com formação de deleções de inserção ocorrendo em 50 a 100% e pequenas substituições oligo-baseadas variando de 17 a 63%Ao projetar deleções genômicas, a eficácia da edição varia de 3% a 100%O embrião deve ser mantido o mais próximo possível das condições ideais, de modo que quanto mais rápido o protocolo é feito, melhor. Além disso, minimizar a exposição à hialuronidase e Tyrode's ácidos. Este método descreve a geração de um animal editado, o teste de implantação ou viabilidade gestacional, ou a realização do experimento várias vezes para coletar medições ou imagens e várias métricas durante o desenvolvimento pré-plantação.
