アルバータ州畜産食肉エージェンシー株式会社、豚肉CRC、アルバータ州の豚肉、Hypor Aヘンドリックス遺伝当社及びNSERC CRSNG：著者は協力し、以下の研究助成機関の財政的貢献を感謝したいです。

動物実験のガイドラインにカナダの評議会によると、および学部アニマル政策と福祉委員会の承認を得て - ア​​ルバータ大学の家畜、妊娠中の雌豚は、妊娠と胚の30を回収した約デーで訓練を受けたスタッフにより安楽死させました。手順の間にすべての回で検査用手袋を使用してください。 1.サンプル収集およびサンプル保管<ol><li>放血に続いてキャプティブボルトを使用して雌豚を安楽死させます。各安楽死させた雌ブタから生殖器および胚を収集するために、検査用手袋を着用してください。 注：氷や液体窒素を乾燥させるサンプルと移植胚の急速なコレクションは、マイクロアレイや定量PCRなどの他の分子作品のための高品質の組織になります。 </li><li>子宮を解剖し、静かに、基礎となる子宮壁21から自分の胚体外胎盤膜内のすべての胚を分離します。何の母体組織の汚染がないことを確認してください。 </li><li>リ凍結前に、すべての実行可能な胚のコードの長さと重さ。 </li><li>各個々の胚を収集し、すぐにスナップを液体窒素で凍結する前に、アルミホイルでそれを包みます。 </li><li>直接-80℃の冷凍庫に液体窒素から凍結した胚を移します。 </li></ol> 2.研削胚<ol><li>分析されるサンプルの数に必要な検体IDと全てのサンプル試験管（15ml）にラベル。 </li><li>半分にドライアイスと熱的にコンテナを記入し、ドライアイスで予め標識試料管を挿入します。 </li><li>ドライアイスの容器に℃の冷凍庫-80からあらかじめ冷却モルタルおよび乳棒を転送するために上に検査用手袋の別のペアで冬の手袋を着用してください。 </li><li>ドライアイス上のモルタルの内側に凍結した胚を置きます。 </li><li>胚をカバーし、微粉末に乳棒でそれを粉砕するのに十分な液体窒素を注ぎます。 </li><li> MICRで予め標識したサンプル管に胚の粉末を移しますospatula（ 図1）し、-80℃の冷凍庫にチューブを配置します。 </li><li>各胚のためのクリーンあらかじめ冷却し、乳鉢と乳棒を使用して、サンプル間の交差汚染を避けるために、各胚を研削した後、検査用手袋を変更します。 </li></ol>変更された水酸化ナトリウム法を用い3.ゲノムDNAの準備<ol><li>サンプルの数のために必要なラベル全て微小遠心管（1.5ml）を分析します。 </li><li>前の出発にドライアイスの入った容器にから胚粉末を含むサンプルチューブ-80℃の冷凍庫を転送します。 </li><li>各前標識されたマイクロ遠心チューブに50mMのNaOHで（水酸化ナトリウム）の180μLをピペット。 </li><li> 95℃までインキュベーターと予熱をオンにします。 </li><li> 50mMのNaOH溶液を含む前標識されたマイクロチューブにサンプル管から胚粉末の正確な量（約5〜10 mg）を（ 図2）を転送するためにつまようじを使用してください。 </li><li> Uを引いゆっくりと粘着性、ねばねば、白い透明状物質（ 図3）のようにDNA溶解液を可視化するPと同じつまようじ。 </li><li> 5分間95℃で予備加熱したインキュベーターにDNA溶解液でマイクロ遠心チューブを転送します。直ちに氷で満たされた発泡スチロールの箱にチューブを移します。 </li><li>直接マイクロ遠心チューブに1 Mトリス塩酸の20μLを加え、穏やかにチューブをタップして、それを混ぜます。 pHは遠心分離前に約8.0（ 図4）であることを確認するためにpH試験紙を使用してください。 注：サンプル調製の多数を扱う場合には、ランダムにpH値を確認するために、いくつかのサンプルを選択するために許容可能です。 </li><li>未溶解組織片を除去するために、室温で2分間微量で2000×gでDNA溶解液でチューブを遠心。 </li><li>新しいチューブまたは96ウェルプレートにトップ透明な上澄み150μlのを転送します。 注意：明確なDNA溶解液は、PC内のテンプレートとして使用する準備ができていますRの反応、それは2週間、4℃で安定である、またはそれは年間-20℃で保存することができます。 </li></ol> 4.デザインセックス特異的PCRプライマー<ol><li> NCBIウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.govからブタ性別決定領域Y（SRY）のためのアクセッション番号（NM_214452.3）と、亜鉛フィンガータンパク質のX連鎖（ZFX）遺伝子（XM_005673501.1）を取得/。 </li><li>コピーし、オンラインプライマー設計ツールにこれらのNCBIアクセッション番号を貼り付けます。 注：長さを含む最高のプライマー情報、TmとGC％だけでなく、PCR産物のサイズ（bp）が、コンピュータの画面（ 図5）で生成されます。 </li><li>これらの配列のみをそれぞれSRYとZFX（ 図6）のために、XとY染色体上に位置していることを確認するために、現在のブタゲノムデータベース104に対してヌクレオチドBLASTプログラム（BLASTN）を使用して、これらのプライマーの特異性を検証します。 </li></ol>直接DNA溶解物から5.ゲノムDNAをPCR <ol><li>使用15μlのPCR反応の鋳型としてDNAの溶解物のみ1μlの。 注：96ウェルプレートPCRのためのハイスループットスクリーニング方法は、マルチチャンネルピペットを用いて同様に行うことができます。 </li><li>ちょうど最初のPCRのために次の操作を行います。商業的に入手知らセックスブタのゲノムDNAの1μL（0.5 ngの）を追加することにより、鋳型なしの陰性対照および陽性対照用の2つの追加のチューブのための1つのPCRチューブを準備します。その後、ポジティブコントロールとして最後に成功した雌雄鑑別分析からサンプルを含み、セックス決意のための新たなPCR反応と一緒に実行されます。 </li><li>任意のHotStartの準備ができてミックスPCR酵素を使用して、PCR反応の合計数に応じてプライマーおよびヌクレアーゼフリー水を添加することにより、マスターミックスを準備します。 PCRマスターミックスの14μlの既存のPCRチューブにDNA溶解液を1μlを追加します。 2性別特異的遺伝子からプライマーの最終濃度は15μlのPCR Rの合計で0.3μMであるようにプライマーを追加します。eaction。 </li><li>サーマルサイクラーで、以下のPCRプログラムをセットアップします：3分、95℃35サイクル15秒の伸長工程に続いて65℃で15秒のアニーリングステップに続いて20秒の溶融工程98°C、各72℃。最後のステップにおいて、72℃で1分間、反応をインキュベートし、性別を決定するために、ゲル電気泳動の検証のためのPCRチューブを除去するまで4℃でインキュベートし続けます。 注：PCR条件および最適化は、 材料表に記載されたPCRキットのマニュアルに従ってあります。 </li><li> 2％TBEアガロースゲルを調製する場合、非毒性緑蛍光SYBR DNAゲル染色の適切な量を追加します。 注：それは利用できない場合エチジウムブロマイドは、緑色蛍光染色のために置換することができます。 </li><li> PCRチューブにローディング色素（10倍）の1.5μlを添加して、PCR反応緩衝液アップダウンをピペッティングしてよく混ぜます。 </li><li>ウェルおよびRへの試料の負荷を10μl（染料バンドがゲルを通って途中で実行されるまで、小さなゲル装置100 V、150 Vで96ウェルのゲル装置で）適切な電圧設定で未アガロースゲル。 </li><li>観察し、レーザースキャナを用いて蛍光灯の設定の下でバンド強度を調整し、ゲルの画像を取り込みます。注意：一般的なゲルイメージャは、エチジウムブロマイドゲルの代わりに用いることができます。 </li><li>女性としての一つのバンドと男性のような2つのバンド（ 図7）で胚を識別することにより、ブタ胚の性別を決定します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ブタ胚のDNAセックスタイピングに関連する既存のプロトコルのほとんどは早期着床前段階15,16に適しています。我々が正常に妊娠後期の間、ブタ胚のスクリーニングに適したプロトコルを開発しました。以前の研究6,18からの胚の同様の発達段階での研究に基づき、本プロトコルは、安全で低コストであると考えられています。 このプロトコルは、96ウェ?...

家畜ブタはヒトおよび家畜の分野での開発、遺伝学や栄養学の基本的な研究テーマとなっています。人間の研究のための生物医学モデルとして豚の電位は、それらの生理学的類似性に起因することができます。家畜では、性比の操作は、選択と遺伝的改良プログラム1の有効性を高めることができます。個々の胚を雌雄鑑別することは、遺伝子型、エピジェネティクスと初期胚の発育2時の性的二型のX不活性化を含むがこれらに限定されない多くの実験的調査に使用される基本的なツールです。 マウスでの研究は、母体の食事やその他の要因は男女の不均衡3をもたらし得ることを示唆しています。豚では、男女比の不均衡の原因は父方の品種4、子宮容量5と、母豚の代謝条件6が含まれます 。胚および同腹仔で観察された差異は、それ自体によって影響され得るのでxual二形は、研究者が自分の研究に関する結論を描画する前に胚のセックスと性比に注意する必要があります。開発の30日目にブタの胚を雌雄鑑別するための効率的なツールやプロトコルの開発は、ここで議論されます。 セックスタイピングの様々な方法がモデル生物と家畜の遺伝的研究のために開発されてきました。特に家畜で、男性と女性の初期胚を識別することは繁殖プログラムのための遺伝子選択性を高めるために非常に一般的です。ギムザ7または8,9の技術はセックスタイピングのために使用されている強い蛍光を使用して、ブタにおける初期胚の染色体分析。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、迅速かつ正確に胚の多数をスクリーニングするには適していません。 最も効果的な性別のタイピング方法は、熱安定性DNAポリメラーゼおよびプライマーの対を用いてDNAの増幅です。 PCR法によるDNAの雌雄鑑別は、o-、より、具体的な迅速かつ高感度でありますNLY細胞物質の微量を必要とします。最初のPCRベースの胚性判別は、ヒト10、およびそれ以降のマウスでは11、牛12、水牛13と羊14着床前胚で実施しました。豚では、最古のDNAのセックスタイピング法は、Y染色体特異的なDNAプライマー15の単一の対を介して着床前胚のために設立されました。しかし、性別決意のための最も一般的なPCRプライマーは、雄特異的なSRY遺伝子16とXとY染色体17の両方に位置するジンクフィンガー遺伝子の非性別判別領域のY染色体から選択しました。その後、これらのプライマーは、ジンクフィンガー遺伝子の唯一のX-染色体を検出するためのプライマーの改善された特異性を持つこの研究で30日目の胚の性別を決定するために適用されてきました。 ブタ着床前胚からのゲノムDNAをproteinasでバッファする無傷の胚盤胞を露出することによって抽出することができますE K 16または15個々の初期卵割胚から少数の細胞の生検を取り、直接PCRのためにそれらを使用します。しかし、大きさが数センチメートル以上ブタ血液、毛髪、組織または大受胎からのDNAの放出を効果的にプロテイナーゼK法を使用して行われていません。これらの材料のためのDNAの抽出方法は、時間がかかり、フェノール/クロロホルムプロトコル6または高価な列ベースのキット18のいずれかを使用して確立されています。潜在的に有害な化学物質の使用を回避するために、安価で、簡単で、フェノールを含まないDNA抽出方法を開発する傾向があります。マウス19およびゼブラフィッシュ20組織からのPCR品質のゲノムDNAを単離するためのプロトコルのこのタイプのホット水酸化ナトリウム及びトリス（ホットショット）を使用して確立されています。本研究では、変更された名手でDNAを得るためのプロトコルを提供し、日の細胞溶解物から直接で30ブタ胚を入力してPCRのセックス二重のプライマー対を再設計しました高精度。

<table><tbody><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit&amp;nbsp;</td><td>KAPABiosystems</td><td>KR0370</td><td>other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S33102</td><td>Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe</td></tr><tr><td>Pig female and male genomic DNA</td><td>Zyagen</td><td>GP-160-F1 &amp;amp; GP-160-M5</td><td>Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9500 laser scanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9969-43</td><td>other imaging system can be used</td></tr><tr><td>Free Soft Nitrile Examination Gloves</td><td>WWR</td><td>89038-270</td><td>any other examination glove can be used</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide, solid&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 359 -212</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorff</td><td>0030 108.051</td><td>heat resistant</td></tr><tr><td>ThermoStat plus</td><td>Eppendorff</td><td>22670204</td><td>Use as a incubator for 95 &amp;#176;C , don&#039;t need to use the heater</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Bunzl Plc</td><td>75200815</td><td>Any round wooden toothpicks can be used - quality wood</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R/5417C</td><td>Eppendorff</td><td>22621807</td><td>This model was discontinued. But another newer model can be used</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher</td><td>SDI28540115</td><td>Autoclaved before use each time.</td></tr></tbody></table>

accurate and phenol free dna sexing of day 30 porcine embryos by pcr

豚における出生前のプログラミングの研究は、胚または胎児の性別が発達アウトカムに影響を与えることができることを示しています。したがって、胚の性別を決定する能力は、特に初期の開発に関する多くの実験に必要です。本プロトコルは、PCRで使用するための豚ゲノムDNAの、安価で迅速かつ非毒性の製造を示します。 30日目の胚は、人道的に存在するプロトコルのために施設内動物政策と福祉委員会によって確立されたガイドラインに従って収集されなければなりません。このPCRベースの雌雄鑑別技術のための全胚の作成は、単純にあらかじめ冷却し、乳鉢と乳棒を用いて微細な粉末に凍結した胚を粉砕することを含みます。 PCR品質のDNAをアルカリ溶解試薬ホットインキュベーションを適用することによって、胚の粉末の少量から放出されます。次に、DNA溶液を中和緩衝液と混合し、PCRに直接使用しました。二つのプライマー対はdetecに生成されます高精度と特異性を有するX-染色体のY-染色体（SRY）とZFX領域の領域を決定トン特定セックス。同じプロトコルをまた、30日目より前の他の細長い胚（14日目まで10日目）に適用することができ、胚の多数をスクリーニングする自動化が可能作り、高場合、このプロトコルは、96 welledプレートで実施することができますスループットセックスタイピング。

PCRによって345 DNA溶解物スクリーニングから性別決意の代表的結果を図7 に示し、表1に要約します。 図7に見られるように、65℃でのプライマーアニーリング温度が異なるサンプル間で同様の強度及び述語アンプリコンサイズ（ 図5）を生成する ?...

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Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

PCRによる日30ブタ胚の正確かつフェノールフリーDNA雌雄鑑別

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

accurate-and-phenol-free-dna-sexing-of-day-30-porcine-embryos-by-pcr

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K ビュー.  University of Alberta. This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

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Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

発生生物学

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

のトランスクリプトームプロファイリング<em&gt;生体内で</em二色マイクロアレイプラットフォームを使用&gt;産ウシ着床前の胚

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

遺伝学

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to laboratories for studies to further our understanding of marine mammal reproduction. Heterologous IVF, a replacement for homologous IVF, could provide a means to test the sperm fertility potential; to study gamete physiology and early embryo development; and to avoid the use of valuable dolphin oocytes, which are difficult to obtain. Here, we present protocols that have been successfully used to collect and cryopreserve dolphin spermatozoa. The collection of semen is performed by manual stimulation on trained dolphins. Cryopreservation is accomplished using a TRIS egg-yolk based extender with glycerol. In addition, we present a protocol that describes heterologous IVF using dolphin spermatozoa and bovine oocytes and that verifies the hybrid nature of the resulting embryo using PCR. Heterologous fertilization raises questions on fertilization and can be used as a tool to study gamete physiology and early embryo development. In addition, the success of heterologous IVF demonstrates the potential of this technique to test dolphin sperm fertilizing capacity, which is worth further examination.

Bottlenose Dolphin Tursiops truncatus Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

Here, we present protocols that have been successfully used for dolphin spermatozoa collection, cryopreservation, and heterologous IVF performance using bovine oocytes.

バンドウイルカ イルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage that forms the placenta. This method, however, requires specialized skills, is invasive, and suffers from false positives and negatives because the chromosome numbers in the TE and the inner cell mass (ICM), which develops into the fetus, are not always the same. NICS, a technology requiring sequencing of DNA that released into the culture medium from both TE and ICM, may offer a way out to these problems but has previously been shown to have limited efficacy. The present study reports the full protocol of NICS, which includes culture medium sampling methods, whole genome amplification (WGA) and library preparation, and NGS data analysis by analysis software. Considering the different cryopreservation times in different embryo laboratories, embryologists have two methods for collecting embryo culture medium that can be selected according to the actual conditions of the IVF laboratory.

The present study reports a protocol for chromosome screening of human embryos that uses spent culture medium, which avoids embryo biopsy and enables chromosome ploidy identification using NGS. The present article presents the detailed procedure, including the preparation of culture medium, whole genome amplification (WGA), next-generation sequencing (NGS) library preparation, and data analysis.

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析

In clinical in vitro fertilization (IVF), the prevailing method for PGT-A requires biopsy of a few cells from the trophectoderm (TE). This is the lineage ...

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal experiments. When generating animal models, the electroporation of zygotes offers higher efficiency, simplicity, cost, and throughput as an alternative to the gold standard method of microinjection. Electroporation is also gentler, with higher viability, and reliably delivers Cas9/single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) into the zygotes of common laboratory mouse strains (e.g., C57BL/6J and C57BL/6N) that approaches 100% delivery efficiency. This technique enables insertion/deletion (indels) mutations, point mutations, the deletion of whole genes or exons, and small insertions in the range of 100-200 bp to insert LoxP or short tags like FLAG, HA, or V5. While constantly being improved, here we present the current state of CRISPR-EZ in a protocol that includes sgRNA production through in vitro transcription, embryo processing, RNP assembly, electroporation, and the genotyping of preimplantation embryos. A graduate-level researcher with minimal experience manipulating embryos can obtain genetically edited embryos in less than 1 week using this protocol. Here, we offer a straightforward, low-cost, efficient, high-capacity method that could be used with mouse embryos.

Here, we describe a simple technique intended for the efficient generation of genetically modified mice called CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). This method delivers editing reagents by electroporation into embryos at an efficiency approaching 100%. This protocol is effective for point mutations, small genomic insertions, and deletions in mammalian embryos.

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

シングルセルシーケンシングのためのGastrulating Mouse Embryoの単離とジェノタイピング

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

著者スポットライト:系統特異的変異胚をシングルセル分解能で解析するパイプライン

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

PCRによる日30ブタ胚の正確かつフェノールフリーDNA雌雄鑑別

要約

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マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

のトランスクリプトームプロファイリング

ハイスループット DNA の抽出およびフィンクリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

バンドウイルカイルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

PCRによる日30ブタ胚の正確かつフェノールフリーDNA雌雄鑑別

要約

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マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

のトランスクリプトームプロファイリング

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

バンドウイルカ イルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析

接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

ハイスループット DNA の抽出およびフィンクリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

バンドウイルカイルカ (バンドウイルカ) 精子: 異種には体外受精、凍結保存、コレクション